Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Riepilogo

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER ⁺ per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K _d in situ .

Abstract

I transitori intracellulari di calcio (Ca ²⁺ ) evocati da stimoli extracellulari iniziano una moltitudine di processi biologici negli organismi viventi. Al centro del rilascio di calcio intracellulare sono i principali organici intracellulari di stoccaggio del calcio, il reticolo endoplasmatico (ER) e il reticolo sarcoplasmatico più specializzato (SR) nelle cellule muscolari. La liberazione dinamica del calcio da questi organelli è mediata dal recettore del ryanodine (RyR) e dall'inositolo 1,4,5-trifosfato (IP ₃ R) con ricarico che si verificano attraverso la pompa sarco / endoplasmatica calcio ATPase (SERCA). Un sensore di calcio geneticamente codificato (GECI) chiamato CatchER è stato creato per monitorare il rilascio rapido del calcio dalla ER / SR. Ecco i protocolli dettagliati per la trasfezione e l'espressione del migliorato GECI CatchER ⁺ targeting ER / SR nelle cellule HEK293 e C2C12 e la sua applicazione nel monitoraggio del transitorio di calcio mediato dalla pompa IP ₃ R, RyR e SERCAIn cellule HEK293 utilizzando microscopia a fluorescenza è descritto. L'agonista del recettore o l'inibitore della scelta è disperso nella soluzione della camera e i cambiamenti di intensità sono registrati in tempo reale. Con questo metodo si osserva una diminuzione del calcio ER con attivazione di RyR con 4-cloro-m-cresolo (4-cmc), l'attivazione indiretta di IP ₃ R con adenosina trifosfato (ATP) e l'inibizione della pompa SERCA con ciclopiazonico Acido (CPA). Discutiamo anche i protocolli per la determinazione del K _d in situ e la quantificazione basale [Ca ²⁺ ] nelle cellule C2C12. In sintesi, questi protocolli, usati in combinazione con CatchER ⁺ , possono elicitare il rilascio di calcio mediato dal recettore dalla ER con applicazione futura nello studio delle patologie correlate al calcio ER / SR.

Introduzione

Gli attributi spazio-temporali dei transitori intracellulari del calcio (Ca ²⁺ ) attivano varie funzioni biologiche ¹ . Questi eventi di segnalazione Ca ²⁺ vengono scatenati extracellulari attraverso diversi stimoli e controllati intracellulariamente dalle principali organelle di stoccaggio Ca ²⁺ e da numerose Ca ²⁺ pompe, canali e proteine ​​leganti Ca ²⁺ . I transitori Ca ²⁺ possono essere alterati in modo significativo a causa di difetti con la modulazione del segnale, portando a diverse malattie ² . A causa della velocità e dell'intricacy del sistema di segnalazione Ca ²⁺ , con il reticolo endo- (ER) e sarcoplasmatico (SR) al centro, sono necessarie sonde Ca ²⁺ geneticamente codificate che sono state ottimizzate per l'espressione dei mammiferi con una rapida cinetica Per osservare i cambiamenti globali e locali di Ca ²⁺ in cellule diverse ³ .

