Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

Resumo

Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.

Resumo

Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados para observar se PRP pode afetar positivamente o tendão cicatrização. Há 4 etapas principais a seguir: induzir uma lesão no tendão de Aquiles; preparar o PRP e injetá-lo (ou a solução salina); remover o tendão; e realizar avaliações biomecânicas, moleculares e histológicas. Em cada etapa, todos os procedimentos e métodos são descritos em detalhe, para que possam ser reproduzidos facilmente.

Tendões de Aquiles tem sido seccionada cirurgicamente (remoção de uma seção longa de 5 mm). Depois, PRP ou solução salina foi injetada para estudar se o PRP tem um efeito positivo sobre a cicatrização do tendão. Três grupos de 40 animais (um total de 120 ratos foram utilizados neste estudo) foram subdivididos em 2 subgrupos: grupo de controle grupo de injeção de PRP e uma injeção de solução salina. Ratos foram sacrificados em aumentar os pontos de tempo (grupo r: 5 dias; Grupo b: 15 dias; Grupo c: 30 dias) e tendões foram removidos. 90 tendões foram submetidos a testes biomecânicos antes de executar a análise de transcriptomic e os 30 restantes tendões foram submetidos à análise histológica.

Introdução

Coagulação, processos inflamatórios e as funções de modulação da imunidade de plaquetas são conhecidos¹. Mais recentemente, foi demonstrado que eles também têm propriedades restauradoras^2,3. Na verdade, vários fatores citocinas e crescimento (VEGF, PDGF, TGF-B e IGF-I e HGF) são liberados pelas plaquetas durante a degranulação. Estes fatores de crescimento promovem a angiogênese, remodela o tecido e ferida de cura (ossos, pele, músculo, tendão)². Centrifugação de sangue autólogo produz plasma rico plaquetas (PRP) que contém concentrações de plaquetas alta dependendo do método de isolamento (entre 3 e 10 vezes sangue concentrações de linha de base). De fato, várias técnicas de preparação do PRP não podem fornecer um produto final idêntico. Até agora, não houve nenhum acordo geral internacional sobre esta questão. No geral, o PRP pode ser uma atraente opção terapêutica no tratamento de condições crônicas músculo-esqueléticas, tais como tendinopatia, fascite plantar, osteoartrite e pseudartrose⁴. Foi usado pela primeira vez em cirurgia oral e Implantologia⁴ para melhorar e acelerar a consolidação depois de colocar um implante dentário. Neste estudo, descrevemos um método reprodutível que permite a aquisição de PRP para experimentação animal⁴.

Desde lesões dos tendões são frequentemente observadas em esportistas e trabalhadores físicos, reforçar o processo de cura e reduzindo o tempo de recuperação são de grande interesse⁵. Novos métodos de tratamento que estão desenvolvendo frequentemente envolvem o uso de fatores de crescimento, e a administração do PRP é uma maneira simples e minimamente invasiva para entregar uma mistura de fatores de crescimento endógeno⁴.

Vários estudos em vitro ou em animais demonstraram que a administração de plasma que contém um alto nível de plaquetas, liberando mediadores biológicos, pode estimular a reparação do tendão e ligamento pela liberação de mediadores biológicos^{6 ,7,8,9}. Além disso, outros estudos têm mostrado que o PRP pode estimular tipo eu e a síntese de colágeno III no tendão células de^10,9,11. Também tem sido sugerido que o PRP pode diminuir a ativação de metaloproteinases de matriz (MMPs) e, portanto, reduzir a degradação da matriz. As células que estão envolvidas no processo de inflamação podem produzir MMP-9, que desempenha um papel no tecido remodelação (fisiológica e patológica) induzida por inflamação¹².

Com base nesta informação, formulamos a hipótese que uma única injeção de PRP para os tendões de Aquiles seccionados de ratos poderia melhorar o processo de recuperação e a resistência mecânica do tecido reparado. Isso é testado medindo as propriedades biomecânicas dos tendões curativas durante o processo de recuperação e realizando análises histológicas e moleculares para avaliar colágeno remodelando o tecido recém-formado. O objetivo do estudo foi observar se uma única injeção de células alogénica PRP poderia influenciar a cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados.

Protocolo

Cuidados e tratamento dos animais foram realizados em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos institutos nacionais de saúde (EUA). Legislação europeia e nacional foram seguidas com cuidado.

