Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de ratos

Resumo

Acredita-se que as bacteriocinas desempenham um papel fundamental na definição da diversidade microbiana em diferentes nichos ecológicos. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para avaliar como as bacteriocinas afetam a composição da microbiota intestinal em um modelo animal.

Resumo

Perguntas muito intrigantes surgem com nosso conhecimento avançado sobre a composição da microbiota intestinal e a relação com a saúde, particularmente em relação aos fatores que contribuem para manter o equilíbrio populacional. No entanto, existem metodologias disponíveis limitadas para avaliar esses fatores. As bactérias são peptídeos antimicrobianos produzidos por muitas bactérias que podem conferir uma vantagem competitiva para aquisição de alimentos e / ou estabelecimento de nicho. Muitas bactérias de ácido láctico probiótico (LAB) têm um grande potencial para promover a saúde humana e animal, evitando o crescimento de agentes patogênicos. Eles também podem ser usados ​​para imuno-modulação, pois produzem bacteriocinas. No entanto, a atividade antagonista das bacteriocinas é normalmente determinada por bioensaios laboratoriais em condições bem definidas, mas simplificadas em excesso, em comparação com o ambiente intestinal complexo em seres humanos e animais, onde bactérias enfrentam influências multifatoriais do hospedeiro e centenas de espécies microbianas sHaring o mesmo nicho. Este trabalho descreve um procedimento completo e eficiente para avaliar o efeito De uma variedade de bacteriocinas com diferentes especificidades alvo em um sistema murino. As alterações na composição de microbiota durante o tratamento com bacteriocina são monitoradas usando seqüência de rADN 16S composicional. Nossa abordagem usa os produtores de bacteriocina e os seus mutantes isogênicos que não produzem bacteriocinas, sendo este o último capaz de distinguir as modificações relacionadas à bacteriocina de modificações não relacionadas à bacteriocina nas microbiota. A extração de DNA fecal e os métodos de seqüência de rADN 16S são consistentes e, juntamente com a bioinformática, constituem um procedimento poderoso para encontrar mudanças fracas nos perfis bacterianos e estabelecer correlações, em termos de concentração de colesterol e triglicerídeos, entre populações bacterianas e marcadores de saúde. Nosso protocolo é genérico e, portanto, pode ser usado para estudar outros compostos ou nutrientes com o potencial de alterar o microfone hospedeiroComposição de robiota, seja ao estudar toxicidade ou efeitos benéficos.

Introdução

As bactérias são péptidos antimicrobianos produzidos por uma ampla gama de espécies bacterianas ^{1 , 2} . Esses compostos e seus produtores, especialmente LAB, foram explorados e explorados em todo o mundo há décadas por suas aplicações potenciais na preservação e medicina ³ . Várias bacteriocinas são conhecidas por matar agentes patogênicos importantes, incluindo espécies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus e Bacillus . Algumas bacteriocinas até têm a capacidade de modular a resposta imune ⁴ . Muitas bacteriocinas têm espectros relativamente estreitos, uma propriedade que é muito apreciada em algumas aplicações. Por exemplo, algumas bacteriocinas de espectro estreito podem ser usadas para dirigir a atividade específica contra grupos selecionados de bactérias problemáticas, sem muita perturbação na flora comensal ou benéfica compartilhando o mesmo nicho; Isto é especialmente essencial no ambiente intestinalOnde muitos micróbios benéficos prosperam de forma interativa e dinâmica ⁵ . As bactérias são também muito atraentes para o uso profilático ou probiótico, pois podem suprimir o crescimento (out) de patógenos, pathobiontes ou bactérias oportunistas que podem desbalancear a homeostase intestinal ^{6 , 7} .