L'ER e la SR, La sua controparte nelle cellule muscolari, sono i principali organoli di storage Ca ²⁺ intracellulari e fungono da pozzetti Ca ²⁺ che aiutano ad amplificare il segnale Ca ^{2+ 4} . L'ER / SR è parte integrante della segnalazione Ca ²⁺ con doppio ruolo come trasmettitore e ricevitore di segnali ⁵ . Il recettore del ryanodine (RyR) e il recettore inositolo 1,4,5-trifosfato (IP ₃ R) sono recettori di rilascio Ca ²⁺ situati sulle membrane del ER / SR regolate da Ca ^{2+ 6} . Altri agenti stimolano direttamente o indirettamente la funzione di questi recettori. 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) è un potente agonista della RyR, con una sensibilità più alta di 10 volte rispetto alla caffeina per indurre la liberazione di SR Ca ^2+, dove entrambi sono regolarmente impiegati per studiare la rilascio Ca ²⁺ mediata da RyR Cellule sane e malate ⁷ . ATP aumenta il Ca ²⁺ re mediato da IP ₃Leasing attraverso il IP ₃ R ⁸ . ATP si lega al recettore purinergico P2YR, un recettore accoppiato a proteine ​​G (GPCR), innescando la produzione di IP ₃ che si lega all'IP ₃ R per rilasciare Ca ²⁺ dalla ER ^{9 , 10} . La pompa di calcio ATPase (SERCA) di tipo reticolare sarco-endoplasmatico è una pompa ATPasi tipo P, situata anche sulla membrana ER / SR che riduce la Ca ²⁺ citosolica e ricarica l'ER / SR attivamente pompando lo ione nel lumen ER / SR ¹¹ . Gli inibitori specifici della pompa SERCA includono thapsigargin, da Thapsia garganica e acido ciclopiazonico (CPA), da Aspergillus e Penicillium . La CPA ha una bassa affinità per la pompa e reversibilmente blocca il punto di accesso Ca ^{2+ 12} . Thapsigargin, d'altro canto, si lega irreversibilmente alla pompa libera Ca ²⁺ al residuo F256 nell'elica M3 con nanomoloAffinità ¹¹ . Analizzare e quantificare i cambiamenti coinvolti negli eventi stimolati da Ca ²⁺ è stato e rimane una sfida. Dal momento che l'ER / SR è il principale contenitore subcellulare Ca ²⁺ contenente una funzione centrale nella propagazione del segnale Ca ²⁺ , molti lavori sono stati focalizzati sulla comprensione del segnale ER / SR Ca ^{2+ 5} .

La creazione di coloranti sintetici Ca ²⁺ ha contribuito a promuovere il campo e la pratica dell'immagine Ca ²⁺ . Anche se i coloranti, come Mag-Fura-2, sono stati ampiamente utilizzati per misurare Ca ²⁺ compartimentalizzati in diverse cellule, ^{13 , 14 , 15} hanno limitazioni quali il caricamento di tinte non uniformi, la fotolibrazione e l'incapacità di essere destinati a specifici organelli . La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e l'avanzamento delle proteine ​​fluorescenti-Sonde Ca ²⁺ ha spinto il campo di Ca ^{2+ in} avanti ¹⁶ . Alcuni dei GECI esistenti sono coppie di trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) che coinvolgono la proteina fluorescente gialla (YFP), la proteina fluorescente cianica (CFP), il calmodulina e il peptide legante M13 ^{17 , 18} . I GECI a base di Troponin C sono disponibili anche come coppia FRET di CFP e Citrine e come singole sonde di fluoroforo ^{19 , 20 , 21} . Altri, come GCaMP2 e R-GECO, sono singoli sensori fluorofori coinvolgenti la calmodulina ^{22 , 23} . Per superare le limitazioni della sintonizzazione stretta di K _d e di legame cooperativo associato a più siti di legame Ca ²⁺ trovati nei loro domini ²⁴ legati alla Ca ²⁺ , una nuova classe di calcio senI disordini sono stati creati progettando un sito di legame Ca ²⁺ sulla superficie del barile beta in una posizione sensibile al cromoforo di proteine ​​fluorescenti verde avanzate (EGFP) ^{25 , 26} . Questo sensore altamente protetto, chiamato CatchER, ha un K _d di ~ 0,18 mM, ak vicino al limite di diffusione e ak _off di 700 s ^-1 . CatchER è stato usato per monitorare il rilascio di calcio ER / SR mediato dal recettore in diverse linee cellulari di mammiferi come HeLa, HEK293 e C2C12 ²⁵ . A causa della sua rapida cinetica, CatchER è stato utilizzato in fibre muscolari flexor digitorum brevis (FDB) di topi giovani e vecchi Friend Virus B NIH Jackson (FVB) per rivelare che più Ca ²⁺ rimane nella SR dopo 2 s di depolarizzazione nella FDB Fibre di vecchi topi rispetto a quelli dei giovani topi ²⁷ . Per superare la sua bassa fluorescenza a 37 ° C, che ostacola le sue applicazioni nell'immagine del calcio di mammiferiAbbiamo sviluppato una versione migliorata di CatchER chiamata CatchER ⁺ . CatchER ⁺ mostra una migliore fluorescenza a 37 ° C per una migliore applicazione nelle cellule dei mammiferi. Ulteriori mutazioni sono state incorporate in CatchER per migliorare la termostabilità e la fluorescenza a 37 ° C ^{28 , 29} , per creare CatchER ⁺ . CatchER ⁺ mostra un aumento del suo rapporto segnale / rumore (SNR) di sei volte rispetto a CatchER ³⁰ .

