监测ER / SR钙释放与目标Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;传感器捕捉器<sup&gt; +</sup

摘要

我们提出了使用我们的靶向基因编码钙指示剂（GECI）CatchER ^+的方案 ，用于使用实时荧光显微镜监测HEK293和骨骼肌C2C12细胞的内质网/肌浆网（ER / SR）中的快速钙瞬变。还讨论了原位测量和校准的协议。

摘要

细胞外刺激诱发的细胞内钙（Ca ²⁺ ）瞬态引发了生物体内的多种生物过程。在细胞内钙释放的中心是细胞内主要的钙储存细胞器，内质网（ER）和肌肉细胞中更专门的肌浆网（SR）。来自这些细胞器的钙的动态释放由兰诺定受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP ₃ R）介导，通过肌肉/内质网钙ATP酶（SERCA）泵进行再灌注。创建了一种称为CatchER的遗传编码钙传感器（GECI），用于监测ER / SR的钙释放速度。在这里，HEK293和C2C12细胞中改良的ER / SR靶向GECI CatchER ⁺的转染和表达的详细方案及其在监测IP ₃ R，RyR和SERCA泵介导的钙瞬变中的应用在HEK293细胞中使用荧光显微镜概述。受体激动剂或选择的抑制剂分散在室溶液中，并且强度变化被实时记录。使用这种方法，用4-氯 - 间甲酚（4-cmc）的RyR活化，用三磷酸腺苷（ATP）间接激活IP ₃ R和抑制具有环磷酸腺苷酸的SERCA泵，观察到ER钙的降低酸（CPA）。我们还讨论了确定C2C12细胞中原位 K _d和定量基础[Ca ²⁺ ]的方案。总之，与CatchER ⁺结合使用的这些方案可以从ER中引发受体介导的钙释放，并将来应用于ER / SR钙相关病理学研究。

引言

细胞内钙（Ca ²⁺ ）瞬态的时空属性激活各种生物学功能¹ 。这些Ca ²⁺信号事件通过不同的刺激细胞外触发，并由主要的Ca ²⁺储存细胞器和许多Ca ²⁺泵，通道和Ca ²⁺结合蛋白在细胞内控制。由于信号调制的缺陷，Ca ²⁺瞬变可能会显着改变，导致不同的疾病² 。由于Ca ²⁺信号传导系统的速度和复杂性，与内质网（ER）和肌质网（SR）在中心，需要基因编码的Ca ²⁺探针已被优化用于具有快速动力学的哺乳动物表达观察不同细胞的全球和局部Ca ²⁺变化³ 。

ER和SR，其对应的肌肉细胞，是主要的细胞内Ca ²⁺储存细胞器，并充当Ca ²⁺水槽，有助于放大Ca ²⁺信号⁴ 。 ER / SR是Ca ²⁺信号的组成部分，具有作为信号^5的发射器和接收器的双重作用。兰诺定受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP ₃ R）是位于由Ca ^{2+ 6}调节的ER / SR膜上的Ca ²⁺释放受体。其他药物直接或间接刺激这些受体的功能。 4-氯间甲酚（4-cmc）是RyR的有效激动剂，其具有比用于诱导SR Ca ²⁺释放的咖啡因高10倍的灵敏度，其中两者均经常用于研究RyR介导的Ca ²⁺释放健康和患病细胞⁷ 。 ATP增加IP ₃介导的Ca ²⁺通过IP ₃ R ⁸租赁。 ATP结合嘌呤能受体P2YR，一种G蛋白偶联受体（GPCR），触发产生IP ₃ ，结合IP ₃ R从ER ^9,10释放Ca ²⁺ 。肌质内质网钙ATP酶（SERCA）泵是一种P型ATP酶泵，也位于ER / SR膜上，可减少细胞溶质Ca ²⁺ ，并通过主动将离子注入ER / SR内腔来补充ER / SR ¹¹ 。 SERCA泵的特异性抑制剂包括来自加拿大的Thapsia garganica的thapigargin和来自曲霉和青霉的环磷酸（CPA）。 CPA对泵具有低亲和力，并可逆地阻断Ca ²⁺接入点¹² 。另一方面，毒胡萝卜素在M3螺旋中的残留物F256与纳摩尔不可逆地结合到不含Ca ^2+的泵ar亲和力¹¹ 。分析和量化涉及Ca ²⁺刺激事件的变化已经并且仍然是一个挑战。由于ER / SR是Ca ²⁺信号传播过程中具有中枢功能的主要亚细胞Ca ²⁺含量隔室，因此大部分工作集中在了解ER / SR Ca ²⁺信号⁵ 。