1. preparação animal

1. Use 132 ratos Sprague-Dawley machos 2 - meses de idade pesando 320-450 g (120 ratos para experimentação) e 12 ratos para amostragem de sangue, Figura 1. Com base na Dell¹³, 15 ratos para cada grupo foi o suficiente para uma potência de 0.8 (80% de chance de encontrar significância estatística, se existir o efeito especificado).
2. Todos os ratos em gaiolas clássicas em condições de isolamento em uma instalação convencional equipado com uma estação de mudança de casa. Instigar a reprodução em um rack IVC (gaiola ventilada individualmente), com ratos SPF (livre de patógenos específicos) especificamente ser comprados.
3. Use as seguintes condições de habitação: escala de temperatura de 19-24 ° C; umidade relativa: 40-60%; ventilação: frequência de renovação de ar: 10-15 por h; o ciclo claro/escuro: 12 h - 12 h.
4. Esterilizar todos os equipamentos de enjaulamento e usar roupa de cama irradiada. Sistemicamente implemente o enriquecimento de gaiola, colocando toalhas e bandejas de papelão estéril dentro de jaulas.
5. Permitir o acesso à zona sob condições restritas: chapéu casaco, máscara, luvas, calçados e cabelo do novo laboratório na entrada.
6. Realizar monitoramento de integridade de colônia na sentinela animais alojados na roupa de cama suja numa base anual, de acordo com as recomendações de¹⁴ Felasa para instalações convencionais. Manter animais de quatro a cinco por gaiola, com o apropriado irradiados e fornecem dieta acidificadas água ad libitum. Monitore diariamente.
7. Transferência de ratos eleitos para intervenção cirúrgica na filtragem superiores gaiolas para as salas cirúrgicas 2 h antes da cirurgia.

2. ato cirúrgico

1. Preparar os instrumentos cirúrgicos: finas tesoura, uma pinça, duas Pinças hemostáticas e um porta-agulha. Durante todos os procedimentos, use luvas, máscara, uma capa e um jaleco.
2. Aleatoriamente, divida os ratos em dois grupos (PRP e solução salina).
3. Leve o rato sair da jaula e pesá-lo. Use marcas auriculares numerada para identificar os ratos. Para evitar a dessecação dos olhos, coloque gotas de água sobre a córnea.
4. Anestesia o rato intraperitonealmente com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal). Para confirmar anesthetization, coloque os animais sob monitorização cardio-respiratória e verificar se há quaisquer reflexos do olho.
5. Injetar 50 µ l de buprenorfina por via subcutânea (0,01-0,05 mg/kg cada 8-12 h) na área do pescoço como um analgésico.
6. O membro posterior esquerdo a barba com um barbeador elétrico, desinfectá-la com 3 alternando uniforme de solução de álcool/iso-betadine (diluídos 01:10) e coloque o rato sobre uma almofada quente (20 ° C) sob um microscópio de dissecação. Coloque o rato em decúbito lateral com a perna a ser operado em uma posição superior. Segure a pata com pinça cirúrgica.
7. Usando a tesoura, faça uma pequena incisão lateral (20-25 mm) na pele ao redor do tendão de Aquiles esquerdo e dissecar a fáscia usando tesouras bem para expor o tendão de Aquiles complexo (Figura 2a).
8. Retire o tendão plantar com uma tesoura (Figura 2b).
9. Cortar o tendão de Aquiles transversalmente 5mm proximais à sua inserção no calcâneo e remover a porção longa de 5 mm, usando uma tesoura. Não sutura do tendão (Figura 2C, 2d).
10. A fáscia e, em seguida, a pele da sutura com fios absorvíveis, fazendo uma sutura overjet (sutura contínua). Suturas monofilamento podem ser usadas também para evitar a absorção da pele para a incisão cirúrgica.
11. Coloque o rato sob uma lâmpada de aquecimento até acordado e, em seguida, coloque o rato em uma gaiola (58 x 38 cm) (Nota bene: não imobilização é imposta).