Qui vengono presentati i protocolli per la cultura e la trasfezione delle cellule HEK293 e C2C12 con CatchER ⁺ e la sua applicazione per il monitoraggio dei transienti di calcio mediati dal recettore ER / SR. I risultati rappresentativi sono mostrati per CatchER ⁺ espresso in cellule HEK293 trattate con 4-cmc, CPA e ATP. Inoltre forniamo un protocollo per la determinazione del in situ K _d di CatchER ⁺ in cellule miooblasto C2C12 e quaDi basale [Ca ²⁺ ].

Protocollo

1. Preparazione delle diapositive

1. Porre vetrini da microscopio da 22 mm x 40 mm in piatti da coltura a cellule da 6 cm, 1 vetrino per piatto.
2. Esporre ogni lato di ciascuna diapositiva come pure il piatto da 6 cm a luce ultravioletta (UV) per 15-20 minuti per sterilizzare in un cappuccio sterile.
3. Coprire i piatti con diapositive all'interno con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'uso.

2. Preparazione di supporti, buffers, soluzioni e reagenti

1. Preparare 1 L di soluzione salina bilanciata Hank (HBSS) in acqua deionizzata e aggiungere 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 e 1 mM EGTA. Regolare a pH 7,2-7,3 con NaOH. Tampone filtrante con filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata.
2. Preparare 900 ml di alghe di glucosio elevato Dulbecco's Medium (DMEM) modificato in acqua deionizzata. Aggiungere 44 mM NaHCO ₃ e regolare il pH a 7,2-7,3 con HC1. Filtrare i supporti con un filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata. Aggiungere 100 ml di bovi fetaliNe serum (FBS) ai media per ottenere la concentrazione di FBS del 10%. Conservare a 4 ° C.
3. Preparare 1 L di tampone intracellulare (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25. Il finale [Ca ²⁺ ] sarà ~ 100 nM. Prima dell'uso, aggiungere 0.5 mM ATP. Conservare a temperatura ambiente.
4. Preparare 1 l di tampone Ringer (121 mM NaCl, 2,4 mM K ₂ HPO ₄ , 0,4 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mM HEPES e 1,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,2. Conservare a temperatura ambiente. Per l'uso, aliquota 50 mL in un tubo da 50 mL e aggiungere 1.8 mM Ca ²⁺ e 10 mM glucosio.
5. Preparare 1 L di soluzione di risciacquo KCl (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25.
6. Sciogliere 5 mg di ionomicina in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Aliquota 30 μL in microtubi e conservare a -206; C.
7. Preparare l'acido ciclopiazonico (CPA) dissolvendo CPA in DMSO. Assicurarsi che il percentuale finale di DMSO sia ≤ 1% per il CPA aggiunto alle cellule per prevenire l'apoptosi. Preparare 20 mM di 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) sciogliendo in H ₂ O filtrato e lasciandolo sciogliere a notte agitando a 37 ° C. Preparare lo stock di ATP sciogliendo in H ₂ O filtrato fino a 100 mM.
8. Per determinare la K _d in situ, preparare 15 ml di 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM Ca ²⁺ in tampone KCl utilizzando un 100 MM EGTA e uno stock di 1 M CaCl2 disciolti in acqua deionizzata.