合成的Ca ²⁺染料的创建有助于推动Ca ²⁺成像的领域和实践。尽管诸如Mag-Fura-2的染料已被广泛用于测量不同细胞中的间隔Ca ^{2+ ，}但它们具有诸如染料负载不均匀，光漂白和不能针对特定细胞器的限制。绿色荧光蛋白（GFP）的发现和荧光蛋白 -基于Ca ^2+的探针已经推动了Ca ²⁺成像领域的发展。一些现有的GECI是涉及黄色荧光蛋白（YFP），青色荧光蛋白（CFP），钙调蛋白和M13结合肽^17,18的 Förster共振能量转移（FRET）对。肌钙蛋白C基GECI也可作为FRET对的CFP和柠檬酸和单一荧光团探针^19,20,21 。 其他，如GCaMP2和R-GECO是涉及钙调素^22,23的单一荧光团传感器。为了克服狭窄调节K _d和与其Ca ²⁺结合结构域²⁴中发现的多个Ca ²⁺结合位点相关的协同结合的限制，一类新的钙通过在增强型绿色荧光蛋白（EGFP） ^25,26的发色团敏感位置设计β桶表面上的Ca ²⁺结合位点来产生细胞。这种称为CatchER的高度传播的传感器在扩散极限附近具有〜0.18mM的k _d ，在700s ^-1附近ak。 CatchER已被用于监测不同哺乳动物细胞系（如HeLa，HEK293和C2C12 ^25）中受体介导的ER / SR钙释放。由于其快速动力学，CatchER用于年轻和老朋友病毒B NIH Jackson（FVB）小鼠的屈肌腱肌肉纤维（FDB）肌纤维，以揭示在FDB中经过2秒的去极化后，更多的Ca ²⁺保留在SR中与老鼠相比，老鼠的纤维²⁷ 。克服其在37℃的低荧光，这阻碍了其在哺乳动物的钙成像中的应用细胞，我们开发了一个名为CatchER ⁺的改进版本的CatchER。 CatchER ⁺在37℃下表现出增强的荧光，以更好地应用于哺乳动物细胞。在CatchER中加入了另外的突变以提高37℃ ^28,29 ℃的热稳定性和荧光，以产生CatchER ⁺ 。 CatchER ⁺与CatchER ³⁰相比，其信噪比（SNR）提高了6倍。

在这里，介绍了使用CatchER ⁺培养和转染HEK293和C2C12细胞的方案及其用于监测ER / SR受体介导的钙瞬变的方案。显示了在用4-cmc，CPA和ATP处理的HEK293细胞中表达的CatchER ^+的代表性结果。我们还提供了一种用于确定C2C12成肌细胞和qua中CatchER ^+的 原位 K _d的方案基础[Ca ²⁺ ]的鉴定。

研究方案

幻灯片准备

1. 将22 mm x 40 mm玻璃显微镜放置在6 cm细胞培养皿中，每道1张。
2. 将每个载玻片的每一面以及6厘米的盘暴露于紫外（UV）光15-20分钟，以在无菌罩中消毒。
3. 用碟形玻璃盖上碟子，并放置在4°C直到准备使用。

