小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

要約

このプロトコルは、神経科学および神経薬理学研究のインビトロモデルとして使用される初代ニューロン培養物である培養小脳顆粒ニューロンにおけるフルオレセインジアセテート（FDA）およびヨウ化プロピジウム（PI）二重染色を使用してニューロン生存度を正確に測定する方法を記載する。

要約

一次培養小脳顆粒ニューロン（CGN）は、神経科学および神経薬理学研究におけるインビトロモデルとして広く使用されている。しかし、CGN培養におけるグリア細胞とニューロンの共存は、ニューロン生存率の正確な評価において偏りを引き起こす可能性がある。生きた細胞と死んだ細胞を同時に評価することにより、細胞の生存率を測定するために、フルオレセインジアセテート（FDA）およびヨウ化プロピジウム（PI）の二重染色が用いられてきた。我々は、比色アッセイの感度を改善し、CGNにおけるニューロン生存度を評価するために、FDA-PI二重染色を使用した。さらに、精度を向上させるため青色蛍光DNA染色剤（Hoechstなど）を追加しました。このプロトコルは、CGN培養においてこれらの方法を使用することによって、ニューロン生存度の評価の精度を改善する方法を記載する。このプロトコルを使用して、グリア細胞の数は、蛍光顕微鏡を使用することによって除外することができます。同様の戦略を適用して、望ましくないgli例えば、一次皮質培養および海馬培養のような種々の混合細胞培養物中のニューロンから得た。

概要

3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイなどの比色細胞毒性アッセイは、インビトロで細胞生存度を測定するために一般的に使用される。ラット由来の初代培養小脳顆粒ニューロン（CGN）は、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン、過酸化水素、グルタミン酸塩などの様々な神経毒に感受性である1,2。したがって、CGN培養物は、神経科学の分野におけるインビトロモデルとして使用することができる。 CGN培養物は、CGN培養物中の全細胞の約1％を占めることができるニューロンおよびグリア細胞を含む種々の細胞を含み得る。しかし、グリア細胞は、ニューロンと比較して神経毒とは異なる応答を示し、比色アッセイによって測定されたニューロン生存率の偏りをもたらす³ 。

生存細胞では、フルオレセインジアセテート（FDA）はエステラーゼによってフルオレセインに変換することができる。ヨウ化プロピジウム（PI）は、死んだ細胞に浸透した後にDNAと相互作用することができ、培養内のアポトーシスを示すために使用することができる。したがって、FDA-PI二重染色は、生存細胞および死細胞を同時に評価することができ、両方の比色法を組み合わせることにより細胞生存率をより正確に測定できることを示唆している。さらに、核の青色蛍光染色であるHoechstを添加することにより、細胞生存率の精度をさらに向上させることができた。ここに提示されたプロトコールは、初代培養CGNにおけるニューロン生存度を正確に分析するために使用できるFDA-PI二重染色およびFDA-PI-Hoechst三重染色を記載する。

このプロトコールは、CGNおよびグリア細胞を異なる大きさおよび形状で視覚化および区別することを利用する。染色後、生存可能なニューロンおよび死んだニューロンの数を、蛍光顕微鏡で撮影した代表的な画像から数えた。大型グリア細胞は、典型的なCGNsの比較によって排除される蛍光モードの下で位相差モードで撮影されたものである。同様の戦略を実施して、一次皮質培養および海馬培養などのニューロンおよびグリア細胞を含む混合細胞培養物におけるニューロン生存度を測定することができる。

プロトコル

すべての手技は、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所（NIH）のガイドライン（NIH Publications No. 80-23、1996年改訂）に準拠し、寧波大学の動物実験および使用委員会（IACUC） SYXK-2008-0110）。