3. Cultura cellulare

1. Culture C2C12 myoblast e HEK293 cellule secondo protocolli ATCC per ciascuno utilizzando piatti di coltura cellulare da 10 cm in una cappa UV sterile.
   NOTA: Le cellule C2C12 non dovrebbero essere consentite di crescere al di sopra della confluenza del ~ 70% poiché i mioblasti inizieranno a differenziazioneTe in miotubi. Entrambe le cellule HEK293 e C2C12 crescono prontamente e non dovrebbero essere permesse di crescere oltre confluenza del 100% per mantenere l'integrità cellulare. Inoltre, le cellule non devono essere passate più di 10 volte prima di usarle per un esperimento per preservare la salute delle cellule.

4. Trasfezione delle cellule HEK293

1. Le cellule HEK293 di seme su microscopio di vetro sterilizzato da 22 mm x 40 mm scivolarono in piatti da 6 cm in modo che siano ~ 70% confluenti il ​​giorno della trasfezione.
2. Il giorno dopo, seguire il protocollo del produttore per il reagente di transfezione per trasfettare le cellule usando 2 μg di CatchER ⁺ cDNA e un DNA di 1: 3 (peso / volume): rapporto di reagente di transfezione nei mezzi di siero ridotti ( ad esempio, Opti-MEM).
3. Svuotare il supporto DMEM dal piatto e aggiungere 3 ml di media sierica ridotta. Aggiungere il DNA: la miscela di reagente di transfezione al piatto e incubare per 4-6 h a 37 ° C.
4. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5-6 ml di HBSS. Scartare l'HBSS fIl piatto e sostituire con 3 ml di DMEM fresco e incubarli a 37 ° C per 48 ore per consentire l'espressione del GECI.
5. Trasfezione di cellule miooblasto C2C12
   1. Per le cellule miooblasto C2C12, trypsinizzare le cellule aggiungendo trypsina sufficiente per coprire il fondo del piatto (1-2 mL). Mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C per 2-6 minuti per consentire alla tripsina di allentare le celle dal fondo del piatto.
   2. Una volta completata l'incubazione, togliere la tripsina e aspirare le cellule in 8 ml di DMEM. Pipettate le cellule con il DMEM per disperdere e ri-sospendere uniformemente le cellule te e seminarle su coperchi sterili in piatti da 6 cm di coltura cellulare contenenti 3 ml di DMEM in modo che la confluenza finale sia del 60%.
   3. Trasfettare le cellule lo stesso giorno come descritto nel passaggio 4.2-4.3. Incubare per 24 h a 37 ° C.
   4. Ripetere la fase 4.4.

5. Preparazione del microscopio a scorrimento e fluorescenza

1. Accendere mIcroscopio e sorgente luminosa, quindi aprire il programma Simple PCI. Lasciare che il microscopio si riscaldi per 15-20 min o fino a quando la fotocamera del dispositivo accoppiato a carica (CCD) si raffredda a -65 ° C. Preparare la camera e scivolare con le celle in attesa.
2. Coprire la parte inferiore della camera di imaging con vasca diamantata a basso profilo con un sottile strato di sigillante, utilizzando un tampone di cotone.
3. Prendere la diapositiva contenente le cellule trasfettate dall'incubatore e sciacquare delicatamente tre volte con 1 ml di tampone di Ringer con 10 mM di glucosio e 1,8 mM di Ca ²⁺ preriscaldati a 37 ° C.
4. Lasciare 1 ml di tampone Ringer nel piatto, per impedire le cellule di essiccazione e utilizzare pinze per togliere la scivola dal piatto. Lasciare che la soluzione in eccesso si assorba a un tessuto di laboratorio toccando il bordo della slitta ad un tessuto di laboratorio. Quindi posizionare sul lato della camera contenente il grasso con le celle rivolte verso l'alto verso il grasso e fissare la camera sul supporto a palo con un cacciavite.
5. Aggiungi 1Ml del tampone di Ringer alla camera per impedire alle cellule di essiccare durante il montaggio della camera sul palco e completare il resto della configurazione del microscopio. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera, il volume finale della camera è di ~ 450 μL.
6. Passare l'obiettivo del microscopio all'obiettivo di immersione a olio 40X.
7. Utilizzare la soluzione di pulizia dell'obiettivo e della carta per pulire e asciugare l'obiettivo. Non strofinare l'obiettivo. Colare dolcemente finché la superficie non sia pulita.
8. Aggiungere una goccia dell'olio di immersione all'obiettivo.
9. Mettere il supporto sullo stadio del microscopio e aggiungere la punta del vuoto alla camera. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera e acceso, il volume finale della camera è di ~ 450 μL. Questo volume finale è a livello dei lati della camera. È indispensabile che la soluzione della camera sia, durante l'esperimento, a livello, per impedire che la soluzione venga sparsa verso l'obiettivo a causa del sovraffollamento.
10. Sollevare l'obiettivo e utilizzare la regolazione grossolana finché l'olio sull'obiettivo non tocca il fondo della slitta.
11. Utilizzando la modalità campo luminoso, regolare il guadagno a 175 e il tempo di esposizione a 0,03 s per mettere a fuoco le celle.
12. Una volta che le cellule sono focalizzate, passare alla modalità di fluorescenza utilizzando l'eccitazione di 488 nm. Cambiare il tempo di esposizione a 0,07 s. Individuare un campo di visualizzazione che dispone di cellule sufficienti che sono sane con una fluorescenza adeguata all'immagine.
13. Una volta scelto un campo visivo, scattare foto in modalità fluorescenza e campo luminoso.
14. Cerchi una regione di interesse (ROI) nelle cellule o cerchi la cella intera per registrare l'intensità dell'area scelta.

