从孤立的大鼠心脏的间质渗出物收集的倒置心脏模型

摘要

该方案描述了从分离的灌注大鼠心脏中收集心脏间质液的方法。为了将间质渗出物与冠状静脉流出物灌注液物理分离，Langendorff灌注的心脏被倒置，并且使用软胶乳帽收集在心脏表面上形成的渗出物（间质液体）。

摘要

本协议描述了一种独特的方法，可以从分离的盐水灌注的大鼠心脏中收集心脏渗出物（CT）。根据Langendorff技术分离和逆行灌注心脏后，将心脏倒置为倒立位置，并通过插入左心室的气囊导管进行机械稳定。然后，预先浇铸以匹配大鼠心脏的平均尺寸的薄胶乳盖被放置在心外膜表面上。胶乳盖的出口连接到硅管，远端开口比心脏底部高10厘米，产生轻微的吸力。在心外膜表面连续生产的CT被收集在冰冷的小瓶中用于进一步分析。对照组和梗死心脏CT值分别为17〜147μL/ min（n = 14），占冠状静脉血液灌注液0.1-1％。蛋白质组学分析和高度信息rmance液相色谱（HPLC）显示收集的CT含有广谱的蛋白质和嘌呤能代谢物。

引言

心衰（HF）是世界人类死亡的主要原因¹ 。 HF经常发生因心肌炎，心肌缺血损伤和左心室重塑，导致心脏收缩功能和患者生活质量逐渐恶化。虽然心脏病学和心脏手术的进步显着降低了HF死亡率，但它们仅仅是一个不可避免的进步性疾病过程的短暂的"延迟者"，具有显着的发病率。因此，目前缺乏有效的治疗强调需要鉴定可预防甚至逆转HF的新型分子靶标。这包括细胞外基质的改变，不受控的心脏免疫反应以及心脏和非心脏细胞之间的相互作用² 。

重要的是要认识到心脏细胞暴露于微环境的微环境tly塑造受伤心脏的免疫和再生反应。在分离的生理盐水灌注的心脏中，在生理和病理生理条件^3,4,5下，以来自间质液空间（ 即微环境）的小液滴的形式在心脏表面产生CT。因此，CT（ 即组织间液）的分析可能有助于识别调节心脏代谢和收缩功能的因素⁶或影响移入受伤心脏后的免疫细胞功能。潜在地，这可能导致开发用于治疗HF的新型治疗策略。

从小鼠心脏收集CT在技术上是具有挑战性的。在常规Langendorff灌注的心脏中，CT的独家收集是困难的，因为CT与冠状动脉的混合静脉流出物灌注液不可预测地稀释从间质空间释放的任何浓度的代谢物/酶。克服这个限制的一个可能的策略是通过插入肺并同时连接肺静脉来排除静脉流出物⁷ 。然而，这种方法面临与肺动脉和静脉的插管和结扎有关的困难，导致静脉流出物潜在渗漏到心脏渗出物中。使用反向心脏模型的概念首先由Kammermeier组引进，Kammermeier将其将分离的灌注心脏倒置到倒置位置，并将薄胶乳帽放置在心外膜表面上，以连续取样CT，而不会导致静脉流出物的污染^8，9 。使用该程序，CT显示提供了从心脏⁹释放的代谢物的非常敏感的测量值，脂肪酸⁸和病毒颗粒¹⁰的毛细管转运。

最近，可能调节局部免疫应答和增加心脏血管生成的旁分泌因子¹¹已经涉及干细胞治疗心脏病的有益作用。逆转心脏中CT的分析可能有助于化学鉴定这些个别旁分泌因子。此外，CT可能有助于确定心脏中免疫细胞体内活化所涉及的因素。

在这里提供的心脏表面CT收集的详细描述对于研究免疫细胞，成纤维细胞，内皮细胞和心肌细胞相对于整体心脏功能的相互作用的研究来说是实验性的。如上所述，间质液携带心脏内细胞间细胞通讯的信息，可以方便地通过收集CT来评估。详细的技术说明，包括如何从反向心脏收集CT的视频协议，应有助于今后应用这种独特的技术。

