Effets d’allogéniques Plasma riche en plaquettes (PRP) sur le processus de guérison des Tendons d’Achille sectionné des Rats : une Description méthodologique

Résumé

Ce protocole décrit le processus d’évaluation de la guérison des tendons chez les rats qui ont reçu une injection de plasma riche en plaquettes allogéniques (PRP) ou une solution saline après avoir enlevé la partie du tendon d’Achille. L’état d’avancement de la guérison du tendon est évalué à plusieurs points dans le temps à l’aide de différents types d’analyses.

Résumé

Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour observer si PRP peut influencer positivement la guérison du tendon. Il y a 4 grandes étapes à suivre : induire une lésion dans le tendon d’Achille ; préparer des PRP et injecter (ou la solution saline) ; supprimer le tendon ; et effectuer des évaluations biomécaniques, moléculaires et histologiques. A chaque étape, toutes les procédures et les méthodes sont décrites en détail, donc ils peuvent être facilement reproduits.

Tendons d’Achille ont été sectionnée chirurgicalement (suppression d’un tronçon de 5 mm de long). Par la suite, PRP ou une solution saline a été injectée pour étudier si le PRP a un effet positif sur la guérison du tendon. Trois groupes de 40 animaux (un total de 120 rats ont été utilisés dans cette étude) ont été divisés en 2 sous-groupes : groupe d’injection de PRP et une injection saline groupe témoin. Des rats ont été sacrifiés à accroître les points dans le temps (groupe A: 5 jours ; Groupe B: 15 jours ; Groupe C: 30 jours) et les tendons ont été supprimés. 90 tendons ont subi des tests biomécaniques avant d’effectuer l’analyse transcriptomique et les 30 tendons restants ont été soumis à une analyse histologique.

Introduction

Coagulation, processus inflammatoires et les rôles de modulation de l’immunité des plaquettes sont bien connu¹. Plus récemment, il a été démontré qu’ils ont aussi des propriétés réparatrice^2,3. En effet, divers facteurs de croissance et cytokines (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I et HGF) sont libérés par les plaquettes au cours de la dégranulation. Ces facteurs de croissance favorisent l’angiogenèse, remodelage tissulaire et plaie de guérison (OS, peau, muscle, tendon)². Centrifugation de sang autologue produit plasma riche en plaquettes (PRP) qui contient des concentrations de plaquettes élevé selon la méthode d’isolement (entre 3 et 10 fois les concentrations initiales de sang). En effet, les différentes techniques de préparation de PRP ne peut pas fournir un produit final identique. Jusqu'à présent, il n’y a eu aucun accord international général sur cette question. Dans l’ensemble, le PRP pourrait être une option thérapeutique intéressante pour le traitement des troubles musculo-squelettiques chroniques, comme la tendinopathie, fasciite plantaire, l’arthrose et non syndiqué⁴. Il a été utilisé pour la première fois en chirurgie buccale et implantologie⁴ pour améliorer et accélérer les os guérison après avoir placé un implant dentaire. Dans cette étude, nous décrivons une méthode reproductible qui permet l’acquisition de la PRP pour l’expérimentation animale⁴.

Étant donné que les lésions des tendons sont fréquemment observées dans les sportifs et les travailleurs physiques, amélioration du processus de guérison et réduisant ainsi le temps de récupération sont de grand intérêt⁵. Nouvelles méthodes de traitement qui sont développent souvent impliquent l’utilisation de facteurs de croissance, et l’administration de la PRP est un moyen simple et peu invasif à offrir un mélange de facteurs de croissance endogène⁴.

Plusieurs études in vitro ou animal ont démontré que l’administration de plasma contenant un niveau élevé de plaquettes, en libérant des médiateurs biologiques, peut stimuler la réparation de tendon et ligament en libérant des médiateurs biologiques^{6 ,7,8,9}. En outre, les autres études ont montré que le PRP peut stimuler type I et la synthèse du collagène III dans tendon cellules^9,10,11. Il a également été suggéré que le PRP peut diminuer l’activation des métalloprotéinases matricielles (MMP) et par conséquent réduire la dégradation de la matrice. Les cellules qui sont impliqués dans le processus d’inflammation peuvent produire de MMP-9, qui joue un rôle dans le tissu remodelage (physiologiques et pathologiques) induite par l’inflammation¹².