1.溶液および培養培地の調製

注：試薬およびストックは無菌条件下で調製する必要があります。孔径0.22μmのフィルターでろ過して滅菌します。

1. 10mgの二重蒸留水（ddH ₂ O）に5mgのPLLを添加することによってポリ-L-リジン（PLL）ストック溶液を調製する。ろ過して滅菌する。分注し、数ヶ月間、-20℃でPLL原液を保存します。
2. Krebs緩衝液を、100mLのNaCl、0.4gのKCl、0.14gのNaH ₂ PO 4、2.6gのD-グルコース、および5.94gの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸を添加することによって調製する。 ddH _{2 <}/ sub> O。ろ過して滅菌する。 Krebs緩衝溶液を4℃で1ヶ月間保存する。
3. 3.82gのMg ₂ SO ₄を100mLのddH ₂ Oに加えて、3.82％のMg ₂ SO ₄溶液を調製する。濾過により滅菌する。 Mg ₂ SO ₄溶液は4℃で数ヶ月保管してください。
4. CaCl ₂ 1.2gを100mLのddH ₂ Oに加えて1.2％CaCl ₂溶液を調製する。濾過により滅菌する。 CaCl ₂溶液は4℃で数ヶ月保管してください。
5. 100mLのddH ₂ Oに15gのKClを添加して2M KCl溶液を調製する。ろ過により滅菌する。 KCl溶液は4℃で数ヶ月保管してください。
6. 100mlのddH ₂ Oに1.8gのD-グルコースを加えてD-グルコース原液を調製する。ろ過により滅菌する。 D-グルコース溶液を4℃で1ヵ月間まで分注して保存します。
7. シトシンβ-D-アラビノフラノシド（Ara-C）ストック溶液を調製する10mLのddH ₂ Oに0.24gのAra-Cを添加することによって、イオンを除去する。ろ過によって滅菌する。 Ara-Cストック溶液を4℃で数ヶ月間分割して保存します。
8. Basal Medium Eagle（BME）中の胎児ウシ血清（FBS）25mL、100xグルタミン2.5mL、2M KCl溶液2.78mL、および100x抗生物質2.5mLを使用して、250mLの培地（25〜30匹用） 。容量を250mLに調整し、濾過して滅菌する。
9. 2.5倍の100倍グルタミン、2.78倍の2M KCl溶液、および2.5倍の100倍抗生物質を使用して25K培地をBME中で調製する。容量を250mLに調整し、濾過して滅菌する。
10. BME中の100xグルタミン2.5mLおよび100X抗生物質2.5mLを使用して5K培地を調製する。容量を250mLに調整し、濾過して滅菌する。
    注：培地、25K培地、5K培地は新しく調製する必要があります
11. 1mLのアセトンに5mgのFDAを加えることによってFDA原液を調製する。長期保管のためにFDA原液を4℃で保存する
12. PIストック溶液を、1mgのPIを1mLのddH ₂ Oに加えることによって調製する。PIストック溶液を4℃で数ヶ月間保存する。
13. 1mLのddH ₂ Oに5mgのHoechst 33342を添加してHoechst原液を調製する.Hoechst原液を4℃で数ヶ月保管する。

2.解剖ソリューションの準備

注：解剖の前にこれを1回行います。

1. 15mLのクレブス緩衝液、3.82％Mg ₂ SO ₄溶液1.2mL、およびウシ血清アルブミン（BSA）0.45gを150mLのddH ₂ Oに加えることによって、解剖溶液を調製する。NaOHを用いてpHを7.4に調整する。
2. 次のように5 x 50 mLチューブにラベルを付けます：1,2,3,4,5。
3. フィルター付きの50 mLシリンジに40 mLの解液を入れます。チューブ1に解剖溶液30mLを、組織を処理するために使用されるいくつかの35mm細胞培養皿にそれぞれ2mLをろ過する。
4. 〜にube 2、50 mLの解液で12.5 mgのトリプシンを加えます。ボルテックスで完全に混合する。ろ過して滅菌する。
5. チューブ3に、解剖溶液15mL中に1.2mgのDNAseI、7.8mgの大豆トリプシンインヒビター、および150μLの3.82％Mg ₂ SO ₄溶液を加える。ボルテックスで完全に混合する。ろ過して滅菌する。
6. チューブ4に、チューブ3からの溶液5mLを加える。解凍溶液10.5mLを加える。ろ過して滅菌する。
7. チューブ5に、解液12.5mL中3.82％Mg ₂ SO ₄溶液100μLと1.2％CaCl ₂溶液15μLを加える。ボルテックスで完全に混合する。ろ過して滅菌する。
8. すべてのチューブを使用前に4℃で保存する。

3.細胞培養プレートのコーティング

注：解剖の前にこれを1回行います。

1. 100mLのddH ₂ O（終濃度5μg/ mL）に1mLのPLL原液を加える。コートプラスチック5μg/ mLのポリ-L-リシン溶液を添加することにより、6ウェルまたは12ウェル細胞培養プレート（6ウェル細胞培養プレートについてはウェルあたり2mL、または12ウェル細胞培養プレートについてはウェルあたり1mL）
2. 室温で1日間インキュベートする（または37℃で2時間）。解剖の1-2時間前に、ピペットを使用して溶液を除去する。 ddH ₂ Oで1回洗浄し、細胞培養フードで乾燥させる。

