בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.

Abstract

רשת כלי דם פונקציונלית היא בעל חשיבות המרכזית להישרדות והאינטגרציה של מבני רקמות מהונדסים. לשם כך, מספר אסטרטגיות אנגיוגנזה ו prevascularization הוקמו. עם זאת, רוב הגישות מבוססות תאים כוללות גוזלת זמן במבחנת צעדים ליצירת רשת כלי דם. לפיכך, הם אינם מתאימים נהלי צעד אחד תוך ניתוחיים. רקמת שומן הנגזרת שברי כלי דם (ad-MVF) מייצג יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות בקלות לבודד מרקמות שומן ולהציג מורפולוגיה microvessel פונקציונלית. יתר על כן, הם להרכיב מחדש במהירות לתוך רשתות כלי דם חדשות לאחר השתלת in vivo. בנוסף, אד-MVF הוכח לגרום lymphangiogenesis. לבסוף, הם מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal, אשר עשוי לתרום לפוטנציאל כלי הדם הגבוה שלהם. במחקרים קודמים אנו הדגמנו את vascularizati המדהיםעל יכולת של MVF מודעת תחליפי עצם ועור מהונדסים. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על פרוטוקול סטנדרטי עבור הבידוד אנזימטי של אד-MVF מרקמות שומן בעכברים.

Introduction

הנדסת רקמות מתמקדת הייצור של תחליפי רקמה ואיבר מקיימים, לשחזר או להגדיל את הפונקציה של שמיש ב עמיתיהם vivo ^{1, 2.} גורלם של מבני רקמות מהונדסים תלוי באופן מכריע על כלי דם הולם ^3. רשתות כלי דם בתוך המבנים האלה צריכים להיות מאורגנים באופן היררכי עם arterioles, נימים, ו venules לאפשר טפטוף דם יעיל אחרי inosculation אל כלי הדם של הנמען ^4. הדור של רשתות כאלה הוא בין האתגרים המרכזיים בתחום הנדסת רקמות. לשם כך, קשת רחבה של אסטרטגיות כלי דם ניסיוני כבר הציגה במהלך שני העשורים האחרונים ^{5, 6.}

גישות אנגיוגנזה לעורר את ingrowth של microvessels הנמען Tiss מהונדסיםUES באמצעות שינוי פיגום מבני או physicochemical, כגון השילוב של צמיחת גורמי ^7. עם זאת, עבור כלי דם של המבנים התלת-ממדי גדול, אסטרטגיות תלויי אנגיוגנזה מוגבלים במידה ניכרת בשיעורי צמיחה איטית של פיתוח microvessels ^8.

לעומת זאת, מושג prevascularization שואף עבור הדור של רשתות כלי דם פונקציונליות בתוך רקמת הבונה לפני ההשתלה שלהם ^9. Prevascularization הקונבנציונלי כרוך לתרבות המשותפת של תאים מייצרי כלי, כגון תאי אנדותל, תאי ציור קיר או תאי גזע ^10, בתוך פיגומים. לאחר היווצרות רשת כלי דם, מבני prevascularized לאחר מכן ניתן מושתלים לתוך פגמים ברקמות. ראוי לציון, גישת prevascularization זה קשה ליישם במסגרת רפואית, משום שהיא מבוססת על קומפלקס זמן רב במבחנה </ em> נהלים, אשר מוגבלים על ידי מכשולים רגולטוריים מרכזיים ^9. בהתאם לכך, יש עדיין צורך לפיתוח אסטרטגיות prevascularization רומן כי הם יותר מתאימים יישום קליני רחב.

אסטרטגיה כזו prevascularization עשויה להיות היישום של שברי כלי דם נגזר רקמה שומני (ad-MVF). אד-MVF מייצג יחידות של כלי דם חזקים כי ניתן לקצור בכמויות גדולות מרקמת השומן של חולדות ^{11, 12} ו עכברים ^13. הם מורכבים arteriolar, נימים, ומגזרי כלי venular, אשר מציגים מורפולוגיה microvessel פיזיולוגית עם לומן ותאי perivascular ייצוב ^{14, 15.} תכונה ייחודית זו מאפשרת ההשתלה המיידית של פיגומי אד-MVF זרע לתוך פגמי רקמות ללא precultivation. יש, במודעה-MVF במהירות להרכיב מחדש בלרשתות כלי דם פונקציונליות. יתר על כן, אד-MVF מייצג מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal ^16, אשר עשוי גם לתרום יכולת ההתחדשות הבולטת שלהם. בהתאם לכך, אד-MVF משמש יותר ויותר בתחומים שונים של הנדסת רקמות ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

בידודו של אד-MVF כבר נקבע במקור בחולדות ^{11, 12.} בזאת, אנו מתארים פרוטוקול, אשר מאפשר בידוד הסטנדרטי של MVF מודעה בעכברים מן רפידות שומן epididymal. זה עשוי לספק תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פונקציה אד-MVF באמצעות מודלים עכבר מהונדס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים בוצעו על פי המכון הלאומי הנחיות הבריאות לשימוש בחיות מעבדה ועקבו הנחיות מוסדיים (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, אבט. Lebensmittel- und Veterinärwesen, ה"צנטרלשטלה", זארבריקן, גרמניה).

