고립 된 랫트 심장으로부터의 간질과 투과 물 수집을위한 역전 된 심장 모델

요약

이 프로토콜은 고립 된, 관류 쥐 심장에서 심장 간질 유체를 수집하는 방법을 설명합니다. 관상 정맥 유출 물 관류 액으로부터 간질 혈관 유출 물을 물리적으로 분리하기 위해 관류 액 Langendorff가 반전되고 심장 표면에 형성된 유액 (간질 액)이 부드러운 라텍스 캡을 사용하여 수집됩니다.

초록

현재의 프로토콜은 고립 된, 염분 - 관류 쥐 심장에서 심장 transudate (CT)의 수집을 가능하게 독특한 접근 방식을 설명합니다. Langendorff 기술에 따라 심장의 격리 및 역류 관류 후 심장은 거꾸로 된 위치로 거꾸로 뒤집히고 좌심실에 삽입 된 풍선 카테터로 기계적으로 안정화됩니다. 그런 다음 얇은 라텍스 캡 (이전에 랫트 심장의 평균 크기와 일치하도록 캐스트)이 심 외막 표면 위에 배치됩니다. 라텍스 캡의 배출구는 실리콘 튜브에 연결되어 있으며, 심장의 기저부 아래 10cm 떨어진 원위 구멍이있어 약간의 흡입력을 생성합니다. 심 외막 표면에서 지속적으로 생성 된 CT는 추후 분석을 위해 얼음 냉각 바이알에 수집됩니다. 관상 동맥 정맥 유출 물 관류 액의 0.1-1 %를 차지하는 대조군과 경색 심전도에서 CT 생성 속도는 17 ~ 147 μL / min (n = 14)이었다. 프로테옴 분석 및 높은 perfo액상 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 수집 된 CT가 넓은 범위의 단백질과 푸린 일 대사 산물을 함유하고 있음을 보여주었습니다.

서문

심장 마비 (HF)는 전 세계적으로 인간의 주요 사망 원인입니다 ¹ . HF는 심근염, 허혈성 심근 손상, 좌심실 재 형성으로 인해 종종 발생하며 심장 수축 기능 및 환자의 삶의 질이 점진적으로 악화됩니다. 심장학 및 심장 수술의 진보가 HF 사망률을 현저히 낮추었지만, 심각한 병적 상태를 수반하는 불가피하게 진보적 인 질병 과정의 일시적인 지연 기 (delayers)로 작용할뿐입니다. 따라서 현재 유효한 치료법이 부족하여 HF를 예방하거나 심지어 역전시킬 수있는 새로운 분자 표적을 확인해야 할 필요성이 강조됩니다. 여기에는 세포 외 기질의 변화, 조절되지 않은 심장 면역 반응, 심장 및 비 - 심장 세포 간의 상호 작용이 포함됩니다 ² .

심장 세포가 direc에 노출되는 미세 환경부상당한 심장의 면역 및 재생 반응을 형성합니다. 격리 된 식염수 - 관류 심장에서 CT는 생리 및 병태 생리 조건 ^{3 , 4 , 5} 모두에서 간질 유체 공간 ( 즉, 미세 환경)에서 파생 된 작은 물방울의 형태로 심장 표면에 생성됩니다. 따라서 CT (간질 액)의 분석은 심장 대사 및 수축 기능을 조절하거나 부상당한 심장으로 이동 한 후 면역 세포 기능에 영향을주는 요인을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 잠재적으로 이것은 HF 치료를위한 새로운 치료 전략의 개발로 이어질 수 있습니다.

쥐 마음에서 CT 수집은 기술적으로 어렵습니다. 랑겐 도르프 (Langendorff)가 관류하는 보통의 심장에서 CT의 독점적 수집은 어렵다. 왜냐하면 CT와 코로나정맥 유출 물 관류 액은 틈새 공간에서 방출되는 대사 산물 / 효소의 농도를 예측할 수 없게 희석시킨다. 이 한계를 극복하기위한 가능한 한 가지 전략은 폐를 삽입하고 동시에 폐 정맥을 결찰하여 정맥 유출 물을 배제하는 것입니다. 그러나,이 방법은 폐동맥 및 정맥의 삽입 및 결찰과 관련된 어려움에 직면하여, 정맥 유출 물이 잠재적으로 심장 누출 물로 누출 될 수있다. 반전 심장 모델 사용의 개념은 고립 된 관류 된 심장을 거꾸로 된 위치로 뒤집어 놓은 심낭 표면에 얇은 라텍스 캡을 놓고 정맥류 유출 물의 오염없이 CT를 연속적으로 샘플링하는 Kammermeier 그룹에 의해 처음 소개되었습니다 ^{8 , 9} . 이 절차를 사용하여 CT는 심장 ⁹ 에서 방출 된 대사 산물의 매우 민감한 측정을 제공하는 것으로 나타났습니다.지방산 ⁸ 및 바이러스 입자 ¹⁰ 의 모세관 이동.

