Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Résumé

Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER ⁺ pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et ​​C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K _d est également discuté.

Résumé

Les transitoires de calcium intracellulaire (Ca ²⁺ ) évoqués par des stimuli extracellulaires initient une multitude de processus biologiques dans les organismes vivants. Au centre de la libération de calcium intracellulaire sont les principaux organelles de stockage de calcium intracellulaire, le réticulum endoplasmique (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) plus spécialisé dans les cellules musculaires. La libération dynamique du calcium à partir de ces organites est médiée par le récepteur du ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R) avec un remplissage à travers la pompe ATC de calcium ATPase réticulum sarco / endoplasmique (SERCA). Un capteur de calcium génétiquement codé (GECI) appelé CatchER a été créé pour surveiller la libération rapide de calcium de l'ER / SR. Ici, les protocoles détaillés pour la transfection et l'expression du GECI CatchER ⁺ amélioré ER / SR ciblé dans les cellules HEK293 et ​​C2C12 et son application dans la surveillance des transitoires de calcium à médiation par pompe IP ₃ R, RyR et SERCAS dans les cellules HEK293 utilisant une microscopie à fluorescence est décrite. L'agoniste du récepteur ou l'inhibiteur de choix est dispersé dans la solution de la chambre et les changements d'intensité sont enregistrés en temps réel. Avec cette méthode, on observe une diminution du calcium ER avec une activation de RyR avec 4-chloro-m-crésol (4 cmc), l'activation indirecte d'IP ₃ R avec de l'adénosine triphosphate (ATP) et l'inhibition de la pompe SERCA avec cyclopazonium Acide (CPA). Nous discutons également des protocoles pour déterminer le K _D in situ et quantifier basal [Ca ²⁺ ] dans des cellules C2C12. En résumé, ces protocoles, utilisés conjointement avec CatchER ⁺ , peuvent provoquer une libération de calcium médiée par les récepteurs à partir de l'ER avec une application future dans l'étude des pathologies liées au calcium ER / SR.

Introduction

Les attributs spatio-temporels des transitoires intracellulaires de calcium (Ca ²⁺ ) activent diverses fonctions biologiques ¹ . Ces événements de signalisation de Ca ²⁺ sont déclenchés de manière extracellulaire par différents stimuli et contrôlés intracellulairement par l'organelle de stockage principale de Ca ²⁺ et par de nombreuses pompes Ca ²⁺ , des canaux et des protéines de liaison Ca ²⁺ . Les transitoires de Ca ²⁺ peuvent être modifiés de manière significative à la suite de défauts de modulation du signal, entraînant différentes maladies ² . En raison de la vitesse et de la complexité du système de signalisation Ca ²⁺ , avec le réticulum endo- (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) au centre, des sondes de Ca ²⁺ codées génétiquement, optimisées pour une expression mammaire avec une cinétique rapide, sont nécessaires Pour observer les changements mondiaux et locaux de Ca ²⁺ dans différentes cellules ³ .