Em termos de sua natureza e propriedades fisicoquímicas, as bacteriocinas são muito diversas, pois possuem estruturas diferentes, especificidades alvo, modos de ação, etc. A maioria das bacteriocinas foram estudadas com grande detalhe em configurações in vitro , mas muito poucos foram testados em alimentos Matrizes ^{8 , 9} ou in vivo, tal como num intestino de animal ^{6 , 10} . As propriedades in vitro podem diferir em grande medida quando avaliadas in vivo devido à complexidade oF o ambiente intestinal e também aos efeitos putativos não intencionais sobre bactérias benéficas. A maioria dos probióticos são LAB. Eles produzem uma série de outros metabólitos, incluindo ácidos graxos de cadeia curta, que são conhecidos por influenciar a fisiologia do hospedeiro, bem como para demonstrar propriedades antimicrobianas em relação a certas bactérias. Portanto, no caso de cepas probióticas que produzem bacteriocinas, é melhor estabelecer ensaios realistas, como animais saudáveis ​​com microbiota normal.

No presente estudo, fornecemos uma estratégia que permite a avaliação do efeito de diferentes cepas produtoras de bacteriocina, cujas bacteriocinas possuem diferentes espectros inibitórios, em camundongos saudáveis. Nossa estratégia inclui a alimentação de camundongos com mutantes isogênicos não bacteriocinais, o que permite a diferenciação dos efeitos mediados pela bacteriocina dos efeitos não-bacteriocinados. Sequencing 16S rDNA permite seguir as mudanças dinâmicas da população bacteriana no intestino. SubsA análise estatística equitativa decide as correlações entre espécies bacterianas e também entre espécies bacterianas e parâmetros fisiológicos medidos ( por exemplo, peso corporal, parâmetros bioquímicos séricos, etc. ). Acreditamos que o protocolo apresentado neste estudo também é aplicável a outras aplicações probióticas ou prebióticas além do estudo de bacteriocinas em animais vivos.

Protocolo

O cuidado e o manuseio devem ser realizados em uma unidade especializada de cuidados com animais. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo correspondente Comitê de Ética da Universidade de Valência e autoridades locais, seguindo os princípios de cuidados de animais de laboratório obrigatórios pelo Direito da União Européia e 2010/63 / UE e pelo Governo espanhol RD 53/2013 sobre proteção de animais Usado para fins científicos, a fim de respeitar o princípio 3R na experimentação animal (Replacement, Reduction, Refinement).

1. Culturas bacterianas congeladas usadas para inocular camundongos

1. Inocule cepas individuais de LAB em 5 mL de meio de infusão de cérebro-coração (BHI) e cresça-as durante 20 a 24 h (durante a noite) a 30 ° C.
2. Diluir cada cultura bacteriana durante a noite 100 vezes em BHI, transferindo 2 mL de cultura durante a noite para 200 mL de BHI. Cresça-os a 30 ° C por 20 a 24 h.
   NOTA: As cepas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1.
3. ColheitaPor centrifugação a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
4. Remova o sobrenadante e lave as células duas vezes por suspensão de cada sedimento celular em 100 mL de solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e coletando as células como no passo 1.3.
5. Após a segunda lavagem, suspender cada pastilha celular em 20 mL de glicerol 15% gelado em PBS.
6. Alíquota a suspensão celular em volumes de 1 mL em tubos e depois guarde-os a -80 ° C até o uso.
   NOTA: As células devem ser usadas dentro de 1-2 meses após esse ponto.
7. Determine o número da célula antes do armazenamento e antes da administração para que o número de células vivas fornecidas aos ratos seja conhecido.
   1. Para a contagem de células, faça diluições em série de dez vezes em células em solução de cloreto de sódio a 0,9% gelada (NaCl) gelada. Espalhe 100 μL de cada diluição sobre uma placa de ágar BHI. Incubar durante a noite (20 - 24 h) a 30 ° C para crescimento celular e formação de colônias, o último para determinar as unidades formadoras de colônias (cfu) / mL.
8. Para produzir água potável contendo bactérias, dilua células de cada cultura de estoque bacteriana em 100 mL de água potável esterilizada e filtrada, com uma UFC média final de 10 ⁹ / mL de água. Para a avaliação da sobrevivência bacteriana, conte as células vivas logo após a diluição e após 24 h uma vez por semana durante as duas primeiras semanas de tratamento de bactérias.

