Il modello invertito del cuore per la raccolta di transudati interstiziali dal cuore isolato del ratto

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco dal cuore isolato del ratto perfuso. Per separare fisicamente il transudato interstiziale dal perfusato effluente venoso coronarico, il cuore perfuso di Langendorff viene invertito e il liquido intradito (transversato) formato sulla superficie cardiaca viene raccolto usando un tappo morbido in lattice.

Abstract

Il presente protocollo descrive un approccio unico che consente la raccolta del transudato cardiaco (CT) dal cuore isolato del ratto perfuso-salino. Dopo l'isolamento e la perfusione retrograda del cuore secondo la tecnica Langendorff, il cuore viene invertito in posizione verticale e stabilizzato meccanicamente da un catetere a palloncino inserito nel ventricolo sinistro. Quindi, un cappuccio di lattice sottile - precedentemente gettato per abbinare la dimensione media del cuore del topo - è posto sopra la superficie epicardica. L'uscita del tappo in lattice è collegata al tubo di silicone, con l'apertura distale 10 cm sotto il livello base del cuore, creando una leggera aspirazione. Il CT prodotto continuamente sulla superficie epicardica è raccolto in flaconi raffreddati al ghiaccio per ulteriori analisi. Il tasso di formazione di CT variava da 17 a 147 μL / min (n = 14) nei cuori di controllo e infarto, che rappresenta lo 0,1-1% del perfusato venoso effusivo coronarico. Analisi proteomica e alto perfoLa cromatografia liquida rmance (HPLC) ha rivelato che la CT raccolta contiene un ampio spettro di proteine ​​e metaboliti purinergici.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca (HF) è la principale causa di morte negli esseri umani in tutto il mondo ¹ . L'HF si verifica spesso a causa della miocardite, insulti ischemici al miocardio e rimodellamento ventricolare sinistro, che porta al progressivo deterioramento della funzione contrattile cardiaca e alla qualità della vita dei pazienti. Sebbene i progressi nella cardiologia e nella chirurgia cardiaca abbiano notevolmente ridotto la mortalità della HF, essi servono semplicemente come "ritardatori" transitori di un processo di malattia inevitabilmente progressivo che ha una grave morbosità. Pertanto, l'attuale mancanza di trattamento efficace sottolinea la necessità di identificare nuovi bersagli molecolari che possono impedire o addirittura invertire l'HF. Ciò include cambiamenti nella matrice extracellulare, risposta immunitaria incontrollata cardiaca e interazioni tra cellule cardiache e non cardiache ² .

È importante riconoscere che il microambiente che le cellule cardiache sono esposte a direcForma la risposta immunitaria e rigenerativa del cuore infortunato. Nel cuore isolato, salato-perfuso, CT viene generato sulla superficie del cuore sotto forma di piccole gocce derivate dallo spazio fluido interstiziale ( cioè, microambiente), sia in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche ^{3 , 4 , 5} . Pertanto, l'analisi del CT ( cioè il fluido interstiziale) può aiutare a identificare fattori che regolano il metabolismo cardiaco e la funzione contrattile ⁶ o influenzano le funzioni delle cellule immunitarie dopo la migrazione nel cuore ferito. Potenzialmente, ciò può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento dell'HF.

La raccolta di CT da cuori murine è tecnicamente impegnativa. Nei corpi regolari di Langendorff, la collezione esclusiva di CT è difficile perché la miscela di CT con coronarL'effluente venoso effusivo diluisce imprevedibilmente qualsiasi concentrazione di metaboliti / enzimi liberati dallo spazio interstiziale. Una possibile strategia per superare questa limitazione è quella di escludere l'effluente venoso cannulando il polmone e contemporaneamente legando la vena polmonare ⁷ . Tuttavia, questo metodo affronta difficoltà associate alla cannulazione e alla legatura dell'arteria e della vena polmonare, causando perdite potenziali di effluenti venosi nel transudato cardiaco. Il concetto di utilizzo di un modello di cuore inverso è stato introdotto per la prima volta dal gruppo di Kammermeier, che ha invertito il cuore isolato e perfuso in una posizione capovolta e ha posto un cappuccio di lattice sottile sulla superficie epicardica per continuare a campionare CT senza la contaminazione dell'effetto venoso ^{8 , 9} . Utilizzando questa procedura, CT è stato dimostrato di fornire una misura molto sensibile dei metaboliti liberati dal cuore ⁹ ,Il trasferimento capillare di acidi grassi ⁸ e le particelle virali ¹⁰ .

