Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente zu isolieren, die viel versprechende Vaskularisierung Einheiten darstellen. Sie können schnell isoliert werden, erfordern nicht in vitro - Prozessierung und somit für Prävaskularisation Ein-Schritt verwendet werden kann , in verschiedenen Bereichen des Tissue Engineering.

Zusammenfassung

Ein funktionelles mikrovaskulären Netzwerk ist von entscheidenden Bedeutung für das Überleben und die Integration von Engineered Gewebekonstrukten. Zu diesem Zweck wurden mehrere angiogene und Prävaskularisation Strategien etabliert. Allerdings sind die meisten zellbasierte Ansätze sind zeitraubend in vitro Schritte zur Bildung eines mikrovaskulären Netzwerk. Daher sind sie für die intraoperative Ein-Schritt-Verfahren nicht geeignet. Fettgewebe abgeleiteten mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) stellen vielversprechende Vaskularisierung Einheiten. Sie lassen sich leicht aus Fettgewebe und weisen eine funktionelle microvessel Morphologie isoliert werden. Darüber hinaus wieder zusammenbauen sie schnell in neue mikrovaskuläre Netzwerke nach Implantation in vivo. Darüber hinaus Ad-MVF wurde Lymphangiogenese induziert. Schließlich sind sie eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen, die weiterhin ihre hohen Potential Vaskularisierung beitragen können. In früheren Studien haben wir die bemerkenswerte vascularizati demonstriertauf der Kapazität des Ad-MVF in engineered Knochen und Hautersatz. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein standardisiertes Protokoll für die enzymatische Trennung von Ad-MVF aus murinen Fettgewebe.

Einleitung

Tissue Engineering konzentriert sich auf der Herstellung von Gewebe- und Organersatz , die erhalten, wiederzuherzustellen oder die Funktion des inoperablen in vivo Pendants ^{1, 2} zu erhöhen. Das Schicksal von Engineered Gewebekonstrukten hängt entscheidend von einer adäquaten Vaskularisation ^3. Die mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb dieser Konstrukte hierarchisch mit Arteriolen, Kapillaren organisiert werden sollte, und Venolen nach inosculation der dem Empfänger Gefäß ⁴ effiziente Durchblutung zu ermöglichen. Die Erzeugung solcher Netzwerke gehört zu den wichtigsten Herausforderungen in Tissue Engineering. Zu diesem Zweck wird ein breites Spektrum von experimenteller Vaskularisierung Strategien wurde in den letzten zwei Jahrzehnten eingeführt ^{5, 6.}

Angiogenen Ansätze fördern das Einwachsen des Empfängers microvessels in engineered tissUEs durch strukturelle oder physikochemischen Gerüstmodifikation, wie beispielsweise die Einarbeitung von Wachstumsfaktoren ^7. Doch für die Vaskularisierung von großen dreidimensionalen Konstrukten, Angiogenese-abhängigen Strategien werden durch langsame Wachstumsraten deutlich begrenzt von microvessels ⁸ zu entwickeln.

Im Gegensatz dazu soll der Begriff Prävaskularisation zur Erzeugung von funktionellen mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb des Gewebes , um ihre Implantation ⁹ vor konstruiert. Herkömmliche Prävaskularisation beinhaltet die Co-Kultur des gefäßbildenden Zellen, wie Endothelzellen, mural Zellen oder Stammzellen ^10, innerhalb von Gerüsten. Nach mikrovaskuläre Netzwerkbildung können die prävaskularisierten Konstrukte dann in Gewebedefekte implantiert werden. Bemerkenswert, dieser Prävaskularisation Ansatz ist schwierig , in einer klinischen Einstellung zu übernehmen, weil sie auf komplexe und zeitraubend in vitro basiert </ em> Verfahren, die von den großen regulatorischen Hürden ⁹ begrenzt sind. Dementsprechend besteht weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung neuartiger Prävaskularisation Strategien, die besser geeignet für eine breite klinische Anwendung sind.

Eine solche Strategie kann Prävaskularisation die Anwendung von Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) sein. ad-MVF stellt potente Vaskularisierung ¹¹ Einheiten , die in großen Mengen aus dem Fettgewebe von Ratten geerntet werden ^{können, 12} und ¹³ Mäuse. Sie bestehen aus Arteriolen, Kapillaren und Venolen Gefäßsegmente, die eine physiologische microvessel Morphologie mit einem Lumen aufweisen , und Stabilisieren perivaskuläre Zellen ^{14, 15.} Diese einzigartige Funktion ermöglicht die sofortige Implantation von Ad-MVF ausgesät Gerüsten in Gewebedefekten ohne Vorkultur. Dort wieder zusammenbauen der Ad-MVF schnell infunktionellen mikrovaskuläre Netzwerke. Weiterhin ad-MVF stellt eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen , ^16, die mit ihrer markanten Regenerationsfähigkeit zusätzlich beitragen können. Dementsprechend ad-MVF wird zunehmend in verschiedenen Bereichen des tissue engineering ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21} verwendet.

