同种异体富血小板血浆 (PRP) 对大鼠分段腱愈合过程的影响: 方法学描述

摘要

本协议描述了大鼠经同种异体血小板丰富血浆 (PRP) 或盐水溶液取出部分跟腱后愈合肌腱的评价过程。采用不同类型的分析方法对肌腱愈合的进展进行评价。

摘要

本文介绍了用于观察 PRP 是否能对肌腱愈合有积极影响的实验程序。有4个主要步骤要遵循: 诱发跟腱损伤;准备 PRP 并注入 (或盐水溶液);取下肌腱;并进行生物力学、分子和组织学评价。在每个步骤中, 都详细描述了所有的过程和方法, 因此可以很容易地进行复制。

跟腱已经手术切片 (切除5毫米长的部分)。然后, 注射 prp 或生理盐水来研究 prp 是否对肌腱愈合有积极作用。三组40只动物 (共120只大鼠在本研究中使用) 分为2组: PRP 注射液组和生理盐水注射控制小组。大鼠在增加的时间点牺牲 (A 组: 5 天;B 组:15 天;C 组:30 天) 和肌腱被删除。90肌腱在进行 transcriptomic 分析前进行生物力学测试, 其余30肌腱提交组织学分析。

引言

凝血, 炎症过程和血小板的免疫调节作用是众所周知的¹。最近, 已经证明它们还具有恢复性属性^2,3。事实上, 在脱粒期间血小板释放各种细胞因子和生长因子 (VEGF、血小板因子、TGF、生长因子 I 和 HGF)。这些生长因子促进血管生成, 组织重塑和伤口愈合 (骨骼, 皮肤, 肌肉, 肌腱)²。离心自体血液产生血小板丰富的血浆 (PRP), 其中含有高血小板浓度取决于隔离方法 (3 和10倍的血液基线浓度)。事实上, 各种 PRP 制备技术不能提供相同的最终产品。到目前为止, 在这一问题上尚未达成国际普遍协议。总的来说, PRP 可能是治疗慢性肌肉骨骼疾病的一种有吸引力的治疗方案, 如肌腱、足底筋膜炎、骨关节炎和不愈合的⁴。它第一次用于口腔外科和种植⁴ , 以改善和加速骨愈合后放置一个牙科植入。在本研究中, 我们描述了一种可重现的方法, 允许获取 PRP 的动物实验⁴。

由于肌腱的损伤在运动员和体力工作者中经常被观察到, 加强愈合过程, 从而减少恢复的时间是非常感兴趣的⁵。新的治疗方法往往涉及使用生长因子, 而 PRP 的管理是一种简单和微创的方式, 以提供混合的内生生长因子⁴。

一些体外或动物研究表明, 通过释放生物介质来管理含有高水平血小板的血浆, 可以通过释放生物介质来刺激肌腱和韧带的修复^{6 ,7,8,9}。此外, 其他研究表明, PRP 可刺激肌腱细胞的 i 型和 III. 类胶原合成^9,10,11。也有人建议, PRP 可以减少基质金属蛋白酶的活化, 从而减少基体的降解。参与炎症过程的细胞可以产生 MMP-9, 它在炎症¹²引起的组织重塑 (生理学和病理) 中起着作用。

根据这一信息, 我们假设单个 PRP 注射到大鼠的跟腱, 可以改善修复组织的恢复过程和机械强度。这是通过测量愈合肌腱在恢复过程中的生物力学性质, 并通过进行组织学和分子分析, 以评估新形成的组织胶原重塑的测试。本研究的目的是观察单注射同种异体 PRP 是否会影响切片跟腱的愈合。

研究方案

对动物的护理和处理是按照国家科学院编写并由国家卫生研究院 (美国) 出版的《护理和使用实验动物指南》进行的。欧洲和国家立法得到了仔细的遵循。

1. 动物制剂

1. 使用 132 2 月大的雄性大大鼠重320-450 克 (120 只老鼠进行实验, 12 只老鼠进行血液取样,图 1)。基于 Dell¹³, 每个组的15只老鼠足够的功率为 0.8 (如果指定的效果存在, 则发现统计意义的概率 80%)。
2. 在传统的设施中, 所有的老鼠都在隔离的条件下, 在一个装有变站的常规设备里。在静脉 (单独通风的笼) 架上进行繁殖, 用 SPF (特定病原体免费) 大鼠被专门购买。
3. 使用以下住房条件: 温度范围从19-24 °c;相对湿度: 40-60%;通风: 空气更新频率: 每小时 10-15;光/暗循环:12 h-12 h。
4. 消毒所有锁定设备, 使用辐照床上用品。通过在笼子内放置无菌纸板托盘和毛巾系统地实施网箱浓缩。
5. 允许进入受限条件下的区域: 新的实验室大衣, 面具, 手套, 鞋类, 和头发帽在入口处。
6. 根据 Felasa¹⁴关于常规设施的建议, 每年对存放在肮脏床上用品上的定点动物进行菌落健康监测。保持四到五动物每笼, 与适当的辐照饮食和提供酸化水ad 随意。每日监控。
7. 转移大鼠选择的手术干预, 过滤顶笼到手术室2小时前手术。