研究方案

所有实验均经当地监管机构（德国Nordrhein-Westfalen的LANUV）批准，并按照动物使用指南进行。动物喂食标准食物， 随意自来水。实验每个步骤所需的所有设备和化学品均可在材料表中找到 。

1.准备乳胶帽和室内气球

1. 使用与大鼠心脏平均体重（体重300-350克）匹配的铣床制作铝模具。用超细（10/0）砂纸抛光模具。
   注意:模具的详细指标如图1A所示。
2. 将铝模具的颈部垂直固定到铣床上以制备胶乳盖。
   注意:铣床使模具缓慢旋转。或者，可以使用电动机。 LI>
3. 将20mL液体胶乳（商业购买，参见材料表 ）倒入50mL玻璃烧杯中。
4. 降低模具直到模具的整个身体浸入胶乳溶液中。
5. 在旋转的同时慢慢抬起模具（5厘米/分钟）。
6. 继续旋转模具15分钟，直到模具表面的胶乳固化。
7. 在模具的表面（已经被薄的胶乳膜覆盖）上加入约1g滑石粉，以防止在分离时损坏。
8. 用手指从模具表面轻轻取下已经干燥的乳胶帽;胶乳帽现在可以使用（ 图1B ）。
9. 将胶乳帽的出口连接到15厘米硅胶管（ID = 0.2毫米），以后用于收集CT。
10. 用水填充心室乳胶球囊并将其牢固地固定在连接到1毫升充水注射器的L形金属插管（>图1C）。
    注意:这将用于确保心脏的直立定位（见下文）。
11. 使用附带的1 mL注射器进行几次放气/充气试验，确保气囊密封。
12. 将插管通过三通止动器连接到压力传感器，以便将来测量心室内发育压力（ 图1C ）。

2.制备Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）和Langendorff灌注系统

1. 通过使用恒流（由辊泵驱动）或恒压（由玻璃柱中的静压产生）模式来设置Langendorff灌注系统。
   注意:Langendorff心脏准备的细节已经在之前描述过¹² 。
2. 制备2L改性KHB（mM:116.02NaCl，4.63KCl，1.10 MgSO ₄ ·7H ₂ O，1.21K ₂ HPO ₄ 2 ·2H ₂ O，24.88 NaHCO 3，8.30 D-葡萄糖和2.0丙酮酸钠）。
   1. 将所有化学品称重，然后称取CaCl _2，并将其溶解于2升烧瓶中1.8升双蒸水中。
   2. 在磁力搅拌下，将含有碳原子（95％O ₂ /5％CO ₂ ）的培养基鼓泡至少5分钟以平衡（pH:7.4）。
   3. 加入0.74g CaCl _2· 2H ₂ O，并用双蒸水将总体积达到2L。
   4. 继续搅拌并用碳源鼓泡培养基5分钟。
   5. 通过0.2μm过滤器过滤KHB，以消除可能阻碍心脏微循环的小颗粒。
3. Langendorff灌注系统的准备。
   1. 将过滤的KHB置于预热水浴（38℃）中;保持鼓泡与碳源产生100 cmH ₂ O的内部压力KHB水库。
   2. 将储存器连接到玻璃柱，以建立用于KHB的Langendorff灌注的100cmH ₂ O静水压力;继续用碳源鼓泡柱内的KHB。
   3. 调整加温系统的温度，使主动脉插管出口处的温度为37°C。
   4. 确保油管系统无气泡。
   5. 将KHB与碳源再氧化5分钟，直到KHB中的PO ₂达到500-600mmHg（通过血气分析仪测量）。
4. 将灌注系统设置为在100 cmH ₂ O的恒定压力下运行，或者使用手动切换以约10-20 mL / min的恒定流量运行。或者，使用可互换的STH泵控制器立即切换到灌注模式。

心脏的隔离和插管

注意:体重为30的雄性Wistar大鼠使用0-350g，使得心脏的尺寸与预制乳胶帽匹配。大鼠进行左侧动脉下垂（LAD）的连接50分钟，然后再灌注或假手术。报告了心肌梗死（MI）诱导方法的细节。手术后5天对梗死动物进行逆心实验。