Basé sur cette information, nous avons supposé qu’une seule injection de PRP dans les tendons d’Achille sectionnés des rats pourrait améliorer le processus de récupération et de la résistance mécanique des tissus réparés. Ceci a été testé en mesurant les propriétés biomécaniques des tendons guérison pendant le processus de récupération et en faisant des analyses histologiques et moléculaires pour évaluer le collagène transformant dans le tissu nouvellement formé. L’objectif de cette étude était d’observer si une seule injection de PRP allogénique pourrait influer sur la cicatrisation des tendons d’Achille sectionnés.

Protocole

Soin et la manipulation des animaux ont été effectuées conformément au Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals établi par la National Academy of Sciences et publiées par les instituts nationaux de santé (USA). Législation européenne et nationale ont été suivis attentivement.

1. la préparation animaux

1. Utilisez 132 2 - mois vieux mâles Sprague-Dawley rats pesant 320-450 g (120 rats d’expérimentation) et de 12 rats pour les prélèvements sanguins, Figure 1. Dell,¹³, 15 rats pour chaque groupe était suffisant pour une puissance de 0,8 (80 % de chance de trouver une signification statistique, si l’effet spécifié existe).
2. Maison de tous les rats dans les cages classiques dans des conditions d’isolement dans une installation classique équipé d’une station de mutation. Fomentent qui se reproduisent dans un rack IVC (cage ventilée individuellement), sur des rats de SPF (agent pathogène spécifique gratuit) spécifiquement achetés.
3. Utiliser les conditions de logement suivantes : température comprise entre 19 et 24 ° C ; hygrométrie : 40 à 60 % ; ventilation : fréquence de renouvellement d’air : 10-15 par h ; cycle lumière/obscurité : 12 h - 12 h.
4. Stériliser tous les équipements de mise en cage et utilisez la litière irradié. Appliquer systématiquement enrichissement cage en plaçant des barquettes en carton stériles et serviettes à l’intérieur des cages.
5. Autoriser l’accès à la zone dans des conditions restreintes : nouveau capot manteau, masque, gants, chaussures et cheveux lab à l’entrée.
6. Procéder à la colonie surveillance sanitaire sur les animaux sentinelles logé sur une literie sale sur une base annuelle, selon les Felasa¹⁴ recommandations pour les installations conventionnelles. Gardez quatre ou cinq animaux par cage, avec le cas échéant irradiés diète et fournit acidifié l’eau ad libitum. Contrôler au quotidien.
7. Transfert des rats élus pour une intervention chirurgicale dans le filtrage de haut cages aux chambres 2 h avant l’intervention chirurgicales.