2. Ensaio de ratos e design experimental

Nota: São necessários ratos fêmeas jovens BALB / c livres de patógenos (SPF) (6 a 8 semanas) para esta experiência; Aqui, foram comprados 100 animais.

1. Forneça aos camundongos o acesso gratuito a alimentos e água com sedimentação durante todo o experimento.
2. Desenhe o experimento e calcule o poder.
   1. Se cada tratamento tiver o seu próprio controle, aplique um design de caso-controle emparelhado (teste t). Use um ensaio preliminar para calcular o erro médio e padrão do (s) efeito (s) mais importante (s) a ser determinado.
   2. Otimize o poder do ensaio e o número de animais necessários por grupo usando diferentes métodos e programas livremente disponíveis ¹¹ .
   3. Para testar os efeitos do produtor de bacteriocina versus cepas não produtoras, use 9 animais por condição experimental.
      NOTA: Este número foi determinado com base no erro padrão experimental e forneceu um poder satisfatório (0.7 - 1.0) e um nível de significância abaixo de 0.05.
      NOTA: No exemplo dado, foram feitos 11 grupos de ratos, um por gaiola. Dez gaiolas correspondiam aos tratamentos com 5 cepas produtoras de bateriocinas e as correspondentes 5 cepas isogênicas não produtoras; A 11 ^ª gaiola tinha 10 ratos e constituía o controle não tratado.
3. Após a chegada dos camundongos às instalações de criação, distribuí-los em gaiolas e rotular os animais para permitir rastreamento individual. Aclimatar os camundongos às instalações e condições de criação durante uma semana antes de pSeguindo.
4. Prepare a água potável contendo bactérias, conforme descrito no passo 1.8, e coloque garrafas de água potável nas gaiolas independentes correspondentes que são claramente identificadas para que os ratos em cada gaiola compartilhem a mesma garrafa de água.
   NOTA: O grupo de controle deve ser mantido em uma gaiola separada, sem contato com as bactérias testadas.
5. Prepare uma nova garrafa com água potável fresca (100 mL) todos os dias e adicione suspensões bacterianas recém-descongeladas. Faça isso por 15 dias consecutivos.
6. Siga o tratamento com bactérias com um período de duas semanas, durante o qual os ratos bebem água sem bactérias ( Figura 1 ).

3. Coletando Amostras

1. Coletar amostras fecais.
   1. Prepare as gaiolas autoclavadas (vazias) e fórceps estéreis e rotulhe os tubos esterilizados de 1,5 mL para cada mouse.
   2. Coletar amostras na mesma hora do dia para evitar variações na composição de microbiota durante o períodoÉ um curso de um dia. Para resultados ótimos, colete amostras frescas separadamente.
      NOTA: De preferência, colete fezes no início da manhã, quando os camundongos tendem a defecar espontaneamente.
   3. Limpe uma gaiola vazia com 70% de álcool e coloque o mouse dentro. Permitir que ele defece, e coletar 2 - 4 pastilhas fecais usando fórceps estéril, colocando-os em tubos de 1,5 mL.
      NOTA: Às vezes é suficiente manter a cauda do mouse para cima; As fezes podem então ser coletadas diretamente do ânus em um tubo.
   4. Colecione amostras fecais de cada mouse uma vez por semana durante o experimento de quatro semanas ( Figura 1 ). Colecione as primeiras amostras no primeiro dia (T0, tempo zero), imediatamente antes da exposição dos ratos às bactérias. Colecione as seguintes amostras fecais nos dias 7, 14, 21 e 28.
   5. Refrigerar as amostras a 4 ° C até o seu transporte para o laboratório, onde são congeladas a -80 ° C. Planeje com antecedência e forneça caixas de armazenamento suficientes, como um grande número de feAs amostras de calor serão coletadas durante o experimento.
2. Pesar todos os ratos toda semana no dia da coleta fecal.
3. Recolha de amostras de sangue a partir da veia facial de todos os ratinhos no dia 15 ^° dia, o último dia da administração de bactérias, e determinar os níveis de triglicéridos, colesterol total, de lipoproteínas de alta densidade (HDL), e a lipoproteína de baixa densidade (LDL) no soro sanguíneo.
   NOTA: pessoal experiente deve coletar o sangue para reduzir o estresse nos animais.