L'ER et le SR, Son homologue dans les cellules musculaires, sont les principales organelles intracellulaires de stockage de Ca ²⁺ et agissent comme des éviers Ca ²⁺ qui aident à amplifier le signal Ca ^{2+ 4} . L'ER / SR fait partie intégrante de la signalisation Ca ^{2 +} avec deux rôles d'émetteur et de récepteur de signaux ⁵ . Le récepteur de ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R) sont des récepteurs de libération de Ca ²⁺ situés sur les membranes de l'ER / SR qui sont régulés par Ca ^{2+ 6} . D'autres agents stimulent directement ou indirectement la fonction de ces récepteurs. Le 4-chloro-m-crésol (4 cmc) est un agoniste puissant du RyR, ayant une sensibilité 10 fois plus élevée que la caféine pour induire une libération de SR Ca ²⁺ où les deux sont régulièrement employés pour étudier la libération de Ca ²⁺ médiée par RyR dans Cellules saines et malades ⁷ . L'ATP augmente le Ca ²⁺Bail via IP ₃ R ⁸ . L'ATP se lie au récepteur purinergique P2YR, un récepteur couplé à la protéine G (GPCR), déclenchant la production d'IP ₃ qui se lie à l'IP ₃ R pour libérer Ca ²⁺ de l'ER ^{9 , 10} . La pompe ATPase de calcium du réticulum sarco-endoplasmique (SERCA) est une pompe ATPase de type P, également située sur la membrane ER / SR qui réduit le Ca ²⁺ cytosolique et recharge l'ER / SR en pompant activement l'ion dans la lumière ER / SR ¹¹ . Les inhibiteurs spécifiques de la pompe SERCA comprennent thapsigargin, de Thapsia garganica et de l'acide cyclopiazonique (CPA), d' Aspergillus et Penicillium . CPA a une faible affinité pour la pompe et bloque de manière réversible le point d'accès au Ca ^{2+ 12} . Thapsigargin, d'autre part, se lie de manière irréversible à la pompe libre de Ca ^{2 +} au résidu F256 dans l'hélice M3 avec nanomolAr affinité ¹¹ . L'analyse et la quantification des changements impliqués dans ^les événements stimulés par Ca ^{2 +} ont été et continuent d'être un défi. Étant donné que le ER / SR est le compartiment principal subcellulaire Ca ²⁺ avec une fonction centrale dans la propagation du signal Ca ²⁺ , beaucoup de travail a été mis au point pour la compréhension de la signalisation ER / SR Ca ^{2+ 5} .

La création de colorants synthétiques Ca ^{2 +} a contribué à faire avancer le terrain et à pratiquer l'imagerie Ca ²⁺ . Bien que les colorants, tels que Mag-Fura-2, aient été largement utilisés pour mesurer le Ca ²⁺ compartimenté dans différentes cellules, ^{13 , 14 , 15 ,} ils ont des limitations telles que le chargement irrégulier de la teinture, le photoblanchage et l'incapacité d'être ciblés sur des organites spécifiques . La découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) et l'avancement des protéines fluorescentes -Les sondes à base de Ca ²⁺ ont propulsé le champ de l'imagerie Ca ^{2 +} vers l'avant ¹⁶ . Certains des GECI existants sont des paires de transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) impliquant des protéines fluorescentes jaunes (YFP), des protéines cyan fluorescentes (PCP), la calmoduline et le peptide de liaison M13 ^{17 , 18} . Les GECI à base de Troponin C sont également disponibles sous forme de paires de CFP et de Citrine FRET et en tant que sondes fluorophores simples ^{19 , 20 , 21} . D'autres, comme GCaMP2 et R-GECO, sont des capteurs fluorophores individuels impliquant la calmoduline ^{22 , 23} . Pour surmonter les limites du réglage étroit de K _d et de la liaison coopérative associée à de multiples sites de liaison au Ca ²⁺ trouvés dans leurs domaines de liaison au Ca ^{2+ 24} , une classe de calcium récenteSors a été créé en concevant un site de liaison au Ca ²⁺ à la surface du baril bêta dans un emplacement sensible au chromophore de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) ^{25 , 26} . Ce capteur hautement touché, appelé CatchER, a un K _d de ~ 0,18 mM, ak _sur près de la limite de diffusion, et ak _hors de 700 s ^-1 . CatchER a été utilisé pour surveiller la libération de calcium ER / SR médiée par les récepteurs dans différentes lignées cellulaires de mammifères telles que HeLa, HEK293 et ​​C2C12 ²⁵ . En raison de sa cinétique rapide, CatchER a été utilisé dans les fibres musculaires flexor digitorum brevis (FDB) des souris jeunes et anciennes Friend Virus B NIH Jackson (FVB) pour révéler que plus de Ca ²⁺ reste dans la SR après 2 s de dépolarisation dans la FDB Fibres de souris anciennes comparées à celles de souris jeunes ²⁷ . Pour surmonter sa faible fluorescence à 37 ° C, ce qui entrave ses applications dans l'imagerie au calcium de mammifèresCell, nous avons développé une version améliorée de CatchER appelée CatchER ⁺ . CatchER ⁺ présente une fluorescence améliorée à 37 ° C pour une meilleure application dans les cellules de mammifères. Des mutations supplémentaires ont été incorporées dans CatchER pour améliorer la thermostabilité et la fluorescence à 37 ° C ^{28 , 29} , pour créer CatchER ⁺ . CatchER ⁺ affiche une augmentation de six fois de son rapport signal sur bruit (SNR) sur CatchER ³⁰ .

