心肌肌细胞基致动器和自稳定Biorobot - 第1部分

摘要

在这篇两部分的研究中，使用高度柔性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）悬臂和活肌细胞（心肌细胞）开发了生物致动器，并进行了表征。将生物致动器与由改性PDMS材料制成的基底结合以构建自稳定的游泳制冷机。

摘要

生物机器通常被称为双子座，是活体细胞或基于组织的装置，其仅由活体组分的收缩活性来驱动。由于其固有的优势，双子座作为传统全人造机器人的替代品正在获得兴趣。各种研究集中在利用生物执行器的力量，但是最近的研究已经定量地表征了Biorobots的性能，并研究了它们的几何形状以增强功能和效率。在这里，我们展示了一个自我稳定的游泳水族箱的发展，可以在没有外部干预的情况下保持其俯仰，深度和滚动。在第一部分中描述了用于生物致动器和biorobot的PDMS支架的设计和制造，随后用纤连蛋白进行官能化。在这篇两部分文章的第二部分中，我们详细介绍了心肌细胞的结合和表征生物活化ator和biorobot功能。两者都包括产生基于翅片的推进的基部和尾部（悬臂）。尾部由使用PDMS和激光雕刻的软光刻技术构成。将尾部与装置基底结合后，用细胞粘附蛋白功能化，并与心肌细胞融合。生物致动器的基座由具有中心玻璃珠（作为重量）的固体PDMS块组成。 biorobot的基础由两个复合PDMS材料，Ni-PDMS和microballoon-PDMS（MB-PDMS）组成。镍粉（Ni-PDMS）允许细胞播种期间的biorobot的磁控制和运动期间的稳定性。微球（MB-PDMS）降低MB-PDMS的密度，使Biorobot能够稳定地游泳和游泳。使用这两种具有不同质量密度的材料，能够精确控制重量分布，以确保在biorobot的任何角度处的积极恢复力。这个技巧产生一个磁力控制的自稳定游泳混合动力。

引言

正在积极研究生物执行器和双子座，以便为众多应用提供常规机器人的替代方案。步行5,6,7,8的Biorobots游泳^{1，2，3，4} ，泵^9,10 ，或手柄^11，12，13 已经开发。类似地，肌肉细胞可以并入3D卷状PDMS结构^14中 。通常，使用具有诸如水凝胶和PDMS（聚二甲基硅氧烷）的材料的软平版印刷技术来制造Biorobot骨架。这些是有吸引力的选择，因为它们的灵活性，biocompatib容易调整刚度。活体肌细胞通常与这些材料结合以通过收缩提供力产生。哺乳动物的心肌细胞（心肌细胞）和骨骼肌细胞主要用于致动。除了这两个之外，昆虫肌肉组织已经用于在室温下操作双子座³ 。在这两部分研究中，选择了心肌细胞，因为它们的自发收缩⁶ 。

早期关于biorobots的研究大部分集中在开发生物执行器，而Biorobot架构的优化和Biorobots的基本功能的发展在很大程度上被忽视。最近有一些报告显示了不同游泳模式的实施，这些模式受到自然界中发现的推进模式的启发。这些方法包括PDMS膜和肌肉细胞以模拟各种天然推进方法。例如，已经报道了基于鞭毛的推进¹ ，仿生水母推进² ，生物混合射线⁴和薄膜PDMS游泳装置¹³ 。

在本文中，我们介绍了可以保持浸入深度以及俯仰和滚动的自稳定游泳芭比娃娃的制作过程。 biorobot具有坚实的基部或身体，其由附着在其表面上的心肌细胞的单个悬臂推动。当心肌细胞收缩时，心肌细胞使得悬臂在纵向方向上弯曲。这种游泳形式被列为鸵鸟游泳。在基地添加额外功能的能力是鸵鸟游泳的独特优势。例如，可以利用该基础来提供过量的浮力以携带用于心肌细胞收缩的附加货物或控制电路。