4. Atividade de contagem de LAB e Bacteriocin

1. Pesar um grânulo fecal de cada amostra em um tubo de 1,5 mL e adicionar um volume adequado de 0,9% de NaCl gelado para se obter uma solução a 10% (p / v). Use micropestéis estéreis para tubos de 1,5 mL para homogeneizar a suspensão fecal e preparar diluições em série de dez vezes em NaCl 0,9% gelada.
2. Contar o número total de células LAB.
   1. Transferir células diluídas (100 μL) para 4 mL de Ma pré-aquecidaN Rogosa Sharpe (MRS) agar macio (50 ° C, 0,8% de ágar). Misture por vortex antes de despejar as células sobre uma placa de agar MRS sólido (1,5% agar).
   2. Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar as células durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
3. Contagem de células produtoras de bacteriocina.
   1. Transferir as células diluídas (100 μL) do produtor de bacteriocina para 4 mL de agar MRS pré-aquecido (50 ° C, 0,8% de agar), misturar por vortex e despejar as células sobre uma placa de agar MRS (1.5% agar); Esta camada é referida como a primeira camada.
   2. Transferir mais 4 mL de agar MRS livre de células (agar 0,8%) na primeira camada para incorporar todas as células dentro do agar macio.
      NOTA: Esta camada destina-se a evitar que as células cresçam como colônias na superfície das placas de ágar. As células que crescem na superfície são facilmente deslocadas ao despejar células indicadoras na parte superior (passo 4.3.4) ePor conseguinte, complicará a interpretação dos resultados. Esta camada é referida como a segunda camada.
   3. Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
   4. Para identificar colônias produtoras de bacteriocina, misture 40 μL de uma cultura durante a noite de uma estirpe indicadora apropriada, como mostrado na Tabela 1 , com 4 mL de agar macio pré-aquecido. Despeje a mistura no prato; Esta camada é referida como a terceira camada.
   5. Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
      NOTA: As colônias produtoras de bactérias têm zonas claras (inibição) em torno das colônias ( Figura 2 ).

5. Extração de DNA, Amplificação de RDNA 16S e Seqüenciamento

NOTA: Passos fOu extração de DNA são descritos para o uso de um kit comercial ( por exemplo, kit Realpure "SSS").