3. PRP preparação¹⁵

1. Anestesia os ratos de doador com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal. A injeção de PRP é realizada por 2 h no pós-operatório sem qualquer re-anestésico.
2. Injecte por via subcutânea 50 µ l de buprenorfina como um analgésico.
3. Colher o sangue total (20 mL por rato, sangramento final) por punção cardíaca em tubos estéreis contendo 3,2% tamponada de citrato de sódio (0,109 M, anticoagulante). Então eutanásia o rato por Injeção intracardíaca.
4. Para obter o PRP, centrifugar o sangue durante 10 minutos a 150 x g e temperatura de quarto. Esta etapa de centrifugação inicial baixa velocidade produz duas fases distintas: uma fase inferior, que consiste de glóbulos vermelhos (hemácias) que é responsável por cerca de 80-90% do volume total e uma fase superior consistindo de plasma rico em plaquetas (PRP) (tipicamente 10-20% do sangue amostra).
5. Delicadamente, colete o PRP (fase superior) em um tubo de plástico secundário usando uma pipeta de transferência plástica. Como a interface entre o PRP e células vermelhas do sangue está muito solta, não pipete demasiado perto para a interface. Quando tratada adequadamente, contaminar hemácias em PRP deve estar abaixo de 0,05 x 10³ células / µ l. descarte a fase inferior restante e o tubo de coleta primária de sangue.
6. Determinar o volume de PRP coletado e medir a contagem de plaquetas em um analisador de hematologia. Esses valores são necessários para os cálculos ajustar a concentração de plaquetas na próxima etapa. Uma contagem de células do sangue também é útil para avaliar o potencial de contaminação com hemácias e a concentração de glóbulos brancos. plaquetas no PRP nesta fase é tipicamente 1-1.5 x10⁶/µL.
7. Realize uma segunda centrifugação do PRP durante 10 minutos a 1.000 g de x e a temperatura ambiente. Esta etapa de centrifugação de alta velocidade produz uma pelota de plaquetas solto e um sobrenadante consistindo de autólogo plasma pobre em plaquetas (PPP). Usando os valores determinados no passo 3.6, calcular o volume de sobrenadante para ser Descartado para concentrar o PRP e chegar a uma concentração final de 2.5 x10⁶/µL.
8. Delicadamente, recolha o sobrenadante (PPP) em um tubo de plástico secundário usando uma pipeta de transferência plástica, deixando cerca de dois terços do volume final calculado na etapa 3.7. Como a pelota é solta, uma quantidade significativa de plaquetas é perdida quando PPP é descartada, portanto, potencialmente reduzindo a concentração final desejada.
9. Cuidadosamente resuspenda o pellet de plaquetas com o restante sobrenadante por pipetagem repetidas suave. Medir a contagem de plaquetas no PRP concentrado. Se necessário, adicione o volume apropriado de PPP autólogo para atingir a concentração alvo final.
   Nota: Use o PRP até 3 horas após preparação.
10. Adicionar 50 µ l de CaCl₂ (11 mEq 10ml) por mL de PRP para ativar as plaquetas.
11. Injete 50 µ l de PRP fresco ou solução salina com uma agulha 21G diretamente no local da operação suturado cerca de 1h após a preparação. Durante este tempo, manter o PRP em temperatura ambiente.
12. Acompanhar a recuperação funcional dos ratos de perto durante os dias após a cirurgia e antes da remoção do tendão de Aquiles.

4. remoção do tendão de Aquiles e testes biomecânicos¹⁶

1. 5, 15 ou 30 dias depois⁵, pesar o rato. Em seguida, anestesiamos com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal.
2. Injecte por via subcutânea 50 µ l de buprenorfina como um analgésico. Retire o tendão antes de sacrificar o animal para manter as condições fisiológicas para contanto que possível.
3. Raspar o membro posterior esquerdo e colocar o rato sob um microscópio de dissecação. Coloque o rato em decúbito lateral com a perna a ser operado em uma posição superior. Segure a pata com os dedos.
4. Faça uma pequena incisão (10 mm) no site da operação anterior e estender até a suralis de tríceps é exposta.
5. Para remover o tendão de Aquiles a cura, corte o osso calcâneo transversalmente de 5-10 mm distal para sua fixação do tendão de Aquiles. Então disse uma parte do tríceps suralis, que é anexado ao tendão de Aquiles (Figura 3b). A parte do músculo tem que ser grande o suficiente para caber na cryo-mandíbula (Figura 3 c-d). Colocar a amostra imediatamente para o cryo-mandíbula usando fórceps (Figura 3e).
6. Depois de remover o complexo músculo-tendão-osso, eutanásia o rato por Injeção intracardíaca com Nembutal (200 mg/kg). Confirme a morte, avaliando a ausência de ritmo cardíaco e a respiração durante 15 min.
7. Coloque a unidade do músculo na mandíbula superior (Figura 3e), fechá-lo e colocá-lo verticalmente em uma máquina de teste de universal (106,2 kN, Figura 3a). Em seguida fixe o osso entre as pinças inferiores da máquina (Figura 3f).
8. Adicione nitrogênio líquido em ambas as bacias do maxilar superior para congelar o músculo, que é uma ordem de magnitude mais duro que o tendão e não se deforma durante o ensaio de tracção.
9. Quando a zona de congela atinge a borda da braçadeira de metal, começa o ensaio de tracção, o tendão vai preservar a sua estrutura. Defina a taxa de deslocamento da máquina a uma velocidade constante de 1 mm/s até a ruptura. Grave a resistência à tração (UTS) dada em Newtons (N) em um computador.
10. Para calcular a área de seção transversal, coloque duas câmeras perpendiculares uns aos outros, formando uma forma elíptica e tirar fotos.
11. Para compensar a diferença de área transversal dos tendões curativas, normalize as UTS para uma unidade de área (N por milímetro quadrado), que representa o esforço mecânico experimentado pelo tecido.