Die Isolierung von ad-MVF wurde ursprünglich in Ratten ¹¹ hergestellt worden ist ^{, 12.} Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die standardisierte Isolierung von Maus-Ad-MVF von epididymal Fettpolstern ermöglicht. Diese können vorsehen, weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen ad-MVF Funktion zugrundeliegenden von transgenen Mausmodellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Verfahren wurden für die Verwendung von Versuchstieren nach dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und anschließend institutionelle Richtlinien (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Deutschland).

1. Herstellung von chirurgischen Instrumenten

1. Halte bereit, die Dissektion Schere, chirurgische Pinzette, kleine Vorbereitung Schere, feine Pinzette und eine sterile Petrischale mit 15 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, 10% fötalen Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin ) epididymal Fettpolster für die Ernte.
2. Expose die chirurgischen Instrumente mit einer Desinfektionslösung für 5 min. Alternativ sterilisiert (Dampfsterilisation; 121 ° C, 20 min).

2. Tiere und Anästhesie

1. Wählen Sie sorgfältig die Belastung der Mäuse wie für die Studie darauf hin, und die Gegenstand untersucht.
   HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir männliche Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse als Spender für die Ernte der epididymal Fett. Von Interesse, ad-MVF auch aus transgenen grün fluoreszierendem Protein (GFP) -positiven Spendertieren (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) ²² getrennt werden kann. Dies trägt den großen Vorteil , dass die Fragmente durch immunhistochemische Färbung von GFP nach Implantation in GFP-negativen ¹⁴ - Wildtyp - Mäuse leicht nachweisbar sind.
2. Anesthetize die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin (15 mg / kg) und Ketamin (75 mg / kg). Achten Sie darauf, dass die Tiere tief anästhesiert werden durch eine Zehe Prise ohne Antwort ausführt. Augen Schmiermittel ist nicht angezeigt, da die Spendertiere nach Fett Ernte geopfert werden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Analgesie und chirurgische Sterilität ist in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien des Landes und Institution, wo die Experimente geplant sind.

le "> 3. Ernten von Epididymale Fettpolstern

1. Übertragen Sie das Tier auf einem Operationstisch. Legen Sie das Tier in Rückenlage unter einem chirurgischen Stereomikroskop und bestätigen tiefe Narkose toe Prise verwenden.
2. Immobilisieren die Pfoten von ihnen zu einem Operationstuch Taping und desinfizieren Lösung des Bauches mit desinfizieren.
3. Trennt die Bauchhautschicht frei von der darunter liegenden Muskel mit der Dissektion Schere.
4. Durchführen einer Mittellinie Laparotomie mit der Dissektion Schere und seitlich der Klappen der Bauchwand entfalten.
5. Bilateral identifizieren , Hoden, Nebenhoden und die epididymalen Fettpolster unter Verwendung der feinen Pinzette (Abbildung 1). Sie nicht die Darm-Strukturen schädigen fäkale Verunreinigung der Fettpolster zu verhindern.
6. Ernten Sie die epididymal Fettpolster mit der kleinen Vorbereitung Schere und der feinen Pinzette unter dem Stereomikroskop. Halten Sie einen Sicherheitsabstand von mehreren Millimetern zwischen den Nebenhoden und das Fettdas Risiko einer versehentlichen epididymal Ernte reduzieren.
   Hinweis: Dieses Verfahren kann auch ohne Stereomikroskop durchgeführt werden. Jedoch kann dies das Risiko einer versehentlichen Verletzung der Nebenhoden und Samenstränge erhöhen.
7. Übertragen die epididymalen Fettpolster in eine Petrischale mit 15 ml DMEM vorerwärmt auf 37 ° C für den Transport an die Zelllabor.
8. Opfert das Tier durch Einschneiden der Bauchaorta oder zervikaler Dislokation.