6. Imaging dei transitori Ca ²⁺ indotti da farmaci e di calibrazione in situ

1. Avviare la misurazione dell'intensità con il frame rate impostato a ogni 5 s.
2. Lasciare che l'intensità di base si stabilizzi per 20-30 fotogrammi (100-150 s). Se necessario, diminuisci il frDurante questa fase per prevenire la fotolibrazione.
3. Calcolare la quantità di 4 cm c necessaria da uno stock di 20 mM in base al volume della camera finale di ~ 450 μL per ottenere una concentrazione finale di 200 μM. Fare diluizioni dello stock se necessario.
4. Prendete con attenzione 60 μL di buffer di Ringer dalla camera e posizionati in un tubo di microcentrifuga. Diluire la quantità calcolata di 4 cmq con questa soluzione e riportare nuovamente alla camera per evocare la risposta prevista dalle cellule in scansione.
5. Aggiungere la quantità calcolata di 4 cm al tubo di microcentrifuga e mescolare pipettando.
6. Aggiungete delicatamente la soluzione sul campo visivo contemporaneamente aggiungendo l'indicatore di eventi nella misura dell'intensità.
7. Lasciare tempo affinché il farmaco si leghi al recettore e successivamente diminuisca il segnale, quindi lavati con 3-6 ml di tampone Ringer con 1.8 mM Ca ²⁺ e 10 mM glucosio, contemporaneamente aggiungendo il marker di eventi. Poiché il volume della camera è di 450 &# 181; L ed è collegato ad un vuoto, aggiungendo 3-6 ml di tampone assicura che l'ex soluzione contenente il farmaco sia stata lavata via e sostituita con la nuova soluzione aggiunta.
8. Ripetere 6.1-6.7 per 100 μM ATP e 15 μM CPA, utilizzando una nuova diapositiva di cellule trasfettate per ogni assaggio.
9. Una volta completata la misurazione, terminare la raccolta dati nella finestra di misurazione dell'intensità nel programma Simple PCI.
10. Prendi fluorescenza e immagini luminose delle cellule.
11. Apri il file di dati per l'esperimento. Qui, ricircolare le cellule o regioni di interesse per ricalcolare i valori di intensità, se necessario.
12. Per determinare la K _d in situ nelle cellule miooblastiche C2C12, seguire il protocollo come descritto nella sezione 4.2 e sezione 5 e mettere 1 ml di 0 mM Ca ²⁺ Ringer's buffer nella camera.
    1. Permeabilizzare le cellule con 0,002-0,005% di saponina nel buffer intracellulare per 15-30 s per svuotare le cellule di qualsiasiCatchER ⁺ che può essere nel citosol. Lavare le cellule con 3-6 mL di 1 mL EGTA in buffer KCl con 10 μM ionomicina. Lasciare diminuire l'intensità fino a raggiungere un plateau.
    2. Sciacquare con 3-6 mL di buffer KCl con 10 μM di ionomicina e lasciare stabilizzare l'intensità, quindi aggiungere ogni soluzione Ca ²⁺ dettagliata nel punto 2.7. Consentire l'intensità di raggiungere un plateau tra ogni aggiunta.
13. Per calibrare il sensore per la quantificazione basale [Ca ²⁺ ], seguire la fase 6.12. Utilizzare l'EGTA e il tampone Ca ^{2+ di} 100 mM dalla fase 2.7 per ottenere l'intensità di fluorescenza minima e massima.