최근에, 국소 면역 반응을 조절하고 심장 혈관 신생을 증가시키는 파라 크린 인자 (facacrine factors)가 줄기 세포 기반 치료법의 심장 질환에 대한 유익한 효과에 연루되어있다. 역전 된 심장에서의 CT 분석은 이러한 개별 파라 크린 요소를 화학적으로 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 CT는 심장에서 면역 세포의 생체 내 활성화에 관련된 요인을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에 제공된 심장 표면에서 CT 수집에 대한 자세한 설명은 전반적인 심장 기능과 관련하여 면역 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 세포의 상호 작용을 연구하는 연구자에게 실험적으로 유용합니다. 전술 한 바와 같이, 간질 액은 심장 내에서 세포 간 통신을위한 정보를 운반한다.ich는 CT의 수집에 의해 편리하게 평가 될 수있다. 반전 된 심장에서 CT를 수집하는 방법에 대한 비디오 프로토콜을 포함한 자세한 기술 설명은이 고유 기술의 향후 적용을 용이하게해야합니다.

프로토콜

모든 실험은 현지 규제 기관 ( LANUV of Nordrhein-Westfalen, Germany)의 승인을 받아 동물 용 지침에 따라 수행되었습니다. 동물에게 표준식이 요법을 공급하고 수돗물을 자유롭게 섭취 하였다. 실험의 각 단계에 필요한 모든 장비 및 화학 물질은 Table of Materials에 나와 있습니다.

1. 라텍스 캡과 심실 내 풍선의 준비

1. 쥐 심장 (300-350g의 몸무게)의 평균 크기와 일치하는 밀링 머신을 사용하여 알루미늄 몰드를 만드십시오. 극 미세 (10/0) ​​에머리 종이로 곰팡이를 연마하십시오.
   참고 : 몰드의 상세한 메트릭은 그림 1A에 나와 있습니다.
2. 알루미늄 몰드의 목 부분을 밀링 기계에 수직으로 고정하여 라텍스 캡을 준비하십시오.
   참고 : 밀링 머신은 금형을 천천히 회전시킵니다. 대안으로, 전기 모터가 사용될 수있다. li>
3. 50 mL 유리 비이커에 20 mL의 액체 라텍스 (상업적으로 구입, 재료 표 참조)를 붓습니다.
4. 주형의 전체 몸체가 라텍스 용액에 잠길 때까지 주형을 낮추십시오.
5. 회전하면서 천천히 몰드 (5cm / min)를 들어 올립니다.
6. 금형 표면의 라텍스가 고형화 될 때까지 금형을 15 분간 더 회전시킨다.
7. 떼어 낼 때 손상을 방지하기 위해 곰팡이 표면 (이미 얇은 라텍스 필름으로 덮여 있음)에 약 1g의 활석 가루를 더합니다.
8. 몰드 표면에서 이미 건조 된 라텍스 캡을 손가락으로 부드럽게 떼어냅니다. 라텍스 캡을 사용할 준비가되었습니다 ( 그림 1B ).
9. 라텍스 캡의 출구를 15cm 실리콘 튜빙 (ID = 0.2mm)에 연결하고 나중에 CT 수집에 사용합니다.
10. 심실 라텍스 풍선을 물로 채우고 1 mL의 물을 채운 주사기에 연결된 L 자 모양의 금속 캐뉼라에 단단히 고정시킵니다 (> 그림 1C).
    참고 : 이것은 심장을 똑바로 세우는 데 사용됩니다 (아래 참조).
11. 부착 된 1 mL 주사기로 수축 / 팽창 테스트를 수행하여 풍선이 밀폐되었는지 확인하십시오.
12. 차실 내 발달 압력의 미래 측정을 위해 압력 트랜스 듀서에 3 방향 정지 장치를 통해 캐 뉼러를 연결하십시오 ( 그림 1C ).