2.制备介质，缓冲液，溶液和试剂

1. 在去离子水中制备1升Hank's平衡盐溶液（HBSS），并加入10mM HEPES，5mM NaHCO ₃和1mM EGTA。用NaOH调节至pH 7.2-7.3。将过滤缓冲液用0.22μm过滤器压入高压灭菌瓶中。
2. 在去离子水中制备900 mL高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）。加入44 mM NaHCO ₃ ，并用HCl调节pH至7.2-7.3。将过滤介质用0.22μm过滤器压入高压灭菌瓶中。加入100 mL胎牛新鲜血清（FBS）对培养基使FBS浓度达到10％。储存于4°C。
3. 在去离子水中制备1μL细胞内缓冲液（125mM KCl，25mM NaCl，10mM HEPES，0.2mM CaCl 2，0.5mM EGTA，0.2mM MgCl ₂ ），并将pH调节至7.25。最终的[Ca ²⁺ ]将为〜100nM。使用前，加入0.5 mM ATP。在室温下储存。
4. 在去离子水中制备1μL的林格缓冲液（121mM NaCl，2.4mM K ₂ HPO 4，0.4mM KH ₂ PO 4，10mM HEPES和1.2mM MgCl ₂ ），并将pH调节至7.2。在室温下储存。使用，分批50mL 50mL管，并加入1.8 mM Ca ²⁺和10 mM葡萄糖。
5. 在去离子水中制备1L KCl漂洗溶液（125mM KCl，25mM NaCl，10mM HEPES，0.2mM MgCl ₂ ），并将pH调节至7.25。
6. 将5mg的离子霉素溶于1mL二甲基亚砜（DMSO）中。将等分试样30μL加入微管并储存于-20℃6℃。
7. 通过将CPA溶解在DMSO中制备环戊酸（CPA）。确保添加到细胞中的CPA的最终百分比不超过1％，以防止细胞凋亡。通过溶解到过滤的H ₂ O中并通过在37℃下振荡使其溶解过夜来制备20mM 4-氯 - 间甲酚（4-cmc）。通过将过滤的H ₂ O溶解至100mM来制备ATP储备。
8. 为了确定原位 K _d ，使用100μl的KCl缓冲液中的1mM EGTA，0.2mM，0.6mM，2mM，5mM，10mM，20mM，50mM和100mM Ca ²⁺ ， mM EGTA原液和溶解在去离子水中的1M CaCl ₂原料。

细胞培养

1. 根据ATCC方案培养C2C12成肌细胞和HEK293细胞，每个在无菌UV罩中使用10cm细胞培养皿。
   注意:C2C12细胞不允许生长高于约70％汇合，因为成肌细胞将开始分化进入肌管。 HEK293和C2C12细胞都容易生长，不应该允许生长超过100％融合以维持细胞完整性。另外，细胞在使用它们进行实验以保持细胞健康之前，不应该被传播10次以上。

4. HEK293细胞的转染

1. 将种子HEK293细胞在6cm培养皿中的灭菌的22mm×40mm玻璃显微镜载玻片上，使其在转染当天〜70％汇合。
2. 第二天，按照制造商的方案转染试剂，使用2μgCatchER ⁺ cDNA和1:3（重量/体积）DNA:转染试剂比在还原血清培养基（ 如 Opti-MEM）中转染细胞。
3. 从盘中取出DMEM培养基，加入3 mL还原血清培养基。将DNA:转染试剂混合物加入到培养皿中，37℃孵育4-6小时。
4. 孵育后，用5-6mL HBSS洗涤细胞。舍弃HBSS f将盘取出，加入3mL新鲜的DMEM，37℃孵育48小时，以表达GECI。
5. 转染C2C12成肌细胞
   1. 对于C2C12成肌细胞，通过添加足够的胰蛋白酶来覆盖盘底部（1-2mL），胰蛋白酶消化细胞。将培养皿置于37℃的培养箱中2-6分钟，使胰蛋白酶从培养皿底部松开细胞。
   2. 一旦孵育完成，取出胰蛋白酶并将细胞吸入8mL的DMEM中。用DMEM彻底移取细胞，均匀分散并重新悬浮细胞，并将其种植在含有3mL DMEM的6cm细胞培养皿中的无菌盖玻片上，使最终汇合率达到60％。
   3. 在同一天内转染细胞，如步骤4.2-4.3所述。在37°C孵育24小时。
   4. 重复步骤4.4。