5. histológica análise

Nota: 15 tendões de cada grupo foram submetidos a análise histológica.

1. Após sua remoção, mergulhe imediatamente em paraformaldeído 4%, para preservar a sua estrutura, o tendão de Aquiles (1mm de tecido é fixado por hora, então o tempo de fixação varia de acordo com o tamanho do tendão).
2. Substituir o paraformaldeído por etanol a 70% e deixar a amostra pelo menos uma noite nesta solução.
3. Coloque o tendão em um pequeno recipiente de plástico com furos e coloque o recipiente em uma solução de etanol 70% fresca por 1h.
4. Coloque o recipiente em etanol a 95% por 1 h. repetir.
5. Coloque o recipiente em etanol 100% para 1 h. repetir.
6. Coloque o recipiente em 100% de xilol por 1 h. repetir.
7. Agora coloque o recipiente de plástico, que contém o tendão, em parafina líquida (56 ° C) e deixe durante a noite.
8. Usando uma estação de encaixe (equipada com cera derretida, um prato quente e um prato frio), escolher um molde metálico que melhor se adapta a amostra de tecido e encha-o com parafina líquida um pouco para que a base é coberta.
   Nota: Oriente a amostra para obter as seções verticais no micrótomo.
9. Quando a amostra está corretamente posicionada, encher o molde com parafina líquida e coloque-a sobre a máquina de refrigerante. Deixe arrefecer durante pelo menos 15 minutos.
10. Retire o bloco de parafina e coloque-o no gelo pelo menos 30 min.
11. Preparar várias lâminas de vidro limpas e lhes colocamos algumas gotas de água desionizada.
12. No micrótomo, cortar os blocos em seções de 5 µm (só uso seções da parte média do tendão) e colocar a seção em um slide.
13. Coloque os slides em um forno de aquecimento a 65 ° C por vários minutos, para que a parafina só começa a derreter para unir o tecido para o vidro.
14. Coloque os slides contendo cortes de parafina em um suporte de fatia.
15. Agora deparaffinize e Re-hidratar o tecido, colocando-o nos seguintes banhos sucessivos:
    8 min em xilol (banho 1)
    4 min em xilol (2 de banho)
    2 min em etanol 100%
    2 min em etanol a 95%
    2 min em etanol a 70%
    2 min em água desionizada
16. Para coloração de hematoxilina-eosina, coloque o tecido nas seguintes soluções.
    1. Mergulhe o tecido durante 8 min em solução de hematoxilina (monohidrato de hematoxilina de 1g, 0,2 g KIO₃, 50g AIK (SO₄)₂.12h₂O; glicerina 200ml; ajustar para 1 L com água destilada).
    2. Mergulhe o tecido durante 8 min sob água corrente.
    3. Mergulhe o tecido por 30 s em solução de eosina (eosina 0,25% em 100 mL de água destilada contendo 200 µ l de não diluída de ácido acético).
    4. Mergulhe o tecido por 2 min sob água corrente.
17. Para coloração tricromo de Masson, siga estas etapas.
    1. Após a reidratação, colocar as seções em um recipiente com alúmen de ferro (0,5 g (NH₄) Fe (SO₄)₂.12h₂O em 10 mL de H₂O) e feche o recipiente. Aqueça-o por 3 min em 280 W em um microondas.
    2. Deixe esfriar por um minuto e em seguida, enxágue-o com água desionizada.
    3. Colocar as seções em um recipiente fechado com solução de hematoxilina de Regaud (hematoxilina de 0,5 g dissolvida em 50 mL de H₂O a 50 ° C, em seguida, adicione 5 mL de etanol 95% e glicerina 5 mL), aquecê-lo por 90 s em 280 w.
    4. Enxágue com água desionizada.
    5. Colocar as seções em uma solução de ácido pícrico (a saturação em metanol) por 3 min, enxaguar por 5 min sob água corrente e coloque-o em água desionizada durante alguns segundos.
    6. Agora, colocar as seções em fucsina ácida (0,5 g em 50 mL de H₂O contendo 0,25 mL de ácido acético diluído) durante 5 segundos e enxaguar sob água corrente até que a tinta desapareça.
    7. Incubar as secções em solução de ácido fosfomolíbdico (0,5 g em 50 mL de H₂O) por 5 min, coloque-o por alguns segundos em água desionizada.
    8. Colocar as seções em solução de luz verde (0,5 g em 50 mL de H₂O contendo 0,25 mL de ácido acético diluído) por mais 5 minutos e coloque-o sob água corrente até que a tinta desapareça.
18. Agora desidrate o tecido novamente.
    1. Mergulhe a seção por 1 min em etanol a 70%.
    2. Mergulhe a seção por 1 min em etanol a 95%.
    3. Mergulhe a seção por 1 min em 100% de etanol.
    4. Mergulhe a seção por 1 min em xilol (banho 1).
    5. Mergulhe a seção por 1 min em xilol (2 de banho).
    6. Remova as seções sem retirar demais xileno e coloque uma gota de meio de montagem na amostra.
    7. Colocar uma lamela por cima (sem provocar quaisquer bolhas) e deixe endurecer pelo menos 2 h.
    8. Hidrolisar 5 cortes histológicos (cada um de um tendão diferente) de cada grupo em 6 N HCl para 3h e determinar a concentração de colágeno medindo hidroxiprolina como um índice em 5 seções µm inocente.
19. Normalize os resultados por área de seção utilizando o software do fabricante.
20. Mancha de algumas seções com luz verde mancha para visualizar e quantificar fibrillar colágeno por análise de computador assistida.
21. Digitalizar as seções e converter as fotos em nuances de cinza usando o software IrfanView. Use o software para quantificação semi (por exemplo, uma quantidade).

