小鼠脂肪组织来源的微血管片段作为血管化单元的分离组织工程

摘要

我们提出了一个协议，以分离代表有希望的血管单元脂肪组织来源的微血管片段。它们能够迅速地分离，不体外处理要求，因此，可以用于在组织工程的不同领域一步法prevascularization。

摘要

功能性微血管网络的生存和工程化组织构建整合至关重要的意义。为此，一些血管生成和prevascularization战略已经确立。然而，大多数的基于细胞的方法包括耗时的体外用于微血管网络的形成步骤。因此，它们不适合于术中的一步程序。脂肪组织来源的微血管片段（广告-MVF）代表有希望的血管形成单元。它们可以从脂肪组织容易地分离，并表现出的功能性微血管形态。此外，他们很快重新组合成在体内植入后新的微血管网络。此外，广告MVF已被证明诱导淋巴管生成。最后，它们都具有丰富的间充质干细胞，它可以进一步促进其高血管潜在来源。在以前的研究中，我们已经证明了显着的vascularizati在工程化骨和皮肤代用品广告MVF的能力。在本研究中，我们对广告MVF从小鼠脂肪组织中的酶隔离的标准化协议的报告。

引言

组织工程集中在组织和器官的替代品维持， 体内同行^1,2恢复或增强的不可操作的功能的制造。工程化组织构建的命运很大程度上取决于适当的血管^3。这些结构中的微血管网络应与小动脉，毛细血管和小静脉分层组织，使吻合到收件人的血管⁴后有效血液灌注。这种网络的产生是在组织工程中的主要挑战之一。为了这个目的，实验血管策略广谱已经出台，在过去二十年里^5，6。

血管生成的方法刺激接受者微血管长入工程做卷烟由结构或物理化学骨架修饰的手段，如生长的掺入因子⁷的UE。然而，对于大的三维结构的血管形成，血管生成依赖性策略显着通过开发微血管⁸的生长速度缓慢的限制。

与此相反，prevascularization的概念旨在用于功能微血管网络的生成中之前将其植入⁹组织构建体。常规prevascularization涉及形成血管的细胞，如内皮细胞，周细胞或干细胞^10，支架内的共培养物。后微血管网络的形成，预血管化构建体可以然后被植入到组织中的缺陷。值得注意的是，此方法prevascularization难以在临床环境中应用，因为它是基于复杂的和耗时的体外</ em>的程序，由主要监管障碍限制^9。因此，仍然需要新颖的prevascularization策略，更适合广泛的临床应用的发展。

这种prevascularization策略可能是来自脂肪组织的微血管片段（广告-MVF）的应用。广告-MVF表示可以在大量从大鼠^11,12和小鼠¹³的脂肪组织收获效的血管形成单元。它们由小动脉，毛细管，和小静脉血管区段，其表现出与管腔的生理微血管形态和稳定血管周围细胞^14,15。这种独特的功能使得广告MVF接种支架的直接植入组织缺损无预培养。在那里，广告MVF快速重新装配到功能性微血管网络。此外，广告-MVF表示富间充质干细胞^16，其可额外地有助于其撞击再生能力的源。因此，广告-MVF正越来越多地在组织工程^{14，15，17，18，19，20，21}的不同领域中使用。

广告MVF的隔离最初已经建立大鼠^11，12。在此，我们描述了一种协议，它允许从附睾脂肪垫鼠广告-MVF的标准化隔离。这可以提供进一步的见解成通过使用转基因小鼠模型基础的ad-MVF功能的分子机制。

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研究方案

根据对实验动物的使用准则卫生研究所进行并遵循机构准则（Landesamt献给Soziales，GESUNDHEIT UND Verbraucherschutz，ABT。Lebensmittel- UNDVeterinärwesen，Zentralstelle，萨尔布吕肯，德国）的所有程序。

1.手术器械的制备

1. 保持准备的清扫剪刀，手术钳，小准备剪刀，精细镊和无菌培养皿用15ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM; 10％胎牛血清（FCS），100U / mL青霉素，0.1毫克/毫升链霉素）为收获附睾脂肪垫。
2. 暴露手术器械至5分钟的消毒溶液。可替换地，它们进行消毒（蒸汽灭菌; 121℃，20分钟）。

2，动物和麻醉

1. 仔细选择的小鼠品系作为研究和指示受调查之中。
   注:在本研究中，我们使用的雄性野生型C57BL / 6小鼠作为捐助者的附睾脂肪的收获。的兴趣，广告-MVF也可以从转基因绿色荧光蛋白（GFP）阳性供体动物（C57BL / 6-TG（CAG-EGFP）1Osb / ^J）22隔离。这证明的主要优点是，片段是通过植入GFP阴性野生型小鼠¹⁴之后的GFP免疫组织化学染色容易检测的。
2. 用甲苯噻嗪（15毫克/千克）和氯胺酮（75毫克/千克）的腹膜内注射麻醉动物。确保动物深受无响应执行脚趾捏麻醉。作为供体动物脂肪获取后处死眼部润滑剂无法显示。
   注:确保镇痛和手术不育是与其中的实验计划的国家和机构各自的指导方针一致。