2. opération chirurgicale

1. Préparer les instruments chirurgicaux : fine, ciseaux, une pince, deux pinces hémostatiques et un porte-aiguille. Au cours de toutes les procédures, porter des gants, un masque, une hotte et une blouse de laboratoire.
2. Au hasard de diviser les rats en deux groupes (PRP et du sérum physiologique).
3. Prenez le rat hors de sa cage et pesez-le. Marques auriculaires numérotée permet d’identifier les rats. Pour éviter la dessiccation des yeux, placer les gouttes d’eau sur la cornée.
4. Anesthésier le rat par voie intrapéritonéale avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel). Pour confirmer anesthetization, placez les animaux sous surveillance cardio-respiratoire et de vérifier des réflexes oculaires.
5. Injecter par voie sous-cutanée de 50 µL de buprénorphine (0,01 à 0,05 mg/kg toutes les 8-12 h) dans la région du cou comme un analgésique.
6. Le membre postérieur gauche vous raser avec un rasoir électrique, désinfecter avec 3 alternant scrubs de solution d’iso-betadine/alcool (dilué 01:10), placez le rat sur un coussin chaud (20 ° C) sous un microscope à dissection. Placez le rat sur décubitus latéral avec la jambe d’être opéré dans une position supérieure. Tenez la patte avec une pince chirurgicale.
7. À l’aide des ciseaux, faire une petite incision latérale (20-25 mm) dans la peau qui entoure le tendon d’Achille gauche et disséquer le carénage à l’aide des ciseaux pour exposer le tendon d’Achille complex (Figure 2 a).
8. Retirez le tendon du plantaire grêle avec une paire de ciseaux (Figure 2 b).
9. Couper le tendon d’Achille transversalement 5 mm proximaux à son insertion calcanéenne et enlever une portion longue de 5 mm à l’aide de ciseaux. Pas suturer le tendon (Figure 2c, 2d).
10. Suture de l’aponévrose et ensuite la peau avec du fil résorbable faisant une suture overjet (suture en continu). Les sutures monofilament peuvent être utilisés aussi bien pour empêcher l’infiltration de la peau dans l’incision chirurgicale.
11. Placez le rat sous une lampe chauffante jusqu'à éveillé et puis replacez le rat dans une cage (58 x 38 cm) (Nota bene: aucune immobilisation n’est imposée).

3. PRP préparation¹⁵

1. Anesthésier les rats de donneur avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale. L’injection de PRP est effectuée 2 h après l’opération sans aucune re-anesthésique.
2. Injecter par voie sous-cutanée 50 µL de buprénorphine comme un analgésique.
3. Collecte de sang total (20 mL par rat, saignement final) par ponction cardiaque dans des tubes stériles contenant 3,2 % tampon citrate de sodium (0.109 M, anticoagulant). Ensuite euthanasier le rat par injection intracardiaque.
4. Pour obtenir des PRP, centrifuger le sang pendant 10 min à 150 x g et à température ambiante. Cette étape de centrifugation initial faible vitesse donne deux phases distinctes : une phase inférieure constituée de globules rouges (hématies) qui prend en compte environ 80 à 90 % du volume total et une phase supérieure composée de plasma riche en plaquettes (PRP) (généralement 10 à 20 % du sang échantillon).
5. Doucement, recueillir le PRP (phase supérieure) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette en plastique. Comme l’interface entre les globules rouges et de PRP est très lâche, ne pas pipeter de trop près à l’interface. Quand a manié correctement, contaminant les globules rouges en PRP doit être inférieure à 0,05 x 10³ cellules / µL. jetez la phase inférieure restante et le tube de prélèvement sanguin primaire.
6. Déterminer le volume de la PRP collectée et mesurer le taux de plaquettes sur un analyseur d’hématologie. Ces valeurs sont requises pour les calculs d’ajuster la concentration plaquettaire à l’étape suivante. Une numération des globules est également utile pour évaluer la contamination potentielle par les globules rouges et la concentration de globules blancs. plaquettes en PRP à ce stade est généralement de 1 à 1,5 x10⁶/µL.
7. Effectuer une seconde centrifugation de la PRP pendant 10 min à 1 000 x g et à température ambiante. Cette étape de centrifugation à grande vitesse donne une boulette de plaquettes lâche et un surnageant consistant autologue plasma pauvre en plaquettes (PPP). En utilisant les valeurs déterminées à l’étape 3.6, calculer le volume du liquide surnageant est supprimée pour concentrer le PRP pour atteindre une concentration finale de 2,5 x10⁶/µL.
8. Recueillir délicatement le surnageant (PPP) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette en plastique, en laissant environ les deux tiers du volume final calculé à l’étape de 3,7. Comme le culot est lâche, une quantité importante de plaquettes est perdue quand PPP est défaussée, réduisant potentiellement la concentration finale souhaitée.
9. Soigneusement Resuspendre le culot de plaquettes avec le surnageant restant de pipetage répétées douces. Mesurer le taux de plaquettes sur ce concentré PRP. Si nécessaire, ajouter le volume approprié de PPP autologue pour atteindre la concentration cible finale.
   Remarque : Utilisez le PRP dans les 3 h de préparation.
10. Ajouter 50 µL de CaCl₂ (mEq 11 10 mL) par mL de PRP pour activer les plaquettes.
11. Injecter 50 µL de PRP fraîche ou une solution saline avec une aiguille de 21G directement dans le site opération suturées environ 1 h après la préparation. Pendant ce temps, garder le PRP à la température ambiante.
12. Surveiller étroitement la récupération fonctionnelle des rats au cours des jours après la chirurgie et avant l’enlèvement du tendon d’Achille.