Ici, les protocoles pour la culture et la transfection de cellules HEK293 et ​​C2C12 avec CatchER ⁺ et son application pour la surveillance des transitoires de calcium médiés par les récepteurs ER / SR sont présentés. Des résultats représentatifs sont présentés pour CatchER ⁺ exprimé dans des cellules HEK293 traitées avec 4 cmc, CPA et ATP. Nous proposons également un protocole pour déterminer le K _d in situ de CatchER ⁺ dans les cellules myoblastes C2C12 et quaNtification de basal [Ca ²⁺ ].

Protocole

1. Préparation de la diapositive

1. Placez des lames de microscope en verre de 22 mm x 40 mm dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm, 1 glissière par plat.
2. Exposez chaque côté de chaque glissière ainsi que le plat de 6 cm à la lumière ultraviolette (UV) pendant 15 à 20 minutes pour la stériliser dans un capot stérile.
3. Couvrir la vaisselle avec des toboggans à l'intérieur avec un parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.

2. Préparation des supports, des tampons, des solutions et des réactifs

1. Préparer 1 L de solution équilibrée de sel de Hank (HBSS) dans de l'eau désionisée et ajouter 10 mM d'HEPES, 5 mM de NaHC03 et 1 mM d'EGTA. Ajuster à pH 7,2-7,3 avec du NaOH. Tampon de filtre avec un filtre de 0,22 μm dans une bouteille autoclavée.
2. Préparez 900 ml de milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) dans de l'eau désionisée. Ajouter 44 mM de NaHC03 et ajuster le pH à 7,2-7,3 avec du HCl. Filtre avec un filtre de 0,22 μm dans une bouteille autoclavée. Ajouter 100 ml de bovin fœtalNe Sérum (FBS) sur les médias pour rendre la concentration de FBS 10%. Conserver à 4 ° C.
3. Préparer 1 L de tampon intracellulaire (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 ​​mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,25. La finale [Ca ²⁺ ] sera de ~ 100 nM. Avant utilisation, ajouter 0,5 mM d'ATP. Ranger à température ambiante.
4. Préparer 1 L de tampon de Ringer (121 mM de NaCl, 2,4 mM de K ₂ HPO ₄ , 0,4 mM de KH ₂ PO ₄ , 10 mM d'HEPES et 1,2 mM de MgCl2) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,2. Ranger à température ambiante. Pour utiliser, aliquotez 50 ml dans un tube de 50 ml et ajoutez 1,8 mM de Ca ²⁺ et 10 mM de glucose.
5. Préparer 1 L de solution de rinçage KCl (125 mM de KCl, 25 mM de NaCl, 10 mM d'HEPES, 0,2 mM de MgCl2) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,25.
6. Dissoudre 5 mg d'ionomycine dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Aliquote 30 μL en microtubes et entreposez à -206; C.
7. Préparer le stock d'acide cyclopiazonique (CPA) en dissolvant CPA dans DMSO. Assurez-vous que le pourcentage final de DMSO est ≤ 1% pour le CPA ajouté aux cellules pour prévenir l'apoptose. Préparer du 4-chloro-m-crésol 20 mM (4 cmc) en dissolvant dans de l'H ₂ O filtré et le laisser dissoudre pendant une nuit en agitant à 37 ° C. Préparer le stock d'ATP en dissolvant dans H ₂ O filtré à 100 mM.
8. Pour déterminer le K _d in situ , préparer 15 ml chacun de 1 mM d'EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM et 100 mM de Ca ²⁺ dans du tampon KCl en utilisant un 100 MM de stock d'EGTA et un stock de CaCl ₂ 1 M dissous dans de l'eau désionisée.