1. הכנת מכשירים כירורגיים

1. שמור מוכנים מספריים לנתיחה, מלקחיים כירורגיים, מספרי הכנה קטנים, מלקחיים בסדר צלחת פטרי סטרילית עם 15 בינוני הנשר השונים של המ"ל Dulbecco (DMEM; 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), 100 פניצילין U / mL, 0.1 מ"ג / mL סטרפטומיצין עבור) קציר רפידות שומן epididymal.
2. לחשוף את מכשירי ניתוח לפתרון חיטוי עבור 5 דקות. לחלופין, לעקר אותם (עיקור קיטור; 121 ° C, 20 דקות).

2. בעלי חיים הרדמה

1. בחר בקפידה את זן של עכברים כמצוין לחקר ואת הנושא תחת חקירה.
   הערה: במחקר זה השתמשנו C57BL / 6 עכברי-בר זכר כתורמות עבור קצירת השומן epididymal. מעניין, אד-MVF ניתן לבודד גם מחלבון ניאון ירוק מהונדסות (GFP) חיות תורמות -positive (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) ^22. זו נושאת את היתרון העיקרי שרסיסי ניתנים לזיהוי בקלות על ידי מכתים immunohistochemical GFP לאחר ההשתלה לתוך עכברי-בר GFP שלילי ^14.
2. להרדים את החיות עם זריקה intraperitoneal של xylazine (15 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (75 מ"ג / ק"ג). ודא כי בעלי החיים מורדמים עמוק על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם כל תגובה. חומר סיכת עין אינה שמוזכר בתור החיות התורמות מוקרבות לאחר קצירת שומן.
   הערה: ודא כי שיכוך כאבים ועקר כירורגיים עולים בקנה אחד עם ההנחיות המתאימות של המדינה ואת המוסד שבו הניסויים מתוכננים.

le "> 3. קציר רפידות epididymal שומן

1. מעבירים את החיה אל שולחן הניתוח. מניחים את חיה במצב שכיבה תחת סטראו כירורגי לאשר הרדמה עמוקה באמצעות צביטה הבוהן.
2. לשתק את הכפות ידי מקליט אותם לעטוף כירורגית ולחטא את הבטן עם חיטוי פתרון.
3. הפרד את עור הבטן ללא שכבת השריר הבסיסית עם מספריים לנתיחה.
4. בצעו פיום קו האמצע עם מספריים לנתיחה ו רוחבית נפרשים סגר היטב את דופן הבטן.
5. בילטרלי לזהות האשכים, יותרת האשך ואת כרית שומן epididymal באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1). אל תפגעו מבני המעיים כדי למנוע זיהום צואתי של רפידות השומן.
6. קציר רפידות שומן epididymal עם מספרי הכנה קטנים מלקחי הקנס תחת סטראו. שמור מרווח ביטחון של כמה מ"מ בין יותרת האשך ואת השומןלהפחית את הסיכון של קצירת epididymal בשוגג.
   הערה: הליך זה יכול להתבצע גם ללא סטראו. עם זאת, זה עלול להגביר עוד יותר את הסיכון של פגיעה בשוגג של יותרת האשך ואת מיתרי הזרע.
7. העברת רפידות שומן epididymal לתוך צלחת פטרי המכילה 15 מיליליטר של DMEM מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס להובלה למעבדת התא.
8. להקריב את החיה על ידי חתך של אבי העורקים בבטן או נקע בצוואר הרחם.