4. retrait du tendon d’Achille et tests biomécaniques¹⁶

1. 5, 15 ou 30 jours plus tard⁵, peser le rat. Puis, anesthésier avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale.
2. Injecter par voie sous-cutanée 50 µL de buprénorphine comme un analgésique. Retirez le tendon avant de sacrifier l’animal pour garder les conditions physiologiques pour aussi longtemps que possible.
3. Raser le membre postérieur gauche et placez le rat sous un microscope à dissection. Placez le rat sur décubitus latéral avec la jambe d’être opéré dans une position supérieure. Tenez la patte avec les doigts.
4. Faites une petite incision (10 mm) à l’ancien site de l’opération et s’étendent jusqu'à ce que le suralis triceps est exposée.
5. Pour supprimer la guérison tendon d’Achille, couper l’OS calcanéen transversalement de 5-10 mm distal à sa fixation sur le tendon d’Achille. Ensuite disséquer une partie de la suralis de triceps, apposée sur le tendon d’Achille (Figure 3 b). La partie musculaire doit être assez grand pour tenir dans la cryo-mâchoire (Figure 3 c-d). Mettre l’échantillon immédiatement sur la cryo-mâchoire à l’aide de pinces (Figure 3e).
6. Après avoir enlevé l’ensemble muscle-tendon-OS, euthanasier le rat par injection intracardiaque avec Nembutal (200 mg/kg). Confirmer la mort en évaluant l’absence du rythme cardiaque et la respiration pendant 15 min.
7. Placez l’appareil musculaire dans la mâchoire supérieure (Figure 3e), fermez-le et placez-le verticalement dans la machine d’essai universelle (106,2 kN, Figure 3 a). Fixer ensuite l’os entre les mâchoires inférieures de la machine (Figure 3f).
8. Ajouter l’azote liquide dans les deux les bassins de la mâchoire supérieure de geler le muscle, alors que c’est un ordre de grandeur plus rigide que le tendon et ne se déforme pas lors de l’essai de traction.
9. Lorsque la zone de congélation atteint la frontière de collier métallique et a commencé l’essai de traction, alors le tendon conservera sa structure. Définir le taux de déplacement de la machine à une vitesse constante de 1 mm/s jusqu'à la rupture. Enregistrer la résistance à la traction (UTS) donnée en Newtons (N) sur un ordinateur.
10. Pour calculer la section transversale, placer deux caméras perpendiculaires entre eux, formant une forme elliptique et prendre des photos.
11. Pour tenir compte de la différence de la section transversale des tendons guérison, normaliser l’UTS à une unité de surface (N par millimètre carré), qui représente les contraintes mécaniques subies par le tissu.

5. histologique analyse

NOTE : 15 tendons de chaque groupe a subi une analyse histologique.