3. Culture cellulaire

1. Culture C2C12 myoblast et cellules HEK293 selon les protocoles ATCC pour chaque utilisation de boîtes de culture cellulaire de 10 cm dans une hotte UV stérile.
   NOTE: Les cellules C2C12 ne doivent pas être autorisées à croître à plus de ~ 70% de confluence puisque les myoblastes commenceront à différerDans les myotubes. Les cellules HEK293 et ​​C2C12 se développent facilement et ne devraient pas dépasser 100% de confluence pour maintenir l'intégrité de la cellule. En outre, les cellules ne doivent pas être passées plus de 10 fois avant de les utiliser pour une expérience afin de préserver la santé des cellules.

4. Transfection des cellules HEK293

1. Les cellules HEK293 de semences sur des lames de microscope en verre stérilisées de 22 mm x 40 mm dans des plaques de 6 cm, de sorte qu'elles sont confluées à 70% le jour de la transfection.
2. Le lendemain, suivez le protocole du fabricant pour le réactif de transfection pour transfecter des cellules en utilisant 2 μg d'ADNc CatchER ⁺ et un rapport ADN: rapport de réactif de transfection dans le milieu de sérum réduit ( p. Ex. Opti-MEM) 1: 3 (poids / volume).
3. Videz les milieux DMEM du plat et ajoutez 3 mL de sérum réduit. Ajouter l'ADN: mélange de réactif de transfection dans le plat et incuber pendant 4-6 h à 37 ° C.
4. Après incubation, laver les cellules avec 5-6 mL de HBSS. Jeter le HBSS fRomper le plat et remplacer par 3 mL de DMEM frais et les incuber à 37 ° C pendant 48 h pour permettre l'expression du GECI.
5. Transfection de cellules de myoblastes C2C12
   1. Pour les cellules de myoblastes C2C12, trypsiniser les cellules en ajoutant suffisamment de trypsine pour couvrir le fond du plat (1-2 ml). Placer le plat dans un incubateur de 37 ° C pendant 2 à 6 minutes pour permettre à la trypsine de desserrer les cellules du fond du plat.
   2. Une fois l'incubation terminée, retirer la trypsine et aspirer les cellules dans 8 mL de DMEM. Pipettez les cellules à fond avec le DMEM pour disperser et ré-suspendre les cellules et les semer sur des lamelles stériles dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm contenant 3 mL de DMEM afin que la confluence finale soit de 60%.
   3. Transférez les cellules le même jour que décrit à l'étape 4.2-4.3. Incuber pendant 24 h à 37 ° C.
   4. Répétez l'étape 4.4.