幻灯片和荧光显微镜的准备

1. 打开m显微镜和光源，然后打开简单PCI程序。允许显微镜预热15-20分钟，或直到电荷耦合器件（CCD）相机冷却至-65°C。准备室，等待时用细胞滑动。
2. 使用棉签将覆盖低密度开放金刚石浴成像室的底部用薄层密封剂覆盖。
3. 将含有转染细胞的载玻片从培养箱中取出，并用预先温育至37℃的10mM葡萄糖和1.8mM Ca ^2+的 1mL Ringer缓冲液轻轻冲洗三次。
4. 将1mL的林格缓冲液放在盘中，以防止细胞干燥，并使用镊子将滑块从盘中取出。通过将载玻片的边缘接触到实验室组织，使多余的溶液吸收到实验室组织上。然后将其放在包含润滑脂的腔室的侧面，细胞面朝上，使用螺丝刀将油脂和固定室固定在载物台上。
5. 添加1mL的林格缓冲液到室，以防止细胞干燥，同时将腔室安装在舞台上，并完成显微镜设置的其余部分。一旦真空抽吸软管连接到腔室，腔室容纳的最终体积为〜450μL。
6. 将显微镜物镜切换到40X油浸物镜。
7. 使用镜头纸和镜头清洁液清洁和干燥物镜。不要擦目的。轻轻擦拭直至表面清洁。
8. 将一滴浸油加入目标。
9. 将支架放置在显微镜平台上，并将真空尖端添加到腔室。一旦真空抽吸软管连接到腔室并打开，腔室容纳的最终体积为〜450μL。该最终体积与腔室的侧面平齐。在实验过程中，室解决方案必须保持水平，以防止由于过度填充而使溶液溢出到物镜中。
10. 提高目标，并使用粗调，直到物体上的油接触到幻灯片的底部。
11. 使用亮场模式，将增益调整为175，将曝光时间调整为0.03秒，以对焦单元格。
12. 一旦细胞聚焦，使用488 nm激发切换到荧光模式。将曝光时间更改为0.07秒。找到具有足够的细胞健康的足够的荧光图像的视野。
13. 一旦选择了视野，在荧光和明场模式下进行拍摄。
14. 在单元格中圈出感兴趣区域（ROI），或者将整个单元格圈出以记录所选区域的强度。