1. 使用连接到动物饲养室（20L）的异氟烷蒸发器（2％V / V）麻醉大鼠。
2. 深度麻醉后，将大鼠转移到手术台（不受温度控制）。
3. 使用镊子将肌肉和肌肉提起到胸骨正下方，用重型剪刀将肋骨的下边缘切开。
4. 使用精细的剪刀，在肋边缘做一个小切口的隔膜。尾部切割，使整个腹侧胸壁的瓣。
5. 用拇指轻轻抓住心脏索引和中指，并缓慢向上提升，使心脏容器变得轻微拉伸。
6. 消除心脏直到主动脉完全暴露。
7. 将心脏置于含有50mL冰冷KHB（4℃）的100mL烧杯中，并将其移至灌注装置。
8. 立即将心脏通过主动脉安装到滴水插管上，并用缝合线（4-0）牢固地拧紧。避免气泡进入心脏。
9. 施加恒定灌注压力（100 cmH ₂ O）。或者，可以应用完全流速（以20mL / min开始）。
   注意:从胸部开放到心脏附着到灌注套管的时间应该在有经验的操作者手中约3分钟。

反转心脏模型

1. 轻轻旋转主动脉插管，直到心脏后壁处于正面 。
2. 用剪刀取出结缔组织暴露左心房的开口，使其准备好用于心室内插管。
3. 将通过左心房连接到刚性导管的放气乳胶球囊插入左心室。
4. 充气气球，直到充满整个心室（充气体积被预先标记在注射器上）。
5. 反转心脏直到它倒置，由心室内气囊导管支持它。
6. 如图1C所示 ，使用具有刚性金属导管的心室内球囊将反转心脏机械稳定在直立位置。
7. 调整心脏的位置以避免主动脉根部的过度扭曲。
8. 将舒张压调整至3-5 mmHg（由室内球囊测量; 见图1C ）。
9. 观察心脏的心外膜表面，确保形成小液滴。
10. 放乳胶帽o通过轻轻推动心脏的表面，用手指覆盖整个心脏。
11. 确保乳胶帽覆盖大部分心室表面。
12. 通过用1-mL注射器轻轻吸取，去除盖子和管道内的气泡（如果有的话）。
13. 将CT放气管的远端开口调整到心脏水平面以下10厘米处。
    注意:此步骤确保通过负静压力轻微吸吮。
14. 在1.5mL收集管中收集CT滴，放入冰中，与NaCl混合1:1。收集约0.15-1.5 mL的CT。
    注意:冰/ NaCl混合物将采集管中的温度稳定在零下（约-4°C）。
    注意:取样时间取决于实验目的。假手术动物（n = 3），冠状动脉结扎动物（n = 11）的CT流量约为27±20μL/ min。
15. 称重和快速冻结CT样品在液氮中并将其储存在-80°C进行后续测量。

5. CT分析

1. 根据科学问题，使用CT流体分析代谢物。
   注意:从恒压灌注（100cmH ₂ O）收集图2和图3所示的数据，并在10分钟内收集约0.15-1.5mL CT流体。这个时间和体积对于各种嘌呤的蛋白质组学（最小值:50μL; 图2 ） ¹⁴和HPLC（最小值:20μL; 图3 ） ¹⁵是足够的。

结果

逆心模型能够在分离的，逆灌注的大鼠心脏中收集心脏间质渗出物（ 图1A- C ）。当在100cmH ₂ O的恒定压力下灌注时，组织液形成的速率在17和147μL/ min之间，占分离心脏中冠状静脉流出物的0.1-1％。

用二喹啉酸（BCA）测定的CT的蛋白质含量为1.08±0.40mg / mL（n = 6）。一维凝胶电泳分?...

讨论

逆心模型基于已建立的Langendorff心脏灌注技术^12，并且通过简单地将心脏逆转到颠倒位置并使用刚性心室内球囊导管来保持该位置来执行。以这种方式，心脏间质渗出物可以与冠心静脉流出物灌注液物理分离，通过重力从心脏⁹的底部滴落。 CT可以通过放置在整个心脏表面上的薄而柔软的乳胶帽来连续收集。

该方法易于执行，除了Langendorff设?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model