5. Préparation du microscope à glissière et fluorescence

1. Allumez mIcroscope et source lumineuse, puis ouvrez le programme Simple PCI. Laisser le microscope se réchauffer pendant 15 à 20 minutes ou jusqu'à ce que la caméra du dispositif à couplage par charge (CCD) refroidisse à -65 ° C. Préparez la chambre et glissez avec les cellules en attente.
2. Couvrez le fond de la chambre d'imagerie de bain à diamant ouverte à profil bas avec une fine couche d'agent d'étanchéité, à l'aide d'un coton-tige.
3. Prenez la glissière contenant des cellules transfectées hors de l'incubateur et rincez doucement trois fois avec 1 ml de tampon de Ringer avec 10 mM de glucose et 1,8 mM de Ca ^{2 +} préchauffé à 37 ° C.
4. Laisser 1 mL de tampon de Ringer dans le plat, pour éviter que les cellules ne se séchent et utiliser une pince pour retirer la lame du plat. Laisser l'excès de solution absorber sur un tissu de laboratoire en touchant le bord de la glissière sur un tissu de laboratoire. Ensuite, placez-les sur le côté de la chambre contenant la graisse avec des cellules orientées vers le haut en direction de la graisse et fixez la chambre sur le montage du plateau à l'aide d'un tournevis.
5. Ajouter 1Ml de tampon de Ringer dans la chambre pour empêcher les cellules de sécher pendant le montage de la chambre sur la scène et compléter le reste de la configuration du microscope. Une fois que le tuyau d'aspiration sous vide est fixé à la chambre, le volume final de la chambre est de ~ 450 μL.
6. Changez l'objectif du microscope à l'objectif d'immersion en huile 40X.
7. Utilisez un papier d'objectif et une solution de nettoyage d'objectif pour nettoyer et sécher l'objectif. Ne frottez pas l'objectif. Dab doucement jusqu'à ce que la surface soit propre.
8. Ajouter une goutte de l'huile d'immersion à l'objectif.
9. Placez le support sur le stade du microscope et ajoutez la pointe d'aspiration à la chambre. Une fois que le tuyau d'aspiration sous vide est fixé à la chambre et allumé, le volume final de la chambre est de ~ 450 μL. Ce volume final est au niveau des côtés de la chambre. Il est impératif que la solution de la chambre soit au niveau, au cours de l'expérience, pour éviter que la solution ne se déverse dans l'objectif en raison du remplissage excessif.
10. Relevez l'objectif et utilisez le réglage grossier jusqu'à ce que l'huile de l'objectif touche le bas de la glissière.
11. En utilisant le mode de champ lumineux, ajustez le gain à 175 et le temps d'exposition à 0,03 s pour concentrer les cellules.
12. Une fois que les cellules sont focalisées, passez en mode fluorescence en utilisant une excitation de 488 nm. Changez le temps d'exposition à 0,07 s. Localisez un champ de vision qui contient suffisamment de cellules qui sont en bonne santé avec une fluorescence adéquate à l'image.
13. Une fois qu'un champ de vision a été choisi, prenez des photos en mode fluorescence et en champ lumineux.
14. Entourez une région d'intérêt (ROI) dans les cellules ou encercler la cellule entière pour enregistrer l'intensité de la zone choisie.

6. Impression de transitoires Ca ²⁺ induits par des médicaments et Calibration in situ K _d

1. Mesure d'intensité de démarrage avec cadence de trame réglée à une fois tous les 5 s.
2. Permettre à l'intensité de base de se stabiliser pour 20 à 30 images (100-150 s). Au besoin, diminuez la frAmes / s pendant cette étape pour empêcher le photoblanchage.
3. Calculez la quantité de 4 cmc nécessaire à partir d'un stock 20 mM basé sur le volume final de la chambre de ~ 450 μL pour obtenir une concentration finale de 200 μM. Effectuez des dilutions du stock si nécessaire.
4. Prenez soigneusement 60 μL de tampon Ringer de la chambre et placez-le dans un tube à microcentrifugeuse. Diluer la quantité calculée de 4 cmc avec cette solution et ajouter à la chambre pour évoquer la réponse voulue des cellules en cours d'image.
5. Ajouter la quantité calculée de 4 cmc au tube de microcentrifugeuse et mélanger par pipettage.
6. Ajoutez doucement la solution sur le champ de vision tout en ajoutant simultanément le marqueur d'événement dans la mesure d'intensité.
7. Laisser le temps pour le médicament de se lier au récepteur et le signe subséquent diminuer, puis laver avec 3-6 mL de tampon de Ringer avec 1.8 mM de Ca ²⁺ et 10 mM de glucose tout en ajoutant simultanément le marqueur de l'événement. Comme le volume de la chambre est de 450 &# 181; L et est connecté à un vide, en ajoutant 3 à 6 ml de tampon assure que l'ancienne solution contenant le médicament a été emportée et remplacée par la solution nouvellement ajoutée.
8. Répétez 6.1-6.7 pour ATP 100 μM et CPA 15 μM, en utilisant une nouvelle glissière de cellules transfectées pour chaque dosage.
9. Une fois la mesure terminée, terminez la collecte de données dans la fenêtre de mesure d'intensité dans le programme Simple PCI.
10. Prenez des images fluorescentes et lumineuses des cellules.
11. Ouvrez le fichier de données pour l'expérience. Ici, re-encercler les cellules ou régions d'intérêt pour recalculer les valeurs d'intensité, si nécessaire.
12. Pour déterminer le Kd in situ dans les cellules myoblastes C2C12, suivre le protocole décrit dans la section 4.2 et la section 5 et mettre 1 ml de tampon 0 mM Ca ²⁺ Ringer dans la chambre.
    1. Perméabiliser les cellules avec 0,002-0,005% de saponine dans un tampon intracellulaire pendant 15 à 30 s pour vider les cellules de toutCatch ^{+ +} peut être dans le cytosol. Laver les cellules avec 3 à 6 ml de 1 mL d'EGTA dans un tampon KCl avec 10 μM d'ionomycine. Permettre à l'intensité de diminuer jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint.
    2. Rincer avec 3-6 mL de tampon KCl avec une ionomycine 10 μM et permettre à l'intensité de se stabiliser, puis ajouter chaque solution de Ca ²⁺ détaillée à l'étape 2.7. Permettre à l'intensité d'atteindre un plateau entre chaque addition.
13. Pour calibrer le capteur pour la quantification basale [Ca ²⁺ ], suivez l'étape 6.12. Utilisez l'EGTA et le tampon 100 mM Ca ²⁺ de l'étape 2.7 pour obtenir l'intensité de fluorescence minimale et maximale.