6.成像药物诱导的Ca ²⁺瞬态和原位 K _d校准

1. 启动强度测量，帧速率每5秒设置一次。
2. 允许基线强度稳定20-30帧（100-150秒）。如果需要，减少fr这个步骤中的ames / s，以防止漂白。
3. 基于最终室体积〜450μL计算20mM储备液所需的4-cmc的量，使终浓度为200μM。根据需要稀释稀释液。
4. 小心地从室中取出60μL的林格缓冲液，并置于微量离心管中。用该溶液稀释计算出的4-cmc的量，并加回到室中以引起来自被成像的细胞的预期响应。
5. 将计算出的4cmc的量添加到微量离心管中并通过移液混合。
6. 在视场中轻轻添加该解决方案，同时在强度测量中添加事件标记。
7. 让药物与受体结合的时间和随后的信号减少，然后用同时添加事件标记物的同时用含有1.8mM Ca ²⁺和10mM葡萄糖的3-6mL的林格缓冲液洗涤。由于室容积为450℃，＃181; L并连接到真空，加入3-6mL缓冲液确保含有药物的前者溶液已被冲洗掉并用新添加的溶液替代。
8. 对于100μMATP和15μMCPA重复6.1-6.7，使用每个测定的转染细胞的新载玻片。
9. 测量完成后，在简单PCI程序的强度测量窗口中结束数据采集。
10. 拍摄细胞的荧光和明亮照片。
11. 打开实验的数据文件。在这里，如果需要，重新圈出感兴趣的细胞或区域以重新计算强度值。
12. 为了确定C2C12成肌细胞中的原位 K _d ，按照4.2节和第5节所述的方案，并将1mL的0mM Ca ²⁺ Ringer缓冲液置于室中。
    1. 用0.002-0.005％皂角苷在细胞内缓冲液中使细胞渗透15-30秒，以清除任何细胞CatchER ⁺可能在细胞溶质中。用含10μM离子霉素的KCl缓冲液中的3-6mL 1mL EGTA洗涤细胞。允许强度降低，直到达到平台。
    2. 用3-6毫升具有10μM离子霉素的KCl缓冲液冲洗，并使强度稳定，然后加入步骤2.7中详述的每种Ca ²⁺溶液。允许强度在每次添加之间达到平台。
13. 要校准基础[Ca ²⁺ ]定量的传感器，请按照6.12步骤进行。使用EGTA和来自步骤2.7的100mM Ca ²⁺缓冲液以获得最小和最大荧光强度。

7.数据处理

1. 下载强度测量数据的电子表格文件。
2. 将每个单元格的数据归一化为基线强度（F / F ₀ ）。在任何图形程序中绘制归一化数据与时间的关系。
3. 要计算％变化，减去归一化峰值ue从1乘以100.计算多个细胞成像时的平均值和标准偏差。
4. 为了计算信噪比SNR，打开图像文件保存在图像处理软件ImageJ中，然后测量信号，转染细胞和噪声背景。使用方程SNR =信号/噪声计算SNR。
5. 为了从收集的荧光成像数据中计算原位 K _d ，在加入每种Ca ²⁺浓度和EGTA（0mM Ca ²⁺ ）之后平均包括平台的强度数据。使用θ=（F-F _min ）/（F _max -F _min ）计算分数饱和度（相对强度），其中θ是相对强度，F是任何点的荧光，F _min是最小荧光强度， F _max是荧光强度的最大值，以观察t的强度变化他与最小强度相比，加入Ca ²⁺进行探测。在任何图形和曲线拟合程序中绘制相对强度数据[Ca ²⁺ ]。使用任何图形和曲线拟合程序翻译的1:1结合方程θ= [M _T ] /（K _d + [M _T ]）来计算K _d 。 M _T是总金属浓度。
6. 为了从6.13中概述的校准中量化基础钙，在加入1mM EGTA（F _min ）和100mM Ca ²⁺ （F _max ）后平均含有平台的强度数据。使用校准方程[Ca ²⁺ ] = K _d （[F - F _min ] /（F _max - F）]计算基础钙。

结果

本节将说明使用先前描述的使用优化的ER / SR靶向GECI CatchER ^+的方法通过不同的受体介导途径监测ER / SR Ca ^2+的变化而实现的结果。

图1说明通过用200μM4-cmc刺激的RyR排空ER。 4-cmc是RyR的激动剂。通过CatchER ⁺荧光强度的降低测量，添加药物会诱导ER钙的降低。如标示，本文概述的方案?...

讨论

荧光探针如CatchER ^+的活单细胞成像是分析每个细胞响应于受体激动剂或拮抗剂的复杂ER / SR Ca ²⁺信号传导过程的有效技术。这种技术对于同时使用多个波长的成像也是有用的，例如Fura-2所需要的或将Catcher ⁺和Rhod-2一起图像分别监测ER和胞质钙变化。该协议有几个关键步骤;细胞转染可以对成像的可行性有很大的影响。低转录率可能导致GECI表达不足以监测钙的反应。另一方面?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046