Più recentemente, i fattori paracrini che possono regolare la risposta immunitaria locale e aumentare l'angiogenesi cardiaca ¹¹ sono stati implicati negli effetti benefici della terapia basata sulle cellule staminali per le malattie cardiache. L'analisi della CT nel cuore inverso può aiutare a identificare chimicamente questi fattori paracrini individuali. Inoltre, la CT può aiutare a identificare i fattori coinvolti nell'attivazione in vivo di cellule immunitarie nel cuore.

La descrizione dettagliata della raccolta CT dalla superficie del cuore, fornita qui, è sperimentalmente utile per i ricercatori che studiano l'interazione di cellule immunitarie, fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti in relazione alla funzione cardiaca globale. Come detto sopra, il fluido interstiziale trasporta le informazioni per la comunicazione cellulare da cellule nel cuore, whChe può essere convenientemente valutato dalla raccolta di CT. La descrizione tecnica dettagliata, incluso un protocollo video su come raccogliere CT dal cuore invertito, dovrebbe facilitare l'applicazione futura di questa tecnica unica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'agenzia locale di regolamentazione ( LANUV di Nordrhein-Westfalen, Germania) e sono state eseguite secondo le linee guida dell'uso animale. Gli animali sono stati nutriti con una dieta standard di chow e hanno ricevuto acqua di rubinetto ad libitum . Tutte le apparecchiature e le sostanze chimiche necessarie per ogni fase dell'esperimento sono disponibili nella Tabella dei Materiali .

1. Preparazione del tappo in lattice e del palloncino intraventricolare

1. Fai uno stampo in alluminio usando una fresatrice che corrisponda alla dimensione media del cuore del topo (peso corporeo di 300-350 g). Pellicola lo stampo con carta smerigliatrice superfine (10/0).
   NOTA: Le metriche dettagliate dello stampo sono mostrate in Figura 1A .
2. Fissare verticalmente il collo dello stampo in alluminio alla fresatrice per preparare il tappo in lattice.
   NOTA: La macchina di fresatura provoca la rotazione dello stampo lentamente. In alternativa, è possibile utilizzare un motore elettrico. li>
3. Versare 20 ml di lattice liquido (acquistato in commercio, vedere la tabella dei materiali ) in un bicchiere di vetro da 50 ml.
4. Abbassare lo stampo fino a quando l'intero corpo dello stampo è immerso nella soluzione del lattice.
5. Sollevare lentamente lo stampo (5 cm / min) mentre ruota.
6. Continuare a ruotare lo stampo per altri 15 minuti, finché il lattice sulla superficie dello stampo non si solidifica.
7. Aggiungere circa 1 g di polvere di talco alla superficie dello stampo (già coperto da una sottile pellicola di lattice) per evitare danni durante la staccatura.
8. Separare delicatamente con le dita il tappo in lattice già asciutto dalla superficie dello stampo; Il tappo di lattice è ora pronto per l'uso ( figura 1B ).
9. Collegare l'uscita del tappo in lattice a tubo di silicio da 15 cm (ID = 0,2 mm), utilizzata in seguito per la raccolta di CT.
10. Riempire il pallone ventricolare del lattice con acqua e fissarlo saldamente su una cannula metallica a forma di L collegata ad una siringa da 1 ml, ricoperta d'acqua (> Figura 1C).
    NOTA: questa verrà utilizzata per assicurare il posizionamento verticale del cuore (vedi sotto).
11. Assicurarsi che il palloncino sia ermetico eseguendo diverse prove di deflazione / gonfiaggio con la siringa attaccata da 1 ml.
12. Collegare la cannula, tramite una sosta a tre vie, a un trasduttore di pressione per la misurazione futura della pressione sviluppata intraventricolare ( Figura 1C ).