7. Traitement des données

1. Téléchargez le fichier tableur des données de mesure d'intensité.
2. Normaliser les données pour chaque cellule à l'intensité de la ligne de base (F / F ₀ ). Tracer les données normalisées en fonction du temps dans n'importe quel programme graphique.
3. Pour calculer le changement%, soustrayez le pic maximal normaliséUe de 1 et multipliez par 100. Calculer la moyenne et l'écart type si plusieurs cellules ont été imagées.
4. Pour calculer le rapport signal sur bruit, SNR, ouvrez le fichier image sauvegardé à partir de l'expérience dans un logiciel de traitement d'image, tel que ImageJ, puis mesurez le signal, les cellules transfectées et le fond du bruit. Calculer le SNR en utilisant l'équation SNR = signal / bruit.
5. Pour calculer le K _D in situ à partir des données d'imagerie de fluorescence collectées, moyenne des données d'intensité, comprenant les plateaux, après addition de chaque concentration de Ca ²⁺ et EGTA (0 mM Ca ²⁺ ). Calculer la saturation fractionnaire (intensité relative) en utilisant θ = (F - F _min ) / (F _max - F _min ), où θ est l'intensité relative, F est la fluorescence à n'importe quel point, F _min est l'intensité de fluorescence minimale et F _max est l'intensité maximale de fluorescence, pour voir la variation de l'intensité de tIl sonde avec l'addition de Ca ²⁺ par rapport à l'intensité minimale. Tracer les données d'intensité relative contre [Ca ²⁺ ] dans n'importe quel programme de montage graphique et de courbe. Utilisez l'équation de liaison 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) traduit pour n'importe quel programme de montage graphique et courbe pour calculer le K _d . M _T est la concentration totale en métal.
6. Pour quantifier le calcium basal de l'étalonnage décrit en 6.13, moyenne des données d'intensité, comprenant les plateaux, après addition d'EGTA 1 mM (F _min ) et 100 mM Ca ²⁺ (F _max ). Utilisez l'équation d'étalonnage [Ca ²⁺ ] = K _d ([F - F _min ) / (F _max - F)] pour calculer le calcium basal.

Résultats

Cette section illustrera les résultats obtenus en utilisant les méthodes décrites précédemment en utilisant le GECI CatchER ⁺ optimisé ER / SR pour surveiller les changements dans ER / SR Ca ²⁺ à travers différentes voies médiées par les récepteurs.

La figure 1 illustre la vidange ER à travers le RyR stimulé avec 200 μM de 4 cmc. 4 cmc est un agoniste du RyR. L&...

Discussion

L'imagerie monocellulaire vivante de sondes fluorescentes, comme CatchER ⁺ , est une technique efficace pour analyser des processus complexes de signalisation ER / SR Ca ²⁺ dans chaque cellule en réponse à des agonistes ou antagonistes de récepteurs. Cette technique est également utile pour l'imagerie en utilisant simultanément plusieurs longueurs d'ondes, telles que nécessaire pour Fura-2 ou pour l'image de CatchER ⁺ et Rhod-2 pour surveiller à la fois les variati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046