6. molecular avaliação

1. Após a ruptura do tendão, que ocorre durante o ensaio mecânico, tirar as amostras, snap congelá-los em nitrogênio líquido e armazená-los no-80 ° C (PRP e solução salina)¹⁷.
2. Use um kit de RNA Total comercial para isolar de RNA total¹⁷.
3. Medir a expressão de colágeno (Col I e III Col), matriz metaloproteinases (MMP-2, MMP-3 e MMP-9) e tenomodulin (TNMD) por RT-PCR^17,18.
4. Normalize os níveis de expressão de RNAm para os níveis de 28S¹⁹.

Resultados

Os resultados são expressos como o média ± desvio-padrão da média e foram comparados com a análise de variância (ANOVA). Uma ANOVA bidirecional e post hoc testam de Scheffé, que é um teste paramétrico, foram usados.

A resistência à tração (UTS) necessária para provocar uma ruptura dos tendões de Aquiles não-feridas de ratos foi 42.0 ± 5,7 N (n = 10). A resistência à tração aumentou significativamen...

Discussão

As plaquetas são essenciais para a fase inflamatória inicial do tendão processo de cura. Quando estas plaquetas estão expostas a um tecido ou fatores que induzem a coagulação, liberam fatores de crescimento que são estocados em grânulos α. Devido a essa interação, macromoléculas da matriz extracelular são synthetized e células mesenquimais proliferam. As plaquetas também têm uma atividade quimiotáctica em células progenitoras a circulação de sangue, aumentando a angiogênese e estimulando a diferencia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine (Xyl-M)	VMD	none	anesthetic
Ketamin (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	none	anesthetic
Buprenorphin (Vetergésic Multidosis)	ALSTOE	none	Painkiller
iso-Betadine	MEDA-Pharma	none	Desinfectant
resorbable yarn Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	none	Anesthetic
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Preserves structure of the tissue
Isopropanol 100%	VWR	20,922,364
Ethanol 95%	VWR	20,823,362
Xylene	VWR	28973.363
Paraffin	VWR	LEIC3950.1006
Hematoxylin	Millipore	1.15938.0025	Colorant
Eosin	Millipore	1.15935.0100	Colorant
Eukitt	Sigma-Aldrich	3989	Mounting Medium
CaCl2