稳定性在以前的biorobots研究中，biorobot经常被忽视。在本研究中，我们通过使用具有不同质量密度的不同复合PDMS材料设计基体来实现自稳定。因此，biorobot表现出对外部干扰的抵抗力，并保持其浸没深度，俯仰和滚动，无人值守。第一层是微球PDMS（MB-PDMS）， 即与微球混合的PDMS，降低了Biorobot的密度，使其能够漂浮在介质中。第二层是PDMS悬臂，其厚度被定制，使得由心肌细胞产生的力可以使悬臂从45°到90°显着弯曲。底层为镍-PDMS（Ni-PDMS）， 即与镍粉混合的PDMS。该层执行多个功能。它是磁性的，因此在细胞播种期间，使用磁铁，可以将biorobot锚定在培养基的底部。镍混合物的密度比MB-PDMS高中等，并确保漂浮时的biorobot的直立位置。该层的重量在任何间距和滚动条件下都能够在biorobot上产生恢复扭矩。此外，Ni-PDMS和MB-PDMS之间的体积比保持浸没深度。所提出的方案对于对表征肌肉细胞和组织的打击力以及希望建造游泳混合动物的人来说是非常有用的。

功能化生物致动器和双极器件的接种，细胞的机械和生物化学特征以及器件功能的定量分析在这两篇文章的第2部分以及最近的工作中有详细描述。

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研究方案

1.计算PDMS和添加剂的质量

1. 使用以下公式找到以下程序中特定高度所需PDMS的质量，
   M =ρ* V =ρ*高度*面积（1），
   "高度"是层的高度，"面积"是PDMS将被固化的容器的面积，"ρ"是混合物的密度，"V"是体积。
   注意:高度计算的密度为PDMS = 0.965 g / mL，Ni-PDMS = 1.639 g / mL，MB-PDMS = 0.648 g / mL。
2. 使用方程（1）估计给定容器所需的PDMS的质量，以获得生物致动器底座的特定高度（5mm）。得到的PDMS密度为0.965g / mL。
   注意:固化剂的重量比为10:1。
   M _base =ρ* V =ρ* V *（ ）（2）
   M _固化剂 =ρ* V =ρ* V *（ ）
3. 使用方程（1）找出对于给定容器所需的Ni-PDMS的质量，以获得biorobot底部的特定高度（1.5mm）。
   注:比例为1:1.88（镍粉与PDMS的重量比）和1:1.71:0.171（镍粉对PDMS碱与PDMS固化剂的重量）。所得的Ni-PDMS密度为1.639g / mL。
   M _镍 =ρ* V =ρ* V *（ ）（3）
   M _base =ρ* V =ρ* V *（ ）
   M _固化剂 =ρ* V =ρ* V *（ ）
4. 类似地，使用等式（1）到f对于给定的容器，需要MB-PDMS的质量来获得biorobot的顶部基座的特定高度（3.5mm）。
   注意:比例为1:5（微球与PDMS的重量比）和1:4.54:0.454（按PDMS固化剂的PDMS基重量的微球）。所得到的MB-PDMS密度为0.648g / mL。
   M _微球 =ρ* V =ρ* V *（ ）（4）
   M _base =ρ* V =ρ* V *（ ）
   M _固化剂 =ρ* V =ρ* V *（ ）
5. 使用分析脚本检查具有所需尺寸和几何尺寸的biorobot的动态稳定性;请参阅补充信息"Biorobot_dynamic_stability.m"和"CG_CB_calculation.m"。