2. 手术方法

1. 准备手术器械: 细剪刀, 钳, 两个止血钳, 和一个针架。在所有的程序, 戴手套, 面具, 罩, 和实验室大衣。
2. 将大鼠随机分为两组 (PRP 和盐水溶液)。
3. 把老鼠从笼子里拿出来称重。使用编号的耳朵标记来识别老鼠。为了避免眼部干燥, 请将 waterdrops 放在角膜上。
4. 麻醉鼠腹腔与甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 和氯胺酮 (80 毫克/公斤的体重)。要确认麻醉, 请将动物置于心肺监测之下, 检查是否有眼部反射。
5. 在颈部区域注射50µL 的丁丙诺啡 (0.01-0, 05 毫克/千克, 每8-12 小时) 作为止痛药。
6. 用电动剃须刀剃掉左后肢, 用 3 betadine/酒精 (稀释 1:10) 溶液的交替磨擦消毒, 然后将老鼠放在一个温暖的垫子上 (20 °c) 下解剖显微镜。将大鼠放在侧褥疮上, 用腿在上级位置进行手术。用手术钳握住爪子。
7. 使用剪刀, 在左跟腱周围的皮肤上做一个小的侧向切口 (20-25 毫米), 用细剪刀解剖筋膜以暴露跟腱复合体 (图 2a)。
8. 用剪刀把跖肌腱取下 (图 2b)。
9. 剪断跟腱横向5毫米到其跟骨插入, 并删除一个5毫米长的部分使用剪刀。不要缝合肌腱 (图 2c, 2d)。
10. 用可吸收纱缝合筋膜, 然后用 overjet 缝合 (连续缝合)。也可以使用单丝缝合, 防止皮肤进入手术切口。
11. 把老鼠放在加热灯下, 直到醒来, 然后把老鼠放回笼子里 (58 x 38 厘米) (不给出): 不进行固定化.

3. PRP 准备¹⁵

1. 麻醉甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 和氯胺酮 (80 毫克/千克体重) 的供体大鼠腹腔注射。PRP 注射液术后2小时进行, 无再麻醉。
2. 注射50µL 的丁丙诺啡作为止痛药。
3. 收集全血 (每只老鼠20毫升, 最终出血) 的心脏穿刺到含有3.2% 缓冲柠檬酸钠 (0.109 米, 抗凝血) 的不育管。然后用心内注射弄死大鼠。
4. 为了获得 PRP, 将血液离心10分钟, 在 150 x g 和室温。这一初始的低速离心步骤产生两个不同的阶段: 一个较低的阶段, 由红细胞 (红细胞) 占总体积的约 80-90%, 和一个上阶段由富含血小板的血浆 (PRP) (通常为10-20% 的血液示例)。
5. 使用塑料转移吸管轻轻地将 PRP (上部相) 收集在二次塑料管上。由于 PRP 与红细胞之间的界面非常松散, 不能使吸管太靠近界面。如果处理得当, 在 PRP 中污染红细胞应低于 0.05 x 10³单元格/µL. 丢弃余下的下部和原血收集管。
6. 确定收集的 PRP 的体积和测量血液分析仪的血小板计数。在接下来的步骤中, 需要使用这些值来调整血小板浓度。血液细胞计数也是有用的评估潜在的污染与红细胞和 WBCs. 在 PRP 的血小板浓度在这个阶段通常是 1-1.5 x10⁶/µL。
7. 在 1000 x g 和室温下进行10分钟的 PRP 第二次离心。这种高速离心步骤产生松散的血小板颗粒和上清, 由自体血小板贫乏血浆 (PPP) 组成。使用步骤3.6 中确定的值, 计算要丢弃的上清液的体积, 以浓缩 PRP 并达到 2.5 x10⁶/µL 的最终浓度。
8. 使用塑料转移吸管轻轻地在二级塑料管中收集上清 (PPP), 在步骤3.7 中计算最终体积的大约两个。由于颗粒松散, 当 PPP 被丢弃时, 大量的血小板丢失, 因此有可能减少最终所需的浓度。
9. 用温和重复的吹打仔细并用重悬血小板颗粒与剩余清液。测量这个浓缩的 PRP 的血小板计数。如果需要, 添加适当体积的自体 PPP 达到最终目标浓度。
   注: 使用 PRP 在3小时内准备。
10. 添加50µL 的 CaCl₂ (11 mEq 10 毫升) 每毫升 PRP 激活血小板。
11. 将50µL 的新鲜 PRP 或盐水溶液与21G 针直接插入缝合手术部位, 约1小时后进行准备。在这段时间, 保持 PRP 在室温下。
12. 在手术后和跟腱切除前密切监测大鼠的功能恢复。