1. Après son retrait, submerger le tendon d’Achille immédiatement à 4 % de paraformaldéhyde à préserver sa structure (1 mm de tissu est fixe à l’heure, le temps de fixation varie selon la taille du tendon).
2. Remplacer le paraformaldéhyde par l’éthanol à 70 % et laisser l’échantillon pendant au moins une nuit dans cette solution.
3. Placer le tendon dans un petit récipient en plastique avec trous et placer ce récipient dans une solution d’éthanol 70 % frais pendant 1 h.
4. Placer le récipient dans l’éthanol à 95 % pendant 1 h. répéter.
5. Placer le récipient dans l’éthanol à 100 % pendant 1 h. répéter.
6. Placer le récipient dans le xylène 100 % pendant 1 h. répéter.
7. Maintenant, placez le récipient en plastique, qui contient le tendon, en paraffine liquide (56 ° C) et laisser la nuit.
8. À l’aide d’une station d’enrobage (équipée de cire fondue, une plaque chauffante et une plaque froide), choisir un moule métallique qui correspond le mieux à l’échantillon de tissu et le remplir avec de la paraffine liquide un peu afin que la base est couverte.
   NOTE : Orientez l’échantillon afin d’obtenir des coupes verticales au microtome.
9. Lorsque l’échantillon est correctement positionné, remplir le moule avec de la paraffine liquide et placez-la sur la machine frigorifique. Laissez-le refroidir pendant au moins 15 minutes.
10. Retirer le bloc de paraffine et placez-le sur la glace pendant au moins 30 min.
11. Préparer plusieurs lames de verre propre et mettre quelques gouttes d’eau déionisée sur eux.
12. En le microtome, couper les blocs en sections de 5 µm (seules les sections utilisation de la partie moyenne du tendon) et placez la section sur une lame.
13. Déposer les lames dans un four à chauffage à 65 ° C pendant plusieurs minutes, afin que la paraffine commence à fondre pour coller le tissu sur le verre.
14. Placez les diapositives contenant des sections de la paraffine dans un support de tranche.
15. Maintenant Déparaffiner et réhydrater le tissu en le plaçant dans les bains successifs suivants :
    8 min dans le xylène (1 bain)
    4 min dans le xylène (bain 2)
    2 min dans l’éthanol à 100 %
    2 min dans l’éthanol à 95 %
    2 min dans l’éthanol à 70 %
    2 min dans l’eau désionisée
16. Pour une coloration hématoxyline-éosine, placez le tissu dans les solutions suivantes.
    1. Plongez le tissu pendant 8 min dans une solution de l’hématoxyline (monohydrate de l’hématoxyline 1 g, 0,2 g KIO₃, 50 g AIK (SO₄)₂.12h₂O ; glycérine 200 mL ; ajuster à 1 L avec de l’eau distillée).
    2. Plongez le tissu pendant 8 min sous l’eau courante.
    3. Plongez le tissu pendant 30 s dans une solution d’éosine (0,25 % éosine dans 100 mL d’eau distillée contenant 200 µL de l’acide acétique dilué).
    4. Plongez le tissu pendant 2 min sous l’eau courante.
17. Pour la coloration Trichrome de Masson, procédez comme suit.
    1. Après réhydratation, déposer les éléments dans un conteneur à l’alun de fer (0,5 g (NH₄) Fe (SO₄)₂.12h₂O 10 mL H₂O) et fermer le récipient. Chauffer pendant 3 min à 280 W au micro-ondes.
    2. Laissez-le refroidir pendant une minute et ensuite rincer à l’eau désionisée.
    3. Placez les sections dans un récipient fermé avec une solution de Regaud hématoxyline (hématoxyline 0,5 g dissous dans 50 mL H₂O à 50 ° C, puis ajouter 5 mL d’éthanol à 95 % et de la glycérine de 5 mL), chauffez-le pendant 90 s à 280 w.
    4. Rincer à l’eau désionisée.
    5. Déposer les éléments dans une solution d’acide picrique (à saturation dans le méthanol) pendant 3 min, rincer pendant 5 min sous l’eau courante et puis placez-la dans l’eau désionisée pendant quelques secondes.
    6. Maintenant, placez les sections dans la fuchsine acide (0,5 g dans 50 mL H₂O contenant 0,25 mL de l’acide acétique dilué) pendant 5 s et rincer sous l’eau courante jusqu'à ce que disparaisse la teinture.
    7. Incuber les sections dans la solution d’acide phosphomolybdique (0,5 g dans 50 mL H₂O) pendant 5 min, placer pendant quelques secondes dans l’eau désionisée.
    8. Déposer les éléments en solution de vert clair (0,5 g dans 50 mL H₂O contenant 0,25 mL de l’acide acétique dilué) pendant 5 min et placez-le sous l’eau courante jusqu'à ce que disparaisse la teinture.
18. Maintenant de déshydrater le tissu à nouveau.
    1. Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 70 %.
    2. Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 95 %.
    3. Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 100 %.
    4. Immerger la section pendant 1 min dans le xylène (1 bain).
    5. Immerger la section pendant 1 min dans le xylène (bain 2).
    6. Supprimer les sections sans enlever trop xylène et mettre une goutte de milieu de montage sur l’échantillon.
    7. Mettre une lamelle sur le dessus (sans provoquer les bulles) et laissez durcir pendant au moins 2 h.
    8. Hydrolysent 5 coupes histologiques (chacun d’un tendon différent) de chaque groupe dans 6 N HCl pendant 3 h et déterminer la concentration de collagène en mesurant l’hydroxyproline sous forme d’index en 5 sections µm non souillées enregistré.
19. Normaliser les résultats de la zone de section à l’aide du logiciel du fabricant.
20. Certaines des sections tacher avec lumière verte tacher de visualiser et de quantifier de collagène fibrillaire par analyse assistée par ordinateur.
21. Parcourir les sections et de convertir les images en nuances de gris en utilisant le logiciel IrfanView. Utiliser le logiciel pour semi-quantification (par exemple, une quantité).