_title"> 2。固定基地上的生物执行器的制造

注意:见图1a。

1. 旋涂PDMS薄膜（见图1a-1和a2）。所得PDMS膜的厚度为25μm。
   1. 将硅晶片放置在光致抗蚀剂旋转器上，并将泵开关翻转，以产生吸力。
      注意:硅晶片的直径为4英寸，厚度为500微米。
   2. 将正性光致抗蚀剂（ 例如 S1808）倒入硅晶片上，直到晶片完全覆盖。编程旋转器以2000 rpm旋转20秒。然后，通过按压脚踏板接合旋转器。旋转后关闭吸力。
   3. 将热板加热至120°C。使用晶圆镊子从旋转器中取出硅晶片，并将硅晶片直接放在电热板上。用浅培养皿覆盖晶片，烘烤10分钟。
      注意:烤箱可以用于烤箱使用相同的温度和持续时间。 图1a-1描述了这个过程。
   4. 将塑料容器放在称重秤上并将其清零。将6g PDMS底物倒入容器中，加入0.6g PDMS固化剂。将PDMS彻底混合5分钟。
      注意:混合后，混合物应与气泡汇合。
   5. 将混合PDMS的容器放入真空室中。将真空室的压力降低至100毫巴，并将容器放在室内30分钟。打破真空，取出容器。保持容器盖直到使用。
   6. 将硅晶片与烘烤的光致抗蚀剂层放置在旋转器上。将整个脱气的PDMS混合物缓慢倒入晶片上。
      注意:缓慢倒入，以免混合物中引入新的气泡。
   7. 将旋转器设置为1,200 rpm，持续5分钟。打开旋转器抽吸并接触旋转器。旋转后关闭吸力。
      注意:T这些设置会导致一个25μm厚的PDMS层。
   8. 将烤箱加热至40°C。使用晶圆镊子从旋转器中取出硅片，然后将其放入烤箱。将晶片烘烤过夜，然后在室温下冷却晶片。
      注意: 图1a-2描述了这个过程。
2. 激光雕刻薄膜PDMS层。
   1. 打开激光雕刻机的电源开关及其排气。打开连接到激光雕刻机的计算机。打开激光雕刻软件。
   2. 在"文件"选项下，打开生物执行器设计文件，如图2e所示。
      1. 按"设置"按钮。点击"蓝色"，将功率设置更改为3％，速度设置为4％。点击"设置"。点击"黑色"并更改"模式"跳过。然后点击"设置"。对"红"也一样。按"应用"按钮完成设置"。
      2. 按右上角的"激活刻录机"按钮。
   3. 按"移动"按钮将设计移动到软件屏幕的中央。
   4. 按程序中的"焦点视图"按钮，然后单击屏幕上的biorobot边缘。这将激光雕刻机的引导激光点移动到相应的位置。
   5. 用镊子手动移动晶片，使得与2.2.4中点击的点相对应的晶片上的点直接在引导点下方。
   6. 按"开始刻印先前作业"按钮开始雕刻过程。雕刻完成后取出晶圆。关闭所有设备。
      注意:"开始刻印先前的作业"按钮是大的绿色三角形。不要直视雕刻过程，因为激光可以损伤眼睛。 图1a-3描绘了这个过程。
3. 生物致动器基座的制备和制造。
   1. 将玻璃珠（3mm直径）倒入15 mL管中。将珠粒与70％乙醇浸入去离子水中24小时。取出乙醇并用DI水填充管24小时。倒出去离子水，将管放在50℃的电热板上，以便玻璃珠的干燥。
   2. 在公式（1）中添加3 g到PDMS的量，以解释在倾倒期间粘附到容器侧的PDMS。使用公式（2）找到PDMS碱和固化剂量。
   3. 将塑料容器放在称重秤上并将其清零。将步骤2.3.2中找到的PDMS基础数量倒入容器中并将其清零。然后将步骤2.3.2中发现的PDMS固化剂的量倒入容器中。
   4. 将PDMS彻底混合5分钟。
      注意:PDMS以10:1碱与固化剂的比例使用。混合物应该有很多气泡。
   5. 地点一个容器用于刻度和零点烘烤。小心地将步骤2.3.2中找到的正确数量的PDMS（并在步骤2.3.4中混合）倒入容器中。定期将PDM混合物中的玻璃珠清洁干净。为生物执行器基座留出每个珠周围至少5毫米的空间。
   6. 将容器放入真空室。将真空压力降至100毫巴，关闭真空泵。 30分钟后，打破真空并取出容器。保持使用。
      注意:当混合物脱气并且真空室泄漏时，室内的压力可能会随时间缓慢上升。如果压力大大超过100毫巴，打开真空泵将压力恢复到100毫巴。
   7. 将电热板加热至40°C。小心地将PDMS容器和玻璃珠放在热板上。盖上容器并过夜烘烤。
4. 生物执行器组件。
   注意:以下步骤可以用肉眼完成。
   1. 使用剃刀刀片从零件2.3中制成的散装PDMS中切割立方体（5 mm x 5 mm x 5 mm）。
      注意:一个珠应位于每个立方体的中心。
   2. 清洁每个生物执行器底座的所有侧面，通过将基座压入磁带并移除，去除基面上的任何污染物。为每一方重复。
   3. 重做步骤2.3.2〜2.3.6，制成少量液体PDMS。将针头浸入液体PDMS中。将一滴液体PDMS放置在步骤2.2中图案化的晶片的雕刻基底区域上。涂抹PDMS的液滴，使其完全覆盖5 mm x 5 mm的基面积。
      注意:基座区域是图2a中的中间正方形部分。
   4. 使用镊子将清洁的立方体从步骤2.4.2放置在液体PDMS覆盖的基础区域上。
   5. 重复步骤2.4.3从"放一滴液体PDMS"到end和步骤2.4.4对于将要进行的每个设备。
   6. 将电热板加热至40°C。小心地将硅片与组件放在热板上。盖上晶片并烘烤过夜。
      注意:使用前请保留组件。 图1a-4描绘了最终的装置。