2. Krebs - Henseleit 버퍼 (KHB) 및 Langendorff 관류 시스템의 준비

1. 상수 (롤러 펌프로 구동) 또는 일정 압력 (유리 컬럼의 정압으로 생성) 모드를 사용하여 Langendorff 관류 시스템을 설정하십시오.
   참고 : Langendorff 심장 조제에 대한 자세한 내용은 이전에 설명되어 있습니다 ¹² .
2. 수정 된 KHB (mM 단위로 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4 · 7H ₂ O, 1.21 K ₂ HPO ₄
3. CaCl _2를 제외한 모든 화학 제품의 무게를 재고 2L 플라스크에 1.8L의 이중 증류수에 용해시킨다.
4. 자기 교반하에 carbogen (95 % O ₂ / 5 % CO ₂ )으로 적어도 5 분 동안 평형 (pH : 7.4)을 위해 배지를 버블 링하십시오.
5. 0.74 g의 CaCl2 .2H2O를 첨가하고 이중 증류수로 전체 부피를 2 L로한다.
6. 추가 5 분 동안 carbogen으로 배지를 계속 저어주고 버블 링하십시오.
7. 0.2 μm 필터를 통해 KHB를 필터링하여 심장의 미세 순환을 방해 할 수있는 작은 입자를 제거합니다.

Langendorff 재관류 시스템의 준비.

1. KHB를 미리 예열 된 수조 (38 ° C)에 넣으십시오. 100cmH2O 내부 압력을 생성하기 위해 카보 겐에 버블 링 유지KHB 저장소.
2. KHB로 Langendorff 관류를 위해 100 cmH ₂ O 정수압을 만들기 위해 저수지를 유리 칼럼에 연결하십시오. 카보 겐으로 칼럼 내부의 KHB 버블 링을 계속합니다.
3. 대동맥 캐 뉼러 출구의 온도가 37 ° C가되도록 가온 시스템의 온도를 조절하십시오.
4. 배관 시스템에 거품이 없는지 확인하십시오.
5. KHB의 PO ₂ 가 500-600 mmHg (혈액 가스 분석기로 측정)에 도달 할 때까지 5 분 동안 carbogen으로 KHB를 산소 처리하십시오.

100 cmH ₂ O의 일정한 압력 또는 수동 스위칭을 사용하여 약 10-20 mL / 분의 일정한 유량에서 작동하도록 관류 시스템을 설정하십시오. 또는 교체 가능한 STH 펌프 컨트롤러를 사용하여 관류 모드로 즉시 전환하십시오.

3. 격리와 심장의 Cannulation

참고 : 몸무게가 30 인 남성 Wistar 쥐0-350 g을 사용하여 심장의 크기가 프리 캐스트 라텍스 캡과 일치하도록 하였다. 랫트는 좌 동맥 내분비술 (LAD)을 50 분 동안 시행 한 후 재관류하거나 가짜 수술을 시행 하였다. 심근 경색 (MI)의 유도에 대한 방법론의 세부 사항은 다른 곳에서보고되었다. 경색 동물에서의 역 심장 실험은 수술 후 5 일에 수행되었다.

1. 동물 보관실 (20L)에 연결된 이소 플루 란 증발기 (2 % V / V)를 사용하여 쥐를 마취.
2. 깊은 마취가 끝나면 수술 테이블 (온도 조절이 아닌)에 쥐를 옮기십시오.
3. 포셉을 사용하여 흉골 바로 아래의 피부와 근육을 들어 올리고 무거운 가위로 갈비뼈의 아래쪽 가장자리를 자릅니다.
4. 미세한 가위를 사용하여 늑골 가장자리에서 횡경막을 약간 자릅니다. 갈비뼈를 꼬리 전체적으로 복부 흉벽의 플랩을 만들기 위해 자릅니다.
5. 엄지 손가락으로 부드럽게 마음을 움켜 잡고손가락과 중간 손가락을 조심스럽게 올려 천천히 들어 올려서 심장 혈관이 약간 늘어지게하십시오.
6. 대동맥이 완전히 노출 될 때까지 심장을 절제하십시오.
7. 얼음처럼 차가운 KHB (4 ° C) 50 ML가 들어있는 100 ML 비커에 심장을 놓고 관류 장치로 이동하십시오.
8. 즉시 대동맥을 통해 심장을 물방울 캐 뉼러에 올려 놓고 봉합 (4-0)으로 단단히 조이십시오. 기포가 심장에 들어 가지 않도록하십시오.
9. 일정한 관류 압력 (100 cmH ₂ O)을가하십시오. 또는 전체 유속 (20 mL / min으로 시작)을 적용 할 수 있습니다.
   참고 : 흉부를 열 때부터 관류 캐뉼라에 심장을 연결하기까지의 시간은 숙련 된 조작원이 3 분 정도 걸립니다.