4. 8日齢のSprague-Dawleyラットの組織の処理。

1. 100 mmの皿を氷上に置く。滅菌したはさみを使用して、ラットの仔犬を皿に垂れ下がらせます。
2. はさみを大穴マグナムに挿入し、耳から目にかけて頭蓋骨の両側を切断します。一対の鉗子を使って頭蓋骨を持ち上げます。脳全体が頭蓋骨にあることを確認してください。小脳を分離し、一対の鉗子を用いて上記の35mmディッシュに入れる。
3. 解剖顕微鏡下で作業する。 2組の鉗子で髄膜と血管を除去する。
4. ブレードで組織を切り刻む。組織をチューブ1に入れる。室温で5分間遠心分離し、1,500 x g。
5. 上清を吸引する。ペレットを保存します。
6. チューブ2の溶液をペレットに加える。静かに振って再懸濁する。
7. チューブを37℃の水浴に15分間入れます。 3分ごとに静かに振る。
8. チューブ4の溶液をこの溶液に加える。振盪し、室温で5分間遠心分離し、1,500×g。
9. 上清を吸引する。ペレットを保存します。
10. チューブ3に溶液を加えてペレットを再懸濁する。
11. 2つの15mLチューブを準備する。各チューブに細胞の半分を置きます。綿栓をしたパスツールピペットを使用して60-70倍上下にピペットで細胞をホモジナイズします。
12. チューブ5の溶液3 mLを各15 mLチューブに加えます。室温で10分間放置し、上清を綿栓したパスツールピペットで注意深く除去する。上清を新しい15 mLチューブに入れ、RTおよび1,500 x gで5分間遠心分離します。
13. A上清をスピンさせる。ペレットを保存します。
14. 培養培地をペレットに加えて、約1.5×10 ⁶細胞/ mL（10匹につき約100mL）の細胞密度を得る。
15. 細胞を培養プレートに入れ、インキュベーター内で37℃、5％CO _2で培養する。

5.培養中のAra-CおよびD-グルコースの添加

1. 24時間後、グリア細胞の増殖を抑制するために、Ara-Cストック溶液（12ウェル細胞培養プレートについては10μL/ウェル、または6ウェル細胞培養プレートについては20μL/ウェル;最終濃度：1mM）を添加する。
2. 7日目に、最終濃度が1mMになるように、12ウェル細胞培養プレートに対して50μLのD-グルコースストック溶液または6ウェル細胞培養プレートについてウェルあたり100μLを添加する。

6.CDA培養におけるFDA-PI二重染色およびFDA-PI-Hoechst三重染色

1. 20μLのFDAストック溶液を加えることにより、FDA-PI作業溶液を調製する（最終濃度：10μg/ mL）および50μLのPIストック溶液（最終濃度：50μg/ mL）を10mLのPBSに溶解した。ボルテックスで混合し、これを氷上に置く。
   1. FDA-PI-Hoechst作業溶液には、FDA原液（最終濃度10μg/ mL）20μL、PI原液50μL（最終濃度50μg/ mL）、およびHoechst原液（最終濃度5μg/ mL）を10mLのPBSに溶解した。ボルテックスで混合し、これを氷上に置く。
      注記：使用直前に、FDA-PI作業用溶液およびFDA-PI-Hoechst作業用溶液を新しく調製します。
2. インキュベーターから細胞培養プレートを取り出します。それを氷上に置く。
3. 培地を吸引し、冷PBSと交換する。
   注：ソリューションの変更はゆっくりと注意深く行う必要があります。ピペットチップで細胞に触れないでください。
4. 冷PBSを吸引し、冷たいFDA-PIまたはFDA-PI-Hoechst作業溶液（500μL/我々12ウェル細胞培養プレートの場合は11、または6ウェル細胞培養プレートの場合は1mL /ウェル）。氷上に5分間放置する。
5. FDA-PIまたはFDA-PI-Hoechst作業溶液を吸引し、冷PBS（12ウェル細胞培養プレートについては100μL/ウェル、または6ウェル細胞培養プレートについては50μL/ウェル）を加える。
   注：画像を撮影するときは、細胞を乾燥させてはいけません。
6. 蛍光顕微鏡を使用して画像を撮る。 450〜490 nmの通過帯域を持つ励起フィルターを使用してください。 FDA、PIおよびHoechstの蛍光発光をそれぞれ520nm、620nmおよび460nmで検出する。同じ条件下で、蛍光顕微鏡の位相差モードを用いて通常の光の下で画像を撮る。
   注：FDA-PIまたはFDA-PI-Hoechst染色後15分以内に画像を撮る。露光時間は100〜300msで、アナログゲインは2.8xです。