1. Suspender 1 a 2 pellets de camundongos fecais (~ 200 mg) em 300 μL de solução de lise.
2. Transfira a amostra para um microtubulo de 2 mL, no qual cerca de 0,5 g de pérolas de vidro (diâmetro: 0,1 mm) foram previamente colocadas.
3. Adicionar 1 μL de mutanolisina a 10 U / μL e 2 μL de lisozima a 20 mg / mL a cada amostra e incubar a 37 ° C durante 40 a 60 min. Proceda com um dos protocolos padrão para extração de DNA de amostras fecais ¹² .
4. Aplique dois ciclos de passos do bead-beater, 1 min cada.
5. Adicione 2 μL de proteinase K e misture bem.
6. Incubar durante 20 min e vortex a cada 5 min.
7. Arrefecer as amostras a 37 ° C e adicionar 1 μL de RNase A 5 μg / mL à amostra. Homogeneizar.
8. Incubar a 37 ° C durante 30 a 60 min.
9. Arrefecer as amostras para a temperatura ambiente e adicionar 180 μLDe solução de precipitação protéica. Vortex vigorosamente à velocidade máxima de 20 a 30 s.
10. Centrifugar a 16.000 xg por 5 min. Se houver partículas que flutuam no sobrenadante, incubar as amostras em gelo durante 5 min e depois centrifugar novamente.
11. Transfira o sobrenadante contendo o DNA para um novo microtubo de 1,5 mL contendo 300 μL de isopropanol.
12. Misture invando os tubos 20-30 vezes e incube durante 1 h a -20 ° C. Alternativamente, incubar os tubos por mais tempo ( por exemplo, durante a noite).
13. Centrifugar a 16,000 xg por 2 min.
14. Remova o sobrenadante e retire o tubo no papel absorvente. Adicione 300 μL de etanol a 70% para lavar o sedimento de DNA.
15. Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min, remover o sobrenadante e deixar o sedimento secar por cerca de 15 min.
16. Uma vez que o sedimento está seco, adicione 100 μL de água estéril ou tampão Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) e ressuspenda o sedimento.
17. Para eliminar qualquer possível inibidorCompostos durante as etapas subseqüentes, limpe o DNA. Misture o DNA extraído com 2 volumes (200 μL) de NTI tampão para ajustar as condições de ligação para o passo 5.15.
18. Coloque uma membrana de sílica contendo coluna de limpeza de PCR em um tubo de coleta (2 mL) e carregue a amostra.
19. Centrifugação por 30 s a 11,000 x g. Descarte o fluxo contínuo.
20. Lave a membrana de sílica com 700 μL de tampão NT3 e repita o passo 5.16.
21. Secar a membrana de sílica por centrifugação durante 1 min a 11 000 xg para remover qualquer tampão de lavagem contendo NT3 residual contendo etanol residual.
22. Transfira a coluna para um novo microtube de 1,5 mL e incuba durante 2 a 5 min a 70 ° C para a remoção total do etanol.
23. Adicione 30 μL de água de grau PCR e incube durante 5 min a 70 ° C. Eluir por centrifugação durante 1 min a 11 000 x g.
24. Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro UV / Vis ou um método fluorométrico.
25. Normalize e junte as amostras de DNA de ratos que compartilham a mesma gaiola em Ponto de tempo ch.
26. Para observar as variações individuais durante o tempo, as amostras de DNA da sequência de três ratos selecionados aleatoriamente do controle e duas outras gaiolas aleatórias nos dias 0, 14 e 28.

6. 16S rRNA Gene Amplification and Sequencing

1. Prepare uma biblioteca de genes 16S rRNA amplificados. Amplifique a região V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA ⁵ usando primers direto e reverso com adaptadores de sobreposição apropriados:
   5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
   5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 '
2. Verifique as bandas amplificadas usando eletroforese com 1% de gel de agarose.
3. Limpe os produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) usando grânulos magnéticos para purificação do amplicão.
4. Proceda com as seguintes etapas, conforme indicado pelo fabricante, de acordo com a plataforma de seqüenciamento maciça usada> 6.