6. moléculaire évaluation

1. Après la rupture de tendon, qui survient au cours d’essais mécaniques, effectue les prélèvements, clin d’oeil leur congélation dans l’azote liquide et les stocker à-80 ° C (solution saline et PRP)¹⁷.
2. Utilisez un kit commercial d’ARN Total pour isoler total RNA¹⁷.
3. Mesurer l’expression du collagène (Col I et III du Col), métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-3 et MMP-9) et tenomodulin (TNMD) par RT-PCR^17,18.
4. Normaliser les niveaux d’expression de l’ARNm au niveau de 28 s¹⁹.

Résultats

Les résultats sont exprimés sous la moyenne ± écart-type de la moyenne et ont été comparés à l’analyse de variance (ANOVA). Une analyse de la variance bidirectionnelle et post hoc test de Scheffé, qui est un test paramétrique, ont été utilisés.

La résistance à la traction (UTS) nécessaire pour provoquer une rupture des tendons d’Achille non lésés de rats a été 42,0 ± 5,7 N (n = 10). La résistan...

Discussion

Les plaquettes sont essentiels à la phase précoce et inflammatoire du tendon processus de guérison. Lorsque ces plaquettes sont exposés à liant les tissus ou les facteurs qui induisent la coagulation, ils vont sortir des facteurs de croissance qui sont stockées dans les granules α. En raison de cette interaction, macromolécules de la matrice extracellulaire sont synthétisée et prolifèrent des cellules mésenchymateuses. Les plaquettes ont aussi une activité chimiotactique sur cellules progénitrices dans la c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine (Xyl-M)	VMD	none	anesthetic
Ketamin (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	none	anesthetic
Buprenorphin (Vetergésic Multidosis)	ALSTOE	none	Painkiller
iso-Betadine	MEDA-Pharma	none	Desinfectant
resorbable yarn Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	none	Anesthetic
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Preserves structure of the tissue
Isopropanol 100%	VWR	20,922,364
Ethanol 95%	VWR	20,823,362
Xylene	VWR	28973.363
Paraffin	VWR	LEIC3950.1006
Hematoxylin	Millipore	1.15938.0025	Colorant
Eosin	Millipore	1.15935.0100	Colorant
Eukitt	Sigma-Aldrich	3989	Mounting Medium
CaCl2