4. 역 모델

1. 심장의 뒤쪽 벽면이 엉덩이가 될 때까지 대동맥 캐뉼라를 부드럽게 돌리십시오.
2. 가위로 결합 조직을 제거하십시오.좌심방의 개방을 노출시켜 뇌실 내 삽관을위한 준비를합니다.
3. 단단한 카테터에 부착 된 수축 된 라텍스 풍선을 왼쪽 심방을 통해 좌심실에 삽입하십시오.
4. 전체 심실 구멍을 채울 때까지 풍선을 팽창시킵니다 (팽창 된 부피는 주사기에 미리 표시되어 있음).
5. 심장이 거꾸로 될 때까지 뒤집어서 심실 내 풍선 카테터로지지하십시오.
6. 그림 1C 에 나와 있듯이 견고한 금속 카테터가있는 심실 내 풍선을 사용하여 거꾸로 된 자세로 기계적으로 거꾸로 된 심장을 안정화시킵니다.
7. 대동맥 근의 과도한 비틀림을 피하기 위해 심장의 위치를 ​​조정하십시오.
8. 이완기 혈압을 3-5 mmHg로 조정하십시오 (심실 내 풍선으로 측정, 그림 1C 참조).
9. 심장의 심막 상피 표면을 관찰하고 작은 방울이 형성되도록하십시오.
10. 라텍스 캡을 넣으십시오.부드럽게 손가락을 사용하여 전체 심장을 덮어서 심장 표면에 붙입니다.
11. 라텍스 캡이 대부분의 심실 표면을 덮고 있는지 확인하십시오.
12. 부드럽게 1 mL 주사기로 흡입하여 캡과 튜빙 내부의 기포를 제거하십시오 (있는 경우).
13. CT 뽑는 튜빙의 원위 구멍을 심장의 수평 높이보다 10cm 아래로 조정하십시오.
    참고 :이 절차는 음수 정압에 의한 약간의 흡입을 보장합니다.
14. 얼음에 놓인 1.5 mL 수집 튜브에 CT 방울을 NaCl과 1 : 1로 혼합합니다. CT 0.15-1.5 mL를 모으십시오.
    참고 : 얼음 / 염화나트륨 혼합물은 수집 관의 온도를 영하 (약 -4 ° C) 이하로 안정화시킵니다.
    참고 : 샘플링 시간은 실험 목적에 따라 다릅니다. CT의 유속은 가짜 수술 동물 (n = 3)에서 약 27 ± 20 μL / min이고 관상 동맥 연결 동물 (n = 11)에서는 100 ± 47 μL / min이다.
15. CT 샘플의 무게를 재조정하고 고정시킵니다.액체 질소에 넣고 나중에 측정을 위해 -80 ° C에 보관하십시오.

5. CT의 분석

1. 과학적 질문에 따라 대사 산물 분석을 위해 CT 유체를 사용하십시오.
   참고 : 그림 2 및 그림 3에 표시된 데이터는 일정한 압력 관류 (100 cmH ₂ O)에서 수집되었으며 약 0.15-1.5 ML의 CT 유체가 10 분 이내에 수집되었습니다. 이 시간과 부피는 다양한 퓨린의 proteomic (최소 50 μL, 그림 2 ) ¹⁴ 및 HPLC (최소 20 μL, 그림 3 ) ¹⁵ 분석에 충분했습니다.

결과

반전 심장 모델은 격리 된 재관류 된 래트 심장 ( 그림 1A -C )에서 심장 간질 전달체의 수집을 가능하게합니다. 100 cmH ₂ O의 일정한 압력에서 관류 할 때, 간질 유체 형성 속도는 고립 된 심장에서 관상 동맥 정맥 유출 물의 0.1-1 %에 해당하는 17 ~ 147 μL / min 범위였다.

CT의 단백질 함...

토론

반전 심장 모델은 잘 확립 된 Langendorff 심장 관류 기술 ^12를 기반으로하며, 심장을 거꾸로 뒤집은 상태로 고정시키고 견고한 심실 내 풍선 카테터를 사용하여이 위치를 유지함으로써 수행됩니다. 이러한 방법으로 심장 간질 누출은 관상 정맥 유출 물 관류 액으로부터 물리적으로 분리되어 심장의 기저부로부터 중력에 의해 떨어질 수있다. CT는 전체 심장 표면에 놓인 얇고 유연한...

자료

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Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
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70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
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