3.制作Biorobots（图1b）

1. 旋涂和激光雕刻薄PDMS薄膜
   1. 使用新的硅晶片重复2.1和2.2中的所有步骤。这将导致具有PDMS的薄膜和光致抗蚀剂的薄膜的硅晶片，其被刻有双酚酸设计。
      注意:在重复步骤2.2时，使用biorobot设计进行激光雕刻，而不是之前使用的生物驱动器设计。 图1b-1和b-3描述了这些过程。
2. PDMS组合物的制备和制备站点。
   注意:以下步骤可以用肉眼完成。
   1. 将酚类微球倒入50mL管中直至充满。在管中加入70％乙醇的DI水，放置24h。倒出乙醇，加入去离子水，放置24小时。倒出DI水，然后将管放在50℃的电热板上，以方便使用前对微球进行干燥。
   2. 使用MB-PDMS密度和3.5 mm高度的方程（1）找到所需的PDMS体积。添加3 g至总量，以计算浇注后将留在容器中的材料。使用公式（3）找到PDMS基础和固化剂量。使用秤测量适量的PDMS碱，固化剂和微球。
   3. 使用Ni-PDMS密度和1.5 mm高度的方程（1）找到所需的PDMS体积。加入3g，如步骤3.2.2所示。使用公式（2）找到PDMS基础并固化a总量。使用秤测量适量的PDMS基，固化剂和镍粉。
   4. 将MB-PDMS和Ni-PDMS的每种混合物混合5分钟。将3.2.2和3.2.3中计算出的正确数量的MB-PDMS和Ni-PDMS小心地倒入分开的容器中。
      注意:混合物应通过金属或玻璃棒充分混合，而不会刮伤混合容器的底部表面。混合物将与气泡汇合。
   5. 将两个容器放入真空室。将其压力降至100毫巴30分钟。打破真空并取出容器。保持使用。
   6. 将电热板加热至40°C。将MB-PDMS和Ni-PDMS容器放在热板上。盖上每个容器并过夜烘烤。
      注意:使用盖子存放。
3. Biorobot装配。
   1. 从Ni-P切割尺寸相当于每个biorobot尺寸的biorobot基座DMS和MB-PDMS使用剃刀刀片。有关基本设计，请参见图2b-2d 。
      注意:Ni-PDMS的厚度为1.5 mm，MB-PDMS的厚度为3.5 mm。
   2. 清洁biorobot底座的所有侧面，以清除表面上的任何污染物，将基座压入胶带并取出。为每一方重复。
   3. 打开电晕放电器。将电晕放电器的尖端放在Ni-PDMS基体上方1厘米处，放置在金属板之间，其间具有洁净室组织。将尖端移动到底座周围，并持续15秒以处理表面。
      注意:电晕放电器和晶圆之间应发生放电。如果没有，请将尖端靠近，直到出现放电。
   4. 重复步骤3.3.3，以处理在步骤3.1中雕刻的仿生植物的基部表面相同的持续时间。使用镊子将Ni-PDMS处理侧放置在胶片的处理面上。让设备坐5分钟。
      注意:这将strongly键两部分。 见图1b4 。
   5. 使用尖锐的镊子从晶圆上剥下Biorobot悬臂，将其放在Ni-PDMS底座的底部。使用镊子从晶片上移除整个组件。
      注意:悬臂将连接到Ni-PDMS基座。 图1b-5和b-6描述了这一点。
   6. 在MB-PDMS基础的顶部放置一小片未固化的PDMS（10:1碱固化剂）。使用镊子将带有薄膜PDMS的Ni-PDMS侧面与未固化的PDMS放在MB-PDMS上。将组件放入塑料培养皿中，然后将其置于40℃的电热板上，以固化过夜。
      注意: 图1b-7描绘了最终的设备。