4. 切除跟腱和生物力学测试¹⁶

1. 5、15或30天后⁵, 对老鼠进行称量。然后, 麻醉与甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 和氯胺酮 (80 毫克/千克体重) 腹腔注射。
2. 注射50µL 的丁丙诺啡作为止痛药。在牺牲动物之前去掉肌腱, 尽可能长时间保持生理条件。
3. 剃掉左后肢, 把老鼠放在解剖显微镜下。将大鼠放在侧褥疮上, 用腿在上级位置进行手术。用手指握住爪子。
4. 在前一个手术部位做一个小切口 (10 毫米), 并延伸至三头肌 suralis 暴露。
5. 为了去除跟腱的愈合, 将跟骨横向5-10 毫米的跟腱连接。然后解剖一个部分的三头肌 suralis, 这是附加到跟腱 (图 3b)。肌肉部分必须足够大, 以适应低温颚 (图 3c-d)。使用镊子将样品立即放入冷冻颚 (图 3e)。
6. 切除肌肌腱-骨复合物后, 弄死大鼠心内注射戊巴比妥 (200 毫克/千克)。通过评估心脏节律和呼吸缺乏15分钟来确认死亡。
7. 将肌肉单元放入下颚 (图 3e), 关闭它并垂直放置到通用测试机 (106.2 kN,图 3a)。然后在机器的下部夹具之间修复骨骼 (图 3f)。
8. 在上颌骨的两个盆地中加入液氮, 以冻结肌肉, 使其在拉伸试验期间不变形, 比肌腱坚硬。
9. 当冻结区到达金属夹边时, 开始拉伸试验, 这样肌腱就能保持其结构。将机器的位移率设定在1毫米/秒的恒定速度直到破裂。记录在计算机上牛顿 (N) 给出的极限抗拉强度 (众信)。
10. 要计算横截面积, 请将两个相机垂直放置, 形成椭圆形形状, 拍照。
11. 为了解释愈合肌腱横截面积的差异, 将众信正常化为单位面积 (N 每平方毫米), 代表组织所经历的机械应力。

