评估细菌素对小鼠肠道微生物的影响的方法

摘要

细菌素被认为在定义不同生态位的微生物多样性方面发挥关键作用。在这里，我们描述了一种有效的方法来评估细菌素如何影响动物模型中的肠道微生物群组成。

摘要

随着我们对肠道微生物群落组成的了解和与健康的关系，特别是有助于维持人口平衡的因素，我们提出了非常有趣的问题。然而，有限的可用方法来评估这些因素。细菌素是由许多细菌产生的抗微生物肽，可以赋予食物获取和/或利基建立的竞争优势。许多益生菌乳酸菌（LAB）菌株通过防止病原体的生长具有很大的潜力来促进人类和动物的健康。它们也可用于免疫调节，因为它们产生细菌素。然而，细菌素的拮抗活性通常通过实验室生物测定来确定，与细菌面对来自宿主和数百种微生物物种的多因素影响的人类和动物中的复杂肠道环境相比，在明确定义但过度简化的条件下讨论同样的利基。这项工作描述了一个完整和有效的评估效果的程序 在鼠系统中具有不同靶特异性的各种细菌素。使用组合16S rDNA测序监测细菌治疗期间微生物群组成的变化。我们的方法使用细菌素生产者和其同基因非细菌素产生突变体，后者具有区分细菌素相关的微生物群与非细菌素相关的修饰的能力。粪便DNA提取和16S rDNA测序方法是一致的，并且与生物信息学一起构成了在细菌谱中发现微弱变化并在细菌群体和健康标记之间建立胆固醇和甘油三酯浓度方面的相关性的强大程序。我们的协议是通用的，因此可用于研究其他化合物或营养物质，以改变主机麦克风在研究毒性或有益效果时，可以使用robiota组合。

引言

细菌素是由大范围的细菌物种^1,2的生产抗微生物肽。这些化合物和它们的生产者，尤其是LAB，已探索和几十年来他们在食品保鲜，医药³的潜在应用全球开发。已知有几种细菌素杀死重要的病原体，包括李斯特氏菌，肠球菌属，葡萄球菌属和芽孢杆菌属 。一些细菌素甚至具有调节免疫反应的能力⁴ 。许多细菌素具有相对较窄的光谱，这在一些应用中是非常受赞赏的。例如，可以使用一些窄谱细菌素来指导针对所选择的有问题细菌群体的特异性活性，而不会对分享相同利基的共生或有益菌群产生太大的干扰;这在肠道环境中尤其重要onment，其中有大量的有益微生物中的交互动态方式⁵茁壮成长。细菌素也可用于预防或益生菌使用非常有吸引力的，因为它们可以抑制病原体，pathobionts，或机会致病菌可能不平衡肠道稳态^6,7（下）的生长。

在其性质和物理化学性质方面，细菌素是非常多样化的，因为它们具有不同的结构，靶特异性，作用方式等。大多数细菌素已经在体外设置中进行了非常详细的研究 ，但很少已经在食品中进行了测试矩阵^8,9或在体内，如在动物肠道^6,10。由于复杂性o， 在体内评估时体外性质可能会有很大的不同肠道环境，以及对有益细菌的推测意外的影响。大多数益生菌是LAB。它们产生一系列其他代谢物，包括已知会影响宿主生理学的短链脂肪酸，以及显示针对某些细菌的抗微生物特性。因此，在产生细菌素的益生菌菌株的情况下，最好建立现实的检测方法，例如具有正常微生物群的健康动物。

在本研究中，我们提供了一种策略，可以评估不同细菌素生产菌株（其细菌素具有不同抑制谱）对健康小鼠的影响。我们的策略包括喂养具有同基因非细菌素突变体的小鼠，这使得能够将细菌素介导的作用从非细菌素介导的作用分化。测序16S rDNA允许跟踪肠道中细菌群体​​的动态变化。替补均衡统计分析破译细菌物种之间的相关性，以及细菌物种与测量的生理参数（ 例如体重，血清生化参数等 ）之间的相关性。我们认为本研究中提出的方案也适用于活体动物中细菌素研究以外的其他益生菌或益生元应用。

研究方案

护理和处理必须在专门的动物保健单位进行。此处描述的程序由巴伦西亚大学和地方当局相应的伦理委员会批准，遵循欧盟法律和2010/63 / EU强制实验动物护理的原则和西班牙政府关于动物保护的第53/2013号用于科学目的，以便在动物实验（替代，减量，细化）中遵守3R原则。