附睾脂肪垫的乐"> 3。收获

1. 动物转移到手术台上。放置在仰卧位的动物外科手术立体显微镜下，用脚趾捏确认深度麻醉。
2. 他们录音到手术单固定的爪子并用消毒液消毒腹部。
3. 分离游离下面的肌肉层与清扫剪刀的腹部皮肤。
4. 与清扫剪刀进行中线剖腹手术和横向展开腹壁的襟翼。
5. 双边识别睾丸，附睾和使用细钳子（ 图1）的附睾脂肪垫。 不要伤害肠道结构，防止脂肪垫的粪便污染。
6. 用立体显微镜下的小剪刀准备和罚款钳收获附睾脂肪垫。 保持附睾和脂肪之间的几个毫米的安全边际减少意外收获附睾的风险。
   注:此过程也可以在没有立体显微镜进行。然而，这可能进一步增加附睾和精索的意外伤害的风险。
7. 在37℃下转移附睾脂肪垫到含有15毫升的DMEM的培养皿预加热输送至细胞实验室。
8. 经腹主动脉或颈椎脱位切开牺牲动物。

4.隔离广告的MVF

1. 用15mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），无菌的14毫升聚丙烯（PP）管，无菌的50姆·埃伦迈尔瓶中，无菌1.5 mL锥形离心管中并灭菌细剪刀制备三种无菌培养皿中。
2. 在层流罩下用15ml PBS的三次洗涤脂肪垫在培养皿中。
3. 转移脂肪成一个14毫升PP管。用t来确定收获的脂肪组织（以mL）的体积他管的规模。与细剪刀切碎机械的脂肪组织，直到获得均匀的组织悬浮液。
4. 通过测量移液管的10mL的手段用胶原酶NB4G（0.5 U / ml的PBS）的两卷转移切碎的组织成为50毫升锥形瓶中。总体积变为三次在步骤4.3测量脂肪组织的体积。在37℃，并用5％CO ₂湿润大气条件:在剧烈搅拌下10分钟的孵化器由自动搅拌器（25毫米磁力搅拌棒的大小）来进行组织消化。
5. 观察消化的组织的一小部分（10μL），在显微镜下，以判断是否消化可以停止。确定该消化物主要含有下为单细胞"免费"广告MVF，指示适当的点以终止酶促消化处理（ 图2）。
   注:此步骤需要与程序的经验和对质量的关键孤立广告MVF。长期在一个单细胞悬液脂肪消化的结果，而广告MVF。
6. 中和，用PBS / 20％FCS的两个体积的酶。总体积变为三次细胞 - 悬浮液容器的步骤4.4的体积。转移细胞的容器悬挂放回新PP管中。
7. 孵育5分钟将悬浮液在37℃至广告MVF从通过重力剩余的脂肪分离。然后小心地用1mL的精密移液管取出主脂肪上清液。重复这个循环多次使用100μL精密移液管，直到悬挂似乎是不含脂肪。
8. 把一个500微米的过滤器上的50mL锥形离心管的顶部。从14毫升PP管用10毫升移液管测量转移的细胞悬浮液容器到所述过滤膜，以除去剩余的脂肪凝块。根据个别广告-MVF的数目传送过滤的悬浮液到新的14毫升PP管分离为计划的实验。
   注:有关VITRÒ测定着眼于微血管网络的形成，这可能是有益的，以进一步纯化所述细胞悬浮液容器，以改善在显微镜分析成像质量。为了这个目的，该悬浮液可以另外用20微米过滤器过滤一次，以去除从所述ad-MVF单个细胞收集在过滤器上。
9. 离心细胞悬浮液容器（600×g下，5分钟，室温），得到含有广告-MVF的颗粒。
10. 离心后，除去直到1毫升留上清液。重悬在此1毫升用Ad-MVF颗粒与悬浮液转移到1.5-mL锥形离心管。
11. 离心机的离心管中的ad-MVF悬浮液（600×g下，5分钟），得到颗粒。
12. 除去上清液重悬在PBS / 20％FCS的所要求的最终体积的颗粒。
    注:每个隔离广告MVF的数量可通过显微计数进行评估。为此，1/10决赛细胞vesse的升悬浮液在PBS中稀释1:10，该稀释的100微升转移到一个96孔板的孔中。然后广告-MVF的呈现容器状形态的整个数目进行计数，并外推到整个分离物。所需的广告MVF浓缩和纯化可以在体外或在 ad-MVF的体内应用单独适应于相应。这可以包括广告-MVF的在胶原凝胶用于微血管网络的形成的体外分析或广告MVF的支架上用于体内植入到组织中的缺陷的播种的嵌入。

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结果

在本研究中，我们进行六次广告-MVF分离程序与脂肪组织从7至12个月大的雄性野生型C57BL / 6小鼠（平均体重:35±1克）。 图1示出的鼠附睾脂肪垫，随后机械和酶的ad-MVF隔离收获。对于脂肪的收获所需的时间为30分钟，并为广告-MVF的隔离为120分钟。总的来说，该过程带着150分钟。

我们收获1.2±0.1毫升每供体动物的脂肪?...

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讨论

在这项研究中，我们提出了广告MVF的隔离一套行之有效的协议。从小鼠脂肪组织获取广告MVF是几个关键步骤的手续很简单。小鼠表现出不同的皮下和腹腔内脂肪堆积。如先前针对大鼠描述于广告-MVF的隔离最合适的脂肪源是附睾脂肪垫，由于它们的尺寸，均匀的结构和最少的污染具有更大的血管^11，12。相反，在小鼠皮下脂肪沉积要小得多，更粘附到周围...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)