2. Preparazione del Krebs-Henseleit Buffer (KHB) e del Langendorff Perfusion System

1. Impostare un sistema di perfusione Langendorff utilizzando un flusso costante (guidato da una pompa a rulli) o una pressione costante (generata da una pressione statica in una colonna di vetro).
   NOTA: i dettagli del preparato cardiaco Langendorff sono stati descritti in precedenza ¹² .
2. Preparare 2 L di una KHB modificata (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgS04,7H2O, 1,21 K ₂ HPO ₄ 2 · 2H ₂ O, 24,88 NaHCO ₃ , 8,30 D-glucosio e 2,0 piruvato di sodio).
   1. Pesare tutte le sostanze chimiche ma CaCl ₂ e sciogliere in 1,8 L di acqua doppia-distillata in un pallone da 2 L.
   2. Bolle il mezzo con carbogeno (95% O ₂ /5% CO ₂ ) per almeno 5 min per equilibrare (pH: 7.4) sotto agitazione magnetica.
   3. Aggiungere 0,74 g di CaCl2.2H2O e portare il volume totale a 2 L con acqua doppia distillata.
   4. Continuare a mescolare e far bollire il mezzo con carbogeno per altri 5 minuti.
   5. Filtrare il KHB attraverso un filtro da 0,2 μm per eliminare piccole particelle che potrebbero ostacolare la microcircolazione del cuore.
3. Preparazione del sistema di perfusione Langendorff.
   1. Posizionare il KHB filtrato in un bagno d'acqua pre-riscaldato (38 ° C); Continuare a bolle con carbogen per generare una pressione di 100 cmH ₂ O insidE il serbatoio KHB.
   2. Collegare il serbatoio alla colonna di vetro per stabilire una pressione idrostatica da 100 cmH ₂ O per la perfusione Langendorff con KHB; Continuare a bolle il KHB all'interno della colonna con carbogen.
   3. Regolare la temperatura del sistema di riscaldamento in modo che la temperatura alla cannula aortica sia di 37 ° C.
   4. Assicurarsi che il sistema di tubazioni sia privo di bolle.
   5. Ossigenare KHB con carbogeno per altri 5 minuti, finché la PO ₂ nella KHB non raggiunge i 500-600 mmHg (misurata da un analizzatore di sangue-gas).
4. Impostare il sistema di perfusione per funzionare a una pressione costante di 100 cmH ₂ O o ad un flusso costante di circa 10-20 ml / min usando la commutazione manuale. In alternativa, utilizzare un regolatore di pompa STH intercambiabile per passare immediatamente alla modalità di perfusione.

3. Isolamento e cannulazione del cuore

NOTA: Ratti maschi Wistar con pesi corporei di 300-350 g sono stati utilizzati in modo che le dimensioni dei cuori abbinassero il tappo di lattice pre-cast. I ratti sono stati sottoposti a una legatura della discendenza arteriosa sinistra (LAD) per 50 min, seguita da reperfusione o sono stati operati con un tosatore. Dettagli della metodologia per l'induzione dell'infarto miocardico (MI) sono stati riportati altrove ¹³ . Gli esperimenti in cuore inverso negli animali infarto sono stati eseguiti 5 giorni dopo l'operazione.

1. Anestetizzare i ratti utilizzando un vaporizzatore isoflurano (2% V / V) collegato ad una camera di contenimento animale (20 L).
2. Trasferire i ratti ad una tabella di funzionamento (non a temperatura controllata) dopo che si raggiunge l'anestesia profonda.
3. Sollevare la pelle e il muscolo appena sotto lo sterno utilizzando le pinze e tagliare intorno al margine inferiore delle costole con forbici pesanti.
4. Usando forbici belle, fare un piccolo taglio nel diaframma, sul margine della nervatura. Tagliare le nervature caudalmente per fare una falda di tutta la parete ventrale della cassa.
5. Afferrare delicatamente il cuore con il pollice aIndice e dita medie e sollevarlo lentamente in modo che i vasi cardiaci diventino leggermente allungati.
6. Accendere il cuore fino a quando l'aorta è completamente esposta.
7. Collocare il cuore in un bicchiere da 100 ml contenente 50 ml di KHB ghiaccio freddo (4 ° C) e trasferirlo all'apparato di perfusione.
8. Immediatamente montare il cuore attraverso l'aorta su una cannula gocciolante e fissarlo saldamente con una sutura (4-0). Evitare le bolle d'aria che entrano nel cuore.
9. Applicare pressione costante di perfusione (100 cmH ₂ O). In alternativa, è possibile applicare una portata totale (a partire da 20 mL / min).
   Nota: il tempo dall'apertura del torace all'attacco del cuore alla cannula di perfusione dovrebbe durare circa 3 minuti nelle mani di un operatore esperto.