7. Elaborazione dei dati

1. Scaricare il file del foglio di calcolo dei dati di misurazione dell'intensità.
2. Normalizzare i dati per ogni cella all'intensità di base (F / F ₀ ). Tracciare i dati normalizzati rispetto al tempo in qualsiasi programma di grafica.
3. Per calcolare la variazione%, sottrarre la val di picco normalizzataUe da 1 e moltiplicare per 100. Calcolare la deviazione media e standard se sono state immagazzinate più celle.
4. Per calcolare il rapporto segnale / rumore, SNR, aprire il file immagine salvato dall'esperimento in un software di elaborazione immagini, ad esempio ImageJ, e quindi misurare il segnale, le cellule trasfuse e il rumore, lo sfondo. Calcolare l'SNR utilizzando l'equazione SNR = segnale / rumore.
5. Per calcolare l' in situ K _d dai dati raccolti di dati di fluorescenza raccolti, mediate i dati di intensità, che comprendono gli altipiani, dopo l'aggiunta di ciascuna concentrazione di Ca ²⁺ e di EGTA (0 mM Ca ²⁺ ). Calcolare la saturazione frazionaria (intensità relativa) utilizzando θ = (F - F _min ) / (F _max - F _min ) dove θ è l'intensità relativa, F è la fluorescenza in qualsiasi punto, F _min è l'intensità minima di fluorescenza e F _max è l'intensità massima di fluorescenza, per vedere la variazione dell'intensità di tSonda con l'aggiunta di Ca ²⁺ rispetto all'intensità minima. Tracciare i relativi dati di intensità nei confronti del [Ca ²⁺ ] in qualsiasi programma di montaggio curva e grafica. Utilizzare l'equazione di legame 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) tradotto per qualsiasi programma di grafica e curva per calcolare il K _d . M _T è la concentrazione totale del metallo.
6. Per quantificare il calcio basale dalla calibrazione descritta al punto 6.13, mediare i dati di intensità, compresa gli altipiani, dopo l'aggiunta di 1 mM EGTA (F _min ) e 100 mM Ca ²⁺ (Fmax). Utilizzare l'equazione di calibrazione [Ca ²⁺ ] = K _d ([F - F _min ] / (F _max - F)] per calcolare il calcio basale.

Risultati

Questa sezione illustrerà i risultati ottenuti utilizzando i metodi precedentemente descritti usando il GECI CatchER ⁺ mirato ER / SR mirato per monitorare i cambiamenti in ER / SR Ca ²⁺ attraverso diversi percorsi mediati dal recettore.

La figura 1 illustra lo svuotamento ER attraverso il RyR stimolato con 200 μM di 4 cm. 4-cmc è un agonista del RyR. L'aggiunta del fa...

Discussione

L'imaging a cellule singole di sonde fluorescenti, come CatchER ⁺ , è una tecnica efficace per analizzare i processi di segnalazione intrinsecamente ER / SR Ca ²⁺ in ogni cellula in risposta a agonisti o antagonisti del recettore. Questa tecnica è utile anche per l'imaging utilizzando più lunghezze d'onda contemporaneamente, come è necessario per Fura-2 o per l'immagine CatchER ⁺ e Rhod-2 insieme per monitorare rispettivamente i cambiamenti di calcio ER e citosolici. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046