בידוד 4. של אד-MVF

1. הכן שלוש מנות סטרילי פטרי עם 15 מ"ל של בופר פוספט (PBS), פוליפרופילן 14 מ"ל סטרילי (PP) צינורות, בקבוק 50 מ"ל Erlenmeyer סטרילית, צינורות microcentrifuge חרוטי 1.5-מ"ל סטרילי מספריים קנס מעוקר.
2. שלוש פעמים לשטוף את רפידות שומן בצלחות פטרי עם 15 מ"ל של PBS מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
3. מעבירים את השומן לתוך צינור 14 מ"ל PP. לקבוע את עוצמת הקול של רקמת שומן שנקטפה (ב מיליליטר) באמצעות tהוא בהיקף הצינור. לרכך את רקמת השומן מכאני עם המספריים בסדר עד השעית רקמה הומוגנית מתקבלת.
4. העברת רקמה טחון עם שני כרכים של collagenase NB4G (0.5 U / mL PBS) לתוך בקבוק 50 מ"ל Erlenmeyer באמצעות 10 מ"ל מדידת פיפטה. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את נפח רקמת שומן נמדדה צעד 4.3. בצע לעיכול רקמה באינקובטור במשך 10 דקות תחת בחישה נמרצת באמצעות בוחש אוטומטי (בגודל של בר ומערבבים מגנטי: 25 מ"מ) ב- 37 ° C ותנאים אטמוספריים humidified עם 5% CO _2.
5. שימו שבריר קטן (10 μL) של הרקמה מתעכל תחת מיקרוסקופ כדי לשפוט האם ניתן לעצור את תהליך העיכול. שיבטיח כי העיכול בעיקר מכיל "חינם" אד-MVF ליד תאים בודדים, המציין את הנקודה המתאימה כדי לעצור את תהליך עיכול אנזימטי (איור 2).
   הערה: שלב זה דורש ניסיון עם ההליך הוא קריטי לאיכותשל אד-MVF מבודד. ממושכת תוצאות עיכול שומן השעית תא בודד ללא פרסומות MVF.
6. לנטרל את האנזים עם שני כרכים של PBS / 20% FCS. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את עוצמת הקול של השעית תא-כלי בשלב 4.4. מעביר את השעית תא-כלי בחזרה לתוך צינורות PP חדשים.
7. לדגור על השעיית עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס להפריד אד-MVF מן הנותרים שומן על ידי כוח הכבידה. אז בזהירות להסיר את supernatant השומן העיקרי עם טפטף דיוק 1-מיליליטר. חזור על מחזור זה כמה פעמים עם טפטף דיוק 100-μL עד ההשעיה שנראית ללא שומן.
8. שים מסנן 500 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל. מעבירים את ההשעיה-כלי התא עם טפטפת מדידה 10 מ"ל מן הצינורות PP 14 מ"ל על הממברנה הסינון כדי להסיר הנותרים קרישי שומן. מעבירים את ההשעיה מסונן לתוך צינורות חדשים 14 מ"ל PP לפי מספר מודעה-MVF הפרט מבודד עבור הניסויים המתוכננים.
   הערה: ב vitrמבחני o התמקדות ביצירת רשת כלי הדם, זה עשוי להיות מועיל יותר כדי לטהר את ההשעיה-כלי התא כדי לשפר את איכות ההדמיה במהלך ניתוחים מיקרוסקופיים. לשם כך, על השעיית ניתן לסנן גם פעם עם מסנן 20 מיקרומטר להסיר תאים בודדים מהמודעה-MVF שנאספו על המסנן.
9. צנטריפוגה ההשעיה-כלי התא (600 XG, 5 דקות, בטמפרטורת החדר) כדי להשיג גלולה המכילה אד-MVF.
10. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant עד 1 מ"ל שנשאר. Resuspend גלולה עם אד-MVF ב 1 זה מ"ל ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חרוטית.
11. צנטריפוגה ההשעיה אד-MVF בצינור microcentrifuge (600 XG, 5 דק ') כדי להשיג גלולה.
12. הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף הסופי הנדרש של PBS / 20% FCS.
    הערה: מספר המודעה-MVF לכל לבודד ניתן להעריך על ידי ספירה מיקרוסקופית. לשם כך, 1/10 של התא-vesse הסופיl ההשעיה היא מדוללת 1:10 ב PBS ו 100 μL של דילול זה מועברים לתוך באר של צלחת 96-היטב. המספר השלם של אד-MVF מציג מורפולוגיה כלי דמוי נספר אז אקסטרפולציה לבודד כולו. ריכוז אד-MVF נדרש וטיהור ניתן להתאים באופן אישי את המתאימים במבחנה או ביישום vivo של אד-MVF. זה יכול לכלול את וההטבעה של MVF המודעה ג'ל קולגן לניתוח במבחנה של היווצרות רשת כלי דם או הזריעה של אד-MVF על פיגומים להשתלת in vivo לתוך פגמים ברקמות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר הנוכחי ביצענו שש פרוצדורות בידוד אד-MVF עם רקמת השומן בין 7 ל wild-type זכר בן 12 חודש C57BL / 6 עכברים (משקל הגוף הממוצע: 35 ± 1 g). איור 1 מדגים את הקצירה של רפידות שומן epididymal בעכברים עם בידוד מכנים האנזימטית שלאחר מכן אד-MVF. הזמן הדרוש קצירת השומן היה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ומבוסס על הבידוד של אד-MVF. קבלת פרסומות MVF מרקמות שומן בעכברים היא הליך פשוט עם כמה צעדים קריטיים. עכברים להפגין תת עורית שונה ופיקדונות שומן intraabdominal. כפי שתואר לעיל עבור חולדות, מקור שומן המתאים ביותר עבור בידוד של אד-MVF הם רפידות שומן epididyma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)