4. Isolierung von Ad-MVF

1. Bereiten drei sterile Petrischalen mit 15 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), sterile 14-ml-Polypropylen (PP) Röhrchen, einer sterilen 50-ml-Erlenmeyerkolben, steriles 1,5 ml-konisches Mikrozentrifugenröhrchen und sterilisiert feine Schere.
2. Waschen Sie die Fettpolster dreimal in Petrischalen mit 15 ml PBS unter einer Laminarströmungshaube.
3. Übertragen Sie das Fett in einen 14-ml PP Röhrchen. Bestimmt das Volumen des geernteten Fettgewebes (in ml) mit Hilfe von ter Rohr Skala. Zerkleinert den Fettgewebes mechanisch mit dem feinen Schere bis eine homogene Gewebesuspension erhalten wird.
4. Übertragen das zerkleinerte Gewebe mit zwei Volumina Kollagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben mit Hilfe von 10-ml-Messpipette. Das Gesamtvolumen wird dreimal das Volumen von Fett in Schritt gemessen Gewebe 4.3. Führen Gewebeverdauungs in einem Inkubator für 10 min unter kräftigem Rühren mittels einem automatisierten Rührer (Größe der magnetischen Rührstab: 25 mm) bei 37 ° C und befeuchtete atmosphärische Bedingungen mit 5% CO _2.
5. Beachten Sie einen kleinen Bruchteil (10 & mgr; l) des verdauten Gewebes unter dem Mikroskop, um zu beurteilen, ob die Verdauung gestoppt werden kann. Sicherzustellen , dass der Gärrest enthält hauptsächlich „freie“ ad-MVF neben Einzelzellen, die entsprechende Stelle , welche die enzymatische Verdauung zu stoppen (Abbildung 2).
   HINWEIS: Dieser Schritt erfordert Erfahrung mit dem Verfahren und ist von entscheidender Bedeutung für die Qualitätvon Ad-MVF isoliert. Längere Fettverdauung führt zu einer Einzelzellsuspension ohne Ad-MVF.
6. Neutralisieren des Enzyms mit zwei Volumina PBS / 20% FCS. Das Gesamtvolumen wird dreimal das Volumen der Zellgefäß Suspension in Schritt 4.4. Übertragen Sie die Zell-Schiff Suspension wieder in neue PP Rohren.
7. Inkubieren der Suspension für 5 min bei 37 ° C vom restlichen Fett durch die Schwerkraft ad-MVF zu trennen. Dann entfernen Sie vorsichtig den Hauptfettüberstand mit einem 1-ml pipettiert. Wiederholen Sie diesen Zyklus mehrmals mit einem 100-ul pipettiert, bis die Suspension fettfrei zu sein scheint.
8. Bringe einen 500-um-Filter auf einem konischen 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Übertragen der Zellengefäß Suspension mit einer 10-ml-Messpipette aus den 14-ml-PP-Rohren auf die Filtermembran verbleibende Fett Gerinnsel zu entfernen. Überträgt die filtrierte Suspension in neue 14-ml-PP-Röhrchen nach der Anzahl der einzelnen ad-MVF-Isolaten für die geplanten Experimente.
   HINWEIS: in vitro - Assays auf mikrovaskuläre Netzwerkbildung konzentriert, kann es von Vorteil sein , um die Zellsuspension Gefäß zu reinigen die Bildqualität während der mikroskopischen Analysen zu verbessern. Zu diesem Zweck kann die Suspension zusätzlich gefiltert einmal mit einem 20-um-Filter auf einzelne Zellen aus dem ad-MVF auf dem Filter gesammelt zu entfernen.
9. Zentrifugiere die Zellsuspension Gefäß (600 · g, 5 min, Raumtemperatur) zu erhalten, ein Pellet, die ad-MVF.
10. Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt, bis 1 ml verbleibt. Resuspendieren des Pellets mit ad-MVF in diesem 1 ml und überträgt die Suspension in eine 1,5-ml konischen Mikrozentrifugenröhrchen.
11. Zentrifugiere die ad-MVF Suspension in dem Mikrozentrifugenröhrchen (600 · g, 5 min) um ein Pellet zu erhalten.
12. Entfernen Sie den Überstand des Pellets in den gewünschten Endvolumen von PBS / 20% FCS resuspendieren.
    HINWEIS: Die Anzahl der Ad-MVF pro Isolat kann durch mikroskopische Zählung bewertet werden. Zu diesem Zweck 1/10 der endgültigen Zell-vessel Suspension wird 1:10 in PBS verdünnt, und 100 ul dieser Verdünnung werden in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Die gesamte Anzahl der Ad-MVF eine gefäßartige Morphologie aufweist, wird dann auf die gesamte Isolat gezählt und hochgerechnet. Die erforderliche ad-MVF Konzentrierung und Reinigung können einzeln in vitro an den jeweiligen angepasst werden oder in vivo Anwendung des ad-MVF. Dies kann für die in vitro - Analyse von mikrovaskulären Netzwerkbildung oder der Aussaat von ad-MVF auf Gerüste für die in - vivo - Implantation in Gewebsdefekten die Einbettung von ad-MVF in Kollagengelen umfasst.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie führten wir sechs Ad-MVF Isolierungsverfahren mit Fettgewebe von 7- bis 12-Monate alten männlichen Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse (mittleres Körpergewicht: 35 ± 1 g). Abbildung 1 zeigt die Ernte von murinen epididymal Fettpolstern mit anschließender mechanischer und enzymatischen Ad-MVF Isolation. Die Zeit für die Ernte von Fett erforderlich war 30 Minuten und für die Isolierung von Ad-MVF betrug 120 min. Insgesamt dauerte die Prozedur 150 min...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In dieser Studie stellen wir ein etabliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MVF. Ad-MVF Gewinnung von Maus-Fettgewebe ist ein einfaches Verfahren mit einigen kritischen Schritten. Mäuse zeigen verschiedene subkutane und intraabdominalem Fettdepots. Wie zuvor für Ratten beschrieben, ¹¹ die am besten geeignete Fettquelle für die Isolierung von Ad-MVF sind die epididymal Fettpolster aufgrund ihrer Größe, homogener Struktur und minimaler Kontamination mit größeren ^{Blutgefäßen,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)