1.用于接种小鼠的冷冻细菌培养物

1. 在5 mL脑心脏输注（BHI）培养基中接种LAB的单个菌株，并在30℃下将其生长20-24小时（过夜）。
2. 通过将2mL过夜培养物转移到200mL BHI中，在BHI中每个细菌培养物稀释100倍。在30°C下生长20-24小时。
   注意:本研究中使用的菌株列于表1。
3. 收获ce在4℃下以5,000×g离心20分钟。
4. 通过将每个细胞沉淀悬浮在100mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中并除去上清液并洗涤细胞两次，并如步骤1.3一样收集细胞。
5. 第二次洗涤后，将每个细胞沉淀物悬浮于20mL冰冷的15％甘油的PBS溶液中。
6. 将细胞悬浮液等分至管中1 mL体积，然后将其储存在-80°C直至使用。
   注意:细胞应在1-2个月后使用。
7. 在储存之前和给药前确定细胞数量，以便知道给予小鼠的活细胞数。
   1. 对于细胞计数，在冰冷的0.9％氯化钠（NaCl）溶液中进行十倍连续稀释的细胞。将100μL每种稀释液扩散到BHI琼脂平板上。在30℃下孵育过夜（20-24小时）用于细胞生长和集落形成，后者确定集落形成单位（cfu）/ mL。
8. 为了使含细菌的饮用水，将每个细菌储存培养物的细胞稀释在100mL无菌，过滤的饮用水中，最终平均cfu为10 ⁹ / mL水。对于细菌生存评估，在细菌处理的前两周，在稀释后和24小时后每周一次计数活细胞。

小鼠分析和实验设计

注意:本实验需要特异性无病原体（SPF）BALB / c幼小雌性小鼠（6-8周）这里共购买了100只动物。

1. 在整个实验过程中，让老鼠免费进入沉淀的食物和水。
2. 设计实验并计算功率。
   1. 如果每个治疗都有自己的控制，应用配对病例对照设计（t检验）。使用初步测定来计算要确定的最重要影响的平均值和标准误差。
   2. 使用不同的方法和免费获得的程序优化测定的力量和每组所需的动物数量¹¹ 。
   3. 为了测试细菌素生产者与非生产菌株的影响，每个实验条件使用9只动物。
      注意:该数字是根据实验标准误差确定的，并提供令人满意的功率（0.7 - 1.0）和显着性水平低于0.05。
      注意:在给定的例子中，制作了11组小鼠，每笼1只。十个笼子对应于具有5个生物碱生产菌株和相应的5个同基因非产生菌株的处理;第11 ^个笼子有10只小鼠，构成未处理对照。
3. 小鼠到达牧场设施后，将其分发到笼子里，并对动物进行耳标，以便进行个人跟踪。将小鼠适应饲养设施和条件一周之前roceeding。
4. 如步骤1.8所述，制备含细菌的饮用水，并将饮用水瓶放置在相应的独立笼子中，这些笼子被清楚地识别，使得每个笼子中的小鼠共享同一个水瓶。
   注意:对照组必须保持在一个单独的笼子里，与被测细菌无接触。
5. 每天用新鲜饮用水（100 mL）准备一个新瓶，并加入新鲜除霜的细菌悬浮液。这样做连续15天。
6. 按照细菌处理两周的时间，在此期间，小鼠喝无菌水（ 图1 ）。

3.收集样品

1. 收集粪便样品。
   1. 准备高压灭菌的笼子（空的）和无菌镊子，并为每只小鼠标记无菌的1.5-mL管。
   2. 在一天的同一时间收集样品，以避免在此期间微生物群组成的变化一天一天为获得最佳效果，请分别收集新鲜样品。
      注意:优选地，早晨收集粪便，当小鼠倾向于自发排便时。
   3. 用70％酒精清洁一个空的笼子，然后放入一只老鼠。使其排便，并使用无菌镊子收集2-4粪便颗粒，将其放入1.5 mL管中。
      注意:有时只能将鼠标向上按住;然后可以将粪便从肛门直接收集到管中。
   4. 在四周的实验中，每周一次收集每只小鼠的粪便样品（ 图1 ）。在小鼠接触细菌之前，先收集第一个样品（T0，时间零）。在第7,14,21和28天收集以下粪便样品。
   5. 将样品在4℃冷藏，直到其运送到实验室，在-80℃冷冻。提前计划提供足够的储物箱，作为大量的fe在实验过程中将收集cal样品。
2. 每周在粪便收集日称重所有老鼠。
3. 在^第 15天，细菌给药的最后一天从所有小鼠收集血液样品，并测定其中甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的水平血清。
   注意:经验丰富的人员应收集血液以减轻动物的压力。