ニューロン生存率の評価

1. FDA-PI二重染色のために、濾過後に検出された細胞の画像をオーバーレイするグラフィックスエディタソフトウェアでPI陽性層上のFDA陽性層をドラッグすることにより、異なる蛍光フィルタによって検出することができる。
   1. 「レイヤー」パネルの「不透明度」フィールドに「50％」を入力して、FDAポジティブレイヤーの不透明度を調整します。 "Layer"メニューの "Merge Visible"ボタンをクリックして2つのレイヤーをマージします。 「画像」の下の「コントラスト」フィールドに「50」と入力して、オーバーレイ画像のコントラストを設定します。 "調整" | "明るさ/コントラスト"オーバーレイ画像にFDAおよびPI二重陽性細胞がないことを確認します。
2. FDA-PI-Hoechstトリプル染色の場合、グラフィックスエディタソフトウェアでPI陽性層上のFDA陽性層をドラッグすることにより、異なる蛍光フィルターを濾過した後に検出された細胞の画像を重ね合わせる。 「レイヤー」の「不透明度」フィールドに「50％」を入力して、FDAポジティブレイヤーの不透明度を調整します。34;パネル。
   1. "Layer"メニューの "Merge Visible"ボタンをクリックして2つのレイヤーをマージします。 Hoechst陽性層を結合した層上にドラッグします。 「レイヤー」パネルの「不透明度」フィールドに「50％」を入力して、Hoechstポジティブレイヤーの不透明度を調整します。 "Layer"メニューの "Merge Visible"ボタンをクリックして2つのレイヤーをマージします。
3. 蛍光モードで撮影した画像と位相差モードで撮影した画像とを比較することにより、大きくて不規則なグリア細胞をCGNから視覚的に区別する- CGNの3倍の直径を有する細胞はグリア細胞と考えられ、除外すべきである。
4. 画像処理プログラム（ 例えば、 ImageJ）で細胞カウンタープラグインを使用することにより、生存可能なニューロンおよび死んだニューロンの数をそれぞれカウントする⁴ 。
   1. FDA-PI二重染色のために、小さなFDA陽性細胞を手動で実行可能なニューロン。 PI陽性細胞を死んだニューロンとして手動でマークする。 FDA-PI-Hoechstトリプル染色のために、小さなFDA-およびHoechst-二重陽性細胞を生存可能なニューロンとして手動でマークする。 PI-およびヘキスト - ダブル陽性細胞を死んだニューロンとして手動でマークする。
5. ニューロン生存率= [生存可能なニューロンの数/（死んだニューロンの数+生存可能なニューロンの数）]×100％を用いて、ニューロン生存率を計算する。各ウェルについて、5つのランダムなフィールドを選択し、ニューロンの生存率のパーセンテージを平均する。

結果

GAP43（赤色）およびGFAP（緑色）の二重免疫染色を用いて、ニューロンおよびグリア細胞の形状をそれぞれ分析した2,5。両方のニューロンおよびグリア細胞はCGN培養物中に存在する。 GFAP陽性グリア細胞は、画像中の矢印で示されるように、大きくて不規則な形状である（ 図1 ）。ニューロンの生存度を測定するために使用される場合、細胞活力のための?...

ディスカッション

このプロトコールは、以前に記載された手順6,7から修正された。研究者らは、インビトロで初代ニューロンを培養する際の条件を改善することによって、非神経細胞成長を減少させるために時間を費やしている⁸ 。しかし、培養条件が改善されても、いくつかのグリア細胞が残る。さらに、非ニューロン細胞は、ニューロンの成長および成熟に役立つため、初?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100× glutamine	Gibco	25030081
100× anti-biotic	Gibco	15240062
BME medium	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate	Sigma	F7378
Propidium iodide	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine serum albumin	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn  the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate  is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 ml	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 ml	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image process softeware	NIH	ImageJ