7. Análise e Estatística de Dados

1. Filtragem de qualidade (geralmente realizada em instalações de seqüenciamento).
   1. Filtre os dados de leitura em bruto e de-multiplex usando o software fornecido com o equipamento.
   2. Processe as leituras de par-fim usando o pipeline UPARSE ¹³ implementado no USEARCH ¹⁴ (versão 7.0.1090). Junte as extremidades emparelhadas e aplique filtragem de qualidade usando o valor máximo de erro esperado (maxee) de 1.0. Eliminar sequências inferiores a 150 nt. Seqüências desreplicadas para descartar singletons.
   3. Cluster as sequências em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em uma identidade de seqüência de 97% e use UCHIME ¹⁵ para filtrar sequências quiméricas.
2. Seleção de OTU, atribuição taxonômica e reconstrução filogenética, e análises e visualizações de diversidade.
   1. Processo das OTUs usando Quantitative Insights IntO Ecologia microbiana (QIIME) ¹⁶ .
   2. Escolha e alinhe as OTUs representativas contra o banco ^de dados do conjunto de núcleos Greengenes ¹⁷ usando PyNAST ¹⁸ com uma identidade mínima de 75% (padrão).
   3. Atribua taxonomia às sequências alinhadas usando o programa classificador do Projeto de Banco de Dados Ribossomal (RDP) ¹⁹ com uma confiança de 0,8.
   4. Normalize a tabela OTU para a contagem de seqüência da amostra com a menor profundidade de seqüência.
   5. Crie uma árvore filogênica a partir de seqüências alinhadas usando Fast Tree ²⁰ após o passo de filtração para remover regiões e posições altamente variáveis ​​que sejam todas as lacunas. Use esta árvore para calcular as diversidades alfa e beta e para calcular curvas de rarefação e índices de Shannon.
   6. Para gerar e visualizar métricas de distância UniFrac não ponderadas ²¹ , use a análise de coordenadas principal (PCoA).
      NOTA: para sAnálise tatistical, diferentes pacotes de software podem ser usados, como o R ²² ou as ferramentas estatísticas implementadas dentro do QIIME ¹⁶ .
   7. Para a comparação dos índices de Shannon de diversidade entre os diferentes tratamentos, use um ANCOVA, considerando o tempo como variável dependente contínua em R.
   8. Compare as distâncias entre os tratamentos no PCoA no QIIME usando um teste t de Student de dois lados e calcule os valores p não paramétricos com 1.000 permutações de Monte Carlo usando a correção de Bonferroni.
   9. Analise as correlações entre a abundância relativa de OTUs específicas e outros parâmetros medidos, como níveis séricos de colesterol, HDL, LDL, etc. , utilizando a análise de correlação de Pearson. Para este fim, use o CoNet ²³ com a subsequente visualização de redes de correlação usando o Cytoscape 3.1.1 ²⁴ .

Resultados

A produção de bacteriocinas foi considerada uma característica probiótica positiva no LAB, já que se supunha que ele evita o crescimento de bactérias oportunistas e patógenos. O objetivo deste trabalho foi mostrar a capacidade das bacteriocinas para modular as populações de microbiota intestinal em um modelo de mouse. Para este propósito, foi desenvolvido um procedimento para comparar o efeito da ingestão de cepas produtoras de bacteriocina e suas cepas isogênicas não produt...

Discussão

O procedimento descrito aqui foi usado para determinar se as mudanças na microbiota são vinculadas à saúde ou à idade. Diferentes partes do protocolo são importantes, mas entre elas, amostragem das fezes, a escolha do fragmento de DNA a ser sequenciado e analisado, e a realização da extração de DNA e análises bioinformáticas certamente podem ser os pontos mais críticos. A amostragem é crucial porque, por razões éticas, os camundongos não devem ser estressados ​​e porque é conhecido por mudar a prop...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice (female)	Harlan		Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
Brain-Heart-Infusion broth	Conda	1400.00
European Bacteriological Agar	Pronadisa	1800.00
Agarose D1 Low EEO	Pronadisa	8010.00
1x TAE buffer	Thermo Scientific	15558042
MRS broth	Difco	288130
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
scale	Mettler Toledo	PB602-S
sterile forceps	Levantina de Laboratorios S.L.	260-3710014
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Hermle	Z383K
sodium chloride	AppliChem Panreac	121659.1211
Realpure SSS Kit	Real Life Science Solutions, Durviz, Spain	RBME04 (300 ml)
Isopropanol	AppliChem Panreac	131090.1611
Ethanol	AppliChem Panreac	131086.1214
Qubit fluorometer	Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
AMPure XP beads	Beckman Coulter Genomics, USA	A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit	Quanta BioSciences, Maryland, USA	733-2300
MiSeq v3 reagent kit	Illumina, San Diego, California, USA	MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification			Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit		FC-131-1002	Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.	Sigma	Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter	Biospec Products	11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609.25
Omni Bead Ruptor 24	Omni International Inc.	19-040
mutanolysin	Sigma	M9901-10KU
lysozyme	Roche	10837059001
proteinase K	Roche	3115887001
RNase A	Sigma	R4875