LAB计数和细菌素活性

1. 称量每个样品的一个粪便颗粒在1.5 mL管中，并加入足够体积的冰冷的0.9％NaCl以达到10％（w / v）溶液。使用无菌微塞子1.5 mL管，使粪便悬浮液均质化，并在冰冷的0.9％NaCl中制备十倍连续稀释液。
2. 计算LAB细胞的总数。
   1. 将稀释的细胞（100μL）转移到4mL预热的Ma中n Rogosa Sharpe（MRS）软琼脂（50℃，0.8％琼脂）。在将细胞倒入固体MRS琼脂平板（1.5％琼脂）之前通过涡旋混合。
   2. 通过在无菌罩中取盖5 - 10分钟干燥板，30℃孵育细胞20-24小时，用于细胞生长和集落形成。
3. 计数细菌素生产细胞。
   1. 将细菌素生产者的稀释细胞（100μL）转移到4mL预热的MRS软琼脂（50℃，0.8％琼脂）中，通过涡旋混合，并将细胞倒入MRS琼脂平板（1.5％琼脂）上;该层被称为第一层。
   2. 将另外4 mL无细胞的MRS软琼脂（0.8％琼脂）转移到第一层上，将所有细胞嵌入软琼脂中。
      注意:此层旨在防止细胞在琼脂平板表面上作为菌落生长。在顶部注入指示剂细胞时，表面生长的细胞容易移位（步骤4.3.4）和因此会使结果的解释复杂化。该层被称为第二层。
   3. 在无菌罩中盖上盖子5-10分钟，然后在30℃下孵育20-24小时以进行细胞生长和集落形成，干燥板。
   4. 为了鉴定产生细菌素的菌落，将40μL适当的指示菌株的过夜培养物混合，如表1所示，与4mL预热的软琼脂。将混合物倒入板上;该层被称为第三层。
   5. 在无菌罩中盖上盖子5-10分钟，然后在30℃下孵育20-24小时以进行细胞生长和集落形成，干燥板。
      注意:细菌素生产菌落在菌落周围有明显的（抑制）区域（ 图2 ）。

5. DNA提取，16S rDNA扩增和测序

注意:步骤f或DNA提取描述为使用商业试剂盒（ 例如， Realpure"SSS"试剂盒）。

1. 在300μL裂解液中悬浮1〜2只粪便小鼠（〜200mg）。
2. 将样品转移到其中预先放置约0.5g玻璃珠（直径:0.1mm）的2mL微量管中。
3. 向每个样品加入1μL10 U /μL的溶菌酶和2μL20 mg / mL的溶菌酶，37℃孵育40 - 60 min。继续从粪便样品中提取DNA的标准方案之一¹² 。
4. 应用两个循环的搅拌步骤，每次1分钟。
5. 加入2μL蛋白酶K并充分混合。
6. 孵育20分钟，每5分钟涡旋。
7. 将样品冷却至37℃，加入1μL5μg/ mL RNA酶A至样品。彻底混合
8. 在37℃下孵育30-60分钟。
9. 将样品冷却至室温，加入180μL的蛋白质沉淀溶液。以最大速度剧烈旋涡20-30秒。
10. 以16,000 xg离心5分钟。如果上清液中有任何颗粒漂浮，将样品在冰中孵育5分钟，然后再次离心。
11. 将含有DNA的上清液转移到含有300μL异丙醇的新型1.5 mL微量管中。
12. 通过倒置管20-30次混合，并在-20℃下孵育1小时。或者，将管子孵育一段时间（ 例如，过夜）。
13. 以16,000 xg离心2分钟。
14. 取出上清液，并将吸收纸上的管干燥。加入300μL70％乙醇洗涤DNA沉淀。
15. 以16,000 xg离心1分钟，除去上清液，使颗粒干燥约15分钟。
16. 一旦颗粒干燥，加入100μL无菌水或Tris（10 mM）/ EDTA（1 mM）缓冲液，并重新悬浮沉淀。
17. 消除任何可能的抑制化合物在随后的步骤中，清洗DNA。将提取的DNA与2体积（200μL）的缓冲液NTI混合以调节步骤5.15的结合条件。
18. 将含有PCR清洗柱的二氧化硅膜放入收集管（2mL）中并加载样品。
19. 以11,000 x g离心30秒。丢弃流通。
20. 用700μL缓冲液NT3洗涤二氧化硅膜，重复步骤5.16。
21. 通过以11,000 xg离心1分钟干燥二氧化硅膜，以除去任何残留的含乙醇洗涤缓冲液NT3。
22. 将柱转移到新的1.5-mL微管，并在70℃下孵育2-5分钟以完全除去乙醇。
23. 加入30μL的PCR级水，并在70℃下孵育5分钟。通过在11,000×g离心1分钟洗脱。
24. 使用UV / Vis分光光度计或荧光测定方法对DNA进行定量。
25. 正常化并汇集来自ea共享同一笼的小鼠的DNA样品 ch时间点。
26. 在时间上观察个体差异，在第0,14和28天，来自对照的3只随机选择的小鼠和两只其他随机笼中的序列DNA样品。