4. Modello inverso del cuore

1. Ruotare delicatamente la cannula aortica finché la parete posteriore del cuore non è visibile.
2. Rimuovere il tessuto connettivo con le forbiciPer esporre l'apertura dell'atrio sinistro, rendendola pronta per la cannulazione intraventricolare.
3. Inserire il palloncino deflato in lattice attaccato ad un catetere rigido attraverso l'atrio sinistro nel ventricolo sinistro.
4. Gonfiare il pallone fino a riempire l'intera cavità ventricolare (il volume di gonfiaggio è pre-contrassegnato sulla siringa).
5. Invertire il cuore fino a quando non è capovolto, sostenendolo dal catetere a palloncino intraventricolare.
6. Come dimostrato nella figura 1C , stabilizzare meccanicamente il cuore invertito in posizione verticale usando il pallone intraventricolare con un catetere metallico rigido.
7. Regolare la posizione del cuore per evitare una torsione eccessiva della radice aortica.
8. Regolare la pressione diastolica a 3-5 mmHg (misurata dal palloncino intra-ventricolare, vedere la Figura 1C ).
9. Osservare la superficie epicardica del cuore e assicurare che piccole gocce formino.
10. Posizionare il tappo in lattice oSulla superficie del cuore premendolo delicatamente per coprire l'intero cuore usando le dita.
11. Assicurarsi che il tappo in lattice copre la maggior parte della superficie ventricolare.
12. Rimuovere eventualmente le bolle d'aria, all'interno del tappo e del tubo, facendo pipistrare con una siringa da 1 ml.
13. Regolare l'apertura distale del tubo di rilascio CT a 10 cm sotto il livello orizzontale del cuore.
    NOTA: Questa procedura assicura una leggera suzione da pressione idrostatica negativa.
14. Raccogliere gocce di CT in un tubo di raccolta da 1,5 ml posto in ghiaccio mescolato 1: 1 con NaCl. Raccogliere circa 0,15-1,5 ml di CT.
    NOTA: La miscela di ghiaccio / NaCl stabilizza la temperatura nel tubo di raccolta sotto zero (circa -4 ° C).
    NOTA: Il tempo di campionamento dipende dallo scopo sperimentale. La velocità di flusso della CT è di circa 27 ± 20 μL / min negli animali trattati con tosse (n = 3) e 100 ± 47 μL / min per gli animali coronarici (n = 11).
15. Pesare e congelare i campioni CTIn azoto liquido e conservarli a -80 ° C per le misurazioni successive.

5. Analisi della CT

1. Utilizzare il fluido CT per l'analisi dei metaboliti, a seconda della domanda scientifica.
   NOTA: I dati mostrati in Figura 2 e Figura 3 sono stati raccolti da una perfusione a pressione costante (100 cmH ₂ O) e circa 0,15-1,5 ml di liquido CT è stato raccolto entro un periodo di 10 minuti. Questa volta e volume erano sufficienti per la proteomica (minima: 50 μL; Figura 2 ) ¹⁴ e HPLC (minimo: 20 μL; Figura 3 ) ¹⁵ analisi di vari purini.

Risultati

Il modello a forma di cuore inversa permette di raccogliere il transudato interstiziale cardiaco in un cuore ratto isolato e retro-perfuso ( Figura 1A- C ). Quando si perfusione ad una pressione costante di 100 cmH2O, la velocità di formazione di fluidi interstiziali variava tra 17 e 147 μL / min, pari allo 0,1-1% dell'effluente venoso coronarico nel cuore isolato.

Il ...

Discussione

Il modello di cuore invertito si basa sulla ben nota tecnica di perfusione del cuore Langendorff ¹² e viene eseguita semplicemente invertendo il cuore in una posizione capovolta e tenendo questa posizione utilizzando un rigido catetere a palloncino intra-ventricolare. In tal modo, il transudato interstiziale cardiaco può essere fisicamente separato dal perfusato effluente venoso coronarico, gocciolando per gravità dalla base del cuore ⁹ . La CT può essere raccolta in co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model