4.器件功能化

注意:下面我们将介绍准备细胞播种装置的过程。

1. 预备是补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素抗生素（DMEM完成）的纤维连接蛋白溶液（50μg/ mL），磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS），Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）。
2. 将100μL纤连蛋白溶液放入T-25培养瓶的中心（烧瓶直立时的底面）。为每个设备维护单独的烧瓶。
3. 将biorobot或生物致动器朝下放置在纤连蛋白溶液的液滴上。确保悬臂展开并浸入液滴中。在37℃孵育30分钟。
4. 培养后，取出纤连蛋白溶液，用PBS洗涤两次。
5. 取出PBS，并用10ml DMEM充满烧瓶。在37℃孵育1小时以促进PDMS脱气。为了将培养基淹没在10 mL培养基中，请使用磁铁将设备固定在烧瓶的底部。把烧瓶放在一边在超声波浴中放置5分钟以除去气泡。
   注意:在潜伏期间，在PDMS表面形成气泡，这里称为脱气。在Biorobot装配中使用的Ni-PDMS是磁性的。生物致动器不需要磁体，因为它将由于玻璃珠的重量而保留在烧瓶的底部。生物执行器组件现在准备好播种，这在第2部分中有详细的说明。

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结果

生物致动器和双子座具有非常相似的制造工艺，因为biorobot是生物致动器的自然延伸（ 图1 ）。首先开发生物致动器以建立生物机器所需的技术，分析由细胞产生的力并且机械和生物化学地表征细胞成熟，这两者在这两篇文章的第2部分中详细描述就像我们最近出版的作品一样。

评估和调整致动器的弹簧常数，以在...

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讨论

水中游泳者中可以发现各种运动机制¹⁶ 。本研究中Biorobot的运动机制采用鳍状运动，特别是鸵鸟运动。鸵鸟式游泳者通过摇摆尾巴（悬臂）并具有刚体（分层底座）推动自己¹⁶ 。鱼类，如鱼类和鲶鱼使用这种类型的运动。玄武岩型游泳运动员通常很慢，身体尺寸无效。虽然鸵鸟游泳缺乏速度，这种游泳形式允许工程师在基座或身体上实现各种功能（如动态稳定?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	184 sil elast kit  0.5kg	Sylgard 184
Nickel Powder	Sigma-Aldrich	266981-100G
Phenolic microballoons	US Composites	BJO-0930
Silicon wafers			4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner			Spin- coater
Positive photoresist (S1808)	Dow Corning	DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven			Convection oven
Laser engraver	Universal Laser System	VLS2.30	Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser
Universal Laser Systems Application	Universal Laser System		Application for running the VLS 2.30
Matlab	MathWorks		Numerical analysis program
Scotch Tape	Scotch Brand
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich	Z265926-1EA	Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale	Mettler Toledo	EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater	Electrotechnic Products	12051A	Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L	Fisher Scientific	15-337-402	40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum	Hyclone Industries, GE	16777-240	Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032