5. 组织学分析

注: 每组15肌腱进行组织学分析。

1. 切除后, 立即将跟腱浸入4% 多聚甲醛以保持其结构 (1 毫米的组织每小时固定, 所以固定时间因肌腱大小而异)。
2. 用70% 乙醇代替多聚甲醛, 在这个溶液中至少留出一晚。
3. 将肌腱放在一个带有孔的小塑料容器中, 然后将该容器放入新鲜的70% 乙醇溶液中1小时。
4. 将容器放置在95% 乙醇中, 重复1小时。
5. 将容器放置在100% 乙醇中, 重复1小时。
6. 将容器放置在100% 二甲苯中, 重复1小时。
7. 现在安置塑料容器, 包含肌腱, 在液体石蜡 (56 °c) 和离开它隔夜。
8. 使用嵌入站 (配有熔融蜡、热板和冷板), 选择最适合组织样品的金属模具, 然后用少许液体石蜡填充它, 以使底座覆盖。
   注: 定位样品以获得切片的垂直剖面。
9. 当样品正确定位时, 用液体石蜡将模具填满, 放到冷冻机上。让它冷却至少15分钟。
10. 从石蜡块中取出, 放在冰上至少30分钟。
11. 准备几张干净的玻璃滑梯, 把一些去离子水滴在他们身上。
12. 在切片, 削减5µm 部分的区块 (只使用部分从肌腱的中部), 并将该节放在幻灯片上。
13. 将幻灯片放在65摄氏度的加热烤箱中, 使石蜡开始融化, 将组织粘到玻璃上。
14. 将含有石蜡切片的幻灯片放在切片架中。
15. 现在 deparaffinize 和水化组织通过放置在以下连续的浴池:
    8分钟在二甲苯 (浴 1)
    4分钟在二甲苯 (浴 2)
    2分钟100% 乙醇
    2分钟95% 乙醇
    2分钟70% 乙醇
    去离子水2分
16. 对于苏木精-伊红染色, 将组织置于下列溶液中。
    1. 将组织浸泡在苏木精溶液中8分钟 (1 克苏木精一水合物, 0.2 g 克钦体₃, 50 克 AIK (所以₄)₂. 12H₂O; 200 毫升甘油; 用蒸馏水调整至1升)。
    2. 在自来水下浸泡8分钟的组织。
    3. 将组织浸泡在三十年代的伊红溶液中 (0.25% 在100毫升蒸馏水中含有200µL 的未稀释醋酸)。
    4. 在自来水下浸泡2分钟的组织。
17. 对于马尾松的三色染色, 请按照下列步骤操作。
    1. 在补液后, 将各部分放置在带有铁明矾的容器中 (0.5 克 (NH₄) Fe (因此₄)₂. 12H₂o 在10毫升 H₂o) 并关闭容器。用微波炉加热3分钟, 280 瓦特。
    2. 让它冷却一分钟, 然后用去离子水冲洗。
    3. 将节放在一个封闭的容器中, Regaud 的苏木精溶液 (0.5 克苏木精溶解在50毫升 H₂O 在50°c, 然后添加5毫升95% 乙醇和5毫升甘油), 加热它九十年代在 280 W。
    4. 用去离子水冲洗。
    5. 将剖面放置在苦味酸酸溶液中 (在甲醇饱和度) 为3分钟, 在运行自来水下冲洗5分钟, 然后将其放在去离子水中几秒钟。
    6. 现在放置在酸性品红 (0.5 克50毫升 H₂O 包含0.25 毫升未稀释的乙酸) 为 5 s 和冲洗在自来水下, 直到染料消失。
    7. 在钼酸溶液中孵育切片 (0.5 克, 50 毫升 H₂O) 为5分钟, 将其放在去离子水中几秒钟。
    8. 将各节置于浅绿色 (0.5 克50毫升 H₂O, 含有0.25 毫升未稀释醋酸) 溶液, 另5分钟, 并将其置于自来水中, 直到染料消失。
18. 现在再次脱水组织。
    1. 将切片浸入70% 乙醇中1分钟。
    2. 将切片浸入95% 乙醇中1分钟。
    3. 将切片浸入100% 乙醇中1分钟。
    4. 将该剖面浸入二甲苯 (浴 1) 中1分钟。
    5. 将该剖面浸入二甲苯 (浴 2) 中1分钟。
    6. 拆卸部分, 而不去除过多的二甲苯, 并在样品上放一滴安装介质。
    7. 在上面放一个盖玻片 (不引发任何气泡), 让它硬化至少2小时。
    8. 水解 6% HCl 中每组5个组织学切片 (每个不同的肌腱), 并测定胶原蛋白的浓度, 方法是在5µm 无瑕切片中测定羟脯氨酸作为指数。
19. 使用制造商的软件对分区区域的结果进行规范化。
20. 通过计算机辅助分析, 对部分带有浅绿色染色的部分进行染色, 以可视化和量化纤维胶原蛋白。
21. 扫描各部分, 并使用 IrfanView 软件转换为灰色细微差别的图片。使用软件进行半量化 (例如, 数量一)。

6. 分子评价

1. 肌腱破裂后, 在机械测试发生, 采取的样品, 捕捉冻结他们在液氮, 并储存在-80 °c (PRP 和盐水溶液)¹⁷。
2. 使用商业总 rna 套件隔离总 rna¹⁷。
3. 通过 rt-pcr^17,18, 测量胶原蛋白 (i. 和 III.)、基质金属蛋白酶 (MMP-2、MMP-3 和 MMP-9) 和 tenomodulin (TNMD) 的表达。
4. 将 mRNA 的表达式级别规范化为 28S¹⁹的级别。

结果

结果以平均标准偏差表示, 并与方差分析进行了比较。使用了双向方差分析和后端测试 de Scheffé (即参数测试)。

引起大鼠非损伤性跟腱断裂的最终抗拉强度为 42.0, 5.7 n (n = 10)。5天后, 两组抗拉强度显著增加 (p < 0.0001)。对照组比较, 在任何时间测量, 特别是在15和30天, PRP 组的信众均较高。通过测量在进行生物力学评估前被...

讨论

血小板对肌腱愈合过程的早期炎症期至关重要。当这些血小板暴露于结合组织或诱发凝血的因素时, 它们将释放在α颗粒中储存的生长因子。由于这种相互作用, 胞外基质大分子综合升华, 间充质细胞增殖。血小板也有一个趋化活性的祖细胞在血液循环, 增强血管生成和刺激细胞分化^6,20。

生物力学测试是使用专门为体外拉伸试验的大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine (Xyl-M)	VMD	none	anesthetic
Ketamin (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	none	anesthetic
Buprenorphin (Vetergésic Multidosis)	ALSTOE	none	Painkiller
iso-Betadine	MEDA-Pharma	none	Desinfectant
resorbable yarn Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	none	Anesthetic
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Preserves structure of the tissue
Isopropanol 100%	VWR	20,922,364
Ethanol 95%	VWR	20,823,362
Xylene	VWR	28973.363
Paraffin	VWR	LEIC3950.1006
Hematoxylin	Millipore	1.15938.0025	Colorant
Eosin	Millipore	1.15935.0100	Colorant
Eukitt	Sigma-Aldrich	3989	Mounting Medium
CaCl2