16S rRNA基因扩增和测序

1. 准备扩增的16S rRNA基因库。使用具有适当突出适配器的正向和反向引物扩增细菌16S rRNA基因⁵的V3-V4区域:
   5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'
   5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'
2. 使用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增的条带。
3. 使用磁珠清洗聚合酶链反应（PCR）产物用于扩增子纯化。
4. 按照制造商的说明，按照使用的大规模测序平台进行以下步骤> 6。

数据分析与统计

1. 质量过滤（通常在排序设施中进行）。
   1. 使用设备提供的软件过滤原始读取数据和解复用。
   2. 使用USEARCH ¹⁴ （版本7.0.1090）中实现的UPARSE管道¹³处理配对端读取。合并配对末端，并使用最大预期误差（maxee）值1.0进行质量过滤。舍弃小于150 nt的序列。重排序列丢弃单身人士。
   3. 将序列分成具有97％序列同一性的操作分类单位（OTU），并使用UCHIME ¹⁵过滤嵌合序列。
2. OTU采摘，分类学分配和系统发育重建，以及多样性分析和可视化。
   1. 使用Quantitative Insights Int进行OTU处理o微生物生态学（QIIME） ¹⁶ 。
   2. 使用最小同一性为75％（默认值）的PyNAST ¹⁸ ，使用Greengenes核心集数据库¹⁷选择并对齐代表性的OTU。
   3. 使用信度为0.8的核糖体数据库项目（RDP）分类器程序¹⁹将分类法​​分配给对齐的序列。
   4. 将OTU表规范化为具有最低序列深度的样本的序列计数。
   5. 在过滤步骤之后使用Fast Tree ²⁰从对齐序列构建系统发生树，以便去除高度可变的区域和全部空白位置。使用该树来计算alpha和β多样性，并计算稀疏曲线和香农指数。
   6. 要生成和可视化未加权的UniFrac距离度量²¹ ，请使用主要坐标分析（PCoA）。
      注意:对于s可以使用不同的软件包，如R ²²或QIIME ^16中实现的统计工具。
   7. 为了比较不同处理之间香农多样性指数，使用ANCOVA，考虑时间作为R中的连续因变量。
   8. 使用双侧学生t检验比较QIIME中PCoA的治疗距离，并使用Bonferroni校正计算1000个蒙特卡罗置换的非参数p值。
   9. 使用Pearson相关分析，分析特定OTU的相对丰度与其他测量参数（如血清胆固醇水平，HDL，LDL 等）之间的相关性。为此，使用CoNet ²³随后使用Cytoscape 3.1.1 ²⁴相关网络可视化。

结果

细菌素的生产被认为是LAB中的益生菌特征，因为它被认为是防止机会性细菌和病原体的生长。这项工作的目的是显示细菌素在小鼠模型中调节肠道微生物群体的能力。为此，开发了一种程序来比较细菌素生产菌株及其同基因非产生菌株的摄入效果。接种的方法和测定的时间延长如图1所示。将小鼠分为十一个笼子:没有任何治疗的对照，用细菌素生产?...

讨论

这里描述的程序已被用于确定微生物群体的变化是否与健康或年龄有关。方案的不同部分很重要，其中抽样粪便，选择要测序和分析的DNA片段，进行DNA提取和生物信息学分析肯定是最关键的。取样至关重要，因为道德上的原因，小鼠不应该受到压力，因为知道改变肠道细菌的比例。样品必须尽快加工或应冷冻使用，因为一些细菌对脱水和/或氧气非常敏感。从扩增的16S rRNA基因中选择要测序的DNA片?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice (female)	Harlan		Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
Brain-Heart-Infusion broth	Conda	1400.00
European Bacteriological Agar	Pronadisa	1800.00
Agarose D1 Low EEO	Pronadisa	8010.00
1x TAE buffer	Thermo Scientific	15558042
MRS broth	Difco	288130
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
scale	Mettler Toledo	PB602-S
sterile forceps	Levantina de Laboratorios S.L.	260-3710014
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Hermle	Z383K
sodium chloride	AppliChem Panreac	121659.1211
Realpure SSS Kit	Real Life Science Solutions, Durviz, Spain	RBME04 (300 ml)
Isopropanol	AppliChem Panreac	131090.1611
Ethanol	AppliChem Panreac	131086.1214
Qubit fluorometer	Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
AMPure XP beads	Beckman Coulter Genomics, USA	A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit	Quanta BioSciences, Maryland, USA	733-2300
MiSeq v3 reagent kit	Illumina, San Diego, California, USA	MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification			Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit		FC-131-1002	Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.	Sigma	Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter	Biospec Products	11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609.25
Omni Bead Ruptor 24	Omni International Inc.	19-040
mutanolysin	Sigma	M9901-10KU
lysozyme	Roche	10837059001
proteinase K	Roche	3115887001
RNase A	Sigma	R4875