活体影像随访单细胞追踪监测细胞生物学及多神经种群的谱系进展

摘要

本文介绍了一种用延时视频显微镜监测神经种群的鲁棒协议, 并进行了软件后处理。这种方法是一个强有力的工具, 以确定生物事件在选定的人群在现场成像实验。

摘要

了解控制神经细胞数量的重要生物事件的机制, 如增殖, 分化, 或细胞命运决定, 将是至关重要的设计治疗策略的许多疾病影响神经系统。目前跟踪细胞数量的方法依赖于静止图像中的最终结果, 他们通常无法提供足够的时间分辨率来识别单个细胞的行为特征。此外, 细胞死亡的变化, 细胞内的行为异质性, 稀释, 传播, 或用于分析细胞的标记的低效率都是重要的障碍, 将导致不完整或不正确的结果读取。相反, 在适当的条件下执行实时成像和单细胞跟踪是监视这些事件的强大工具。在这里, 一个延时视频显微镜协议, 其次是后处理, 被描述为跟踪神经种群的单一细胞分辨率, 使用特定的软件。所描述的方法使研究人员能够解决关于细胞生物学和不同神经种群谱系进化的基本问题。

引言

为了开发新的和更有效的治疗策略, 以再生神经种群, 我们必须首先了解维持细胞具有再生神经潜能的基本机制。追求这个目标需要对调节静止、增殖/分化、分裂的模式和时间、细胞周期长度、迁移能力、生存力、等的平衡的因素进行全面的了解。尽管它是一种技术方法, 已使用多年¹, 但实时成像和直接观察仍然是监视上面列出的事件的最佳选择。与以 end-point 读数为中心的许多其他方法相反, 实时成像和单细胞跟踪提供了整个实验长度的信息^2,3,4,5,6. 因此, 增加时间分辨率允许细胞死亡, 异质细胞行为, 或细胞命运的决定, 以及许多其他重要事件, 将被发现, 否则可能会被忽视。理想情况下, 细胞的这些功能最好是在单个细胞级的体内,在其中考虑到内在 (细胞自主) 和外在 (细胞小生) 的线索。

然而, 虽然在体外情况发生在不重现自然环境的环境中, 但这些协议中通常使用的低密度培养条件更适合于揭示细胞.此外, 对周围环境的更简单的控制, 通过简单地修改生长培养基, 可能构成一个有价值的工具来调查定义神经生态位的每个外在因素的各自的角色, 并且环境因素可能在病理情况下诱发^7,8,9,10,11,^12,13。因此, 当正确配置时 (如此处所建议的协议), 实时映像提供了一个可行的体外解决方案, 以解决前面列举的大多数问题。

简而言之, 该协议描述了硬件、软件、文化条件, 以及成功执行实时成像实验所需的主要步骤, 然后是单细胞跟踪。这种方法提供了有价值的信息, 有助于揭示生物学的基本方面, 以及多神经种群的谱系进展。

研究方案

以下各节描述了执行实时成像所需的步骤, 后跟多个神经群的单细胞跟踪 (图 1)。所有涉及本议定书所述动物的程序必须按照国际实验动物科学理事会 (委员会) 的指导方针进行。

图 1.方案说明了该程序的主要实验步骤,即: 细胞培养、活体成像、PICC 和数据收集、单细胞跟踪和最终结果。这些步骤根据协议的工作流程进行编号。请单击此处查看此图的较大版本.

1. 细胞培养: 分离和电镀选定的神经人口或细胞谱系

注意: 结合该协议, 给出了它在不同细胞群中应用的例子, 以验证其对神经细胞生物学特性的分析。这些包括: 从小鼠下区 (特区) 获得的成体神经干细胞 (aNSCs) (对于详细的隔离协议, 请参见¹⁴);产后皮质星形胶质细胞研究神经元重编程 (对于详细的隔离协议, 请参见¹⁵);产后小脑星形胶质细胞 (详细的隔离方法参见¹⁶);和小鼠 Neuro-2a 神经母细胞系 (N2a)。

1. 种子细胞直接在聚 d-赖氨酸涂层 24-井板。每井使用1毫升培养基。孵育板在37° c 和 8% co₂为 aNSCs, 或在37° c 和 5% co₂为星形胶质细胞或电池线为 2 h 在活成像之前。避免使用片, 以防止不受欢迎的运动, 因为机动显微镜阶段是流离失所, 使单细胞跟踪不可行。
   注: 在实验中使用的细胞密度和培养基有: 30-40,000 细胞/良好的 aNSCs 在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM:F12 营养混合物培养基);2万细胞/良好的 N2a 细胞在 DMEM 高糖培养基, 8万细胞/井小脑星形胶质细胞在 DMEM 高糖培养基;和55-65,000 细胞/良好的 DMEM:F12 营养混合物培养基中的出生后星形细胞。
2. 通过将培养基的细胞密度调整到最低的细胞数量, 使培养方案标准化。然而, 细胞密度必须足够高, 以维持文化的生存能力。
   注意: 如果细胞密度太高, 多余的碎片或不太好的离解 (团簇) 可能会阻碍单个细胞的跟踪。

2. 实时视频显微成像

1. 打开显微镜、照相机、硬件和孵化系统。设置温度和气压为37° c 和 8% co₂为 aNSCs, 或到37° c 和 5% co₂为星形胶质细胞或电池线。允许温度和 CO₂级别稳定1-2 小时。
   注: 需要特定设备进行延时视频分析, 包括: 明亮的现场/相位对比/荧光显微镜与机动元件;控制温度的孵化装置, CO₂和湿度;最后, 可靠和足够强大的硬件和软件能够获取和处理在现场成像实验中获得的图片量 (请检查材料表)。
2. 一旦细胞牢牢地附着在盘子上 (电镀后2小时), 使用永久性的记号笔在一个井的底部做一个小的标记, 它不会被用于跟踪,也就是说,一个不包含单元格的井。
   注: 此标记将用作对 xyz 坐标零点的引用, 并且可以在实验期间或之后的任何时间使用, 或在介质的变化之间, 返回到零位置。
3. 把盘子放在显微镜的孵化室里, 并将盘子牢牢地贴在舞台上, 以避免在显微镜的机动阶段移位时发生任何不受欢迎的运动。
4. 允许细胞培养基的温度平衡在腔内大约20分钟。由于组件的膨胀, 此步骤将避免在录制过程中失去焦点。
5. 启动实时图像软件并选择延时模块来设置实验。
6. 在 "时间表标签菜单" 中设置实验的总持续时间和图像采集周期。由于所使用的透射或荧光光的固有光, 在分析的时间分辨率和潜在的细胞死亡之间确定一个适当的时间间隔来平衡。
   注: 例如, 总共 120 h 被选择了为新文化, 获取明图片每 5 min. 认为在该配置中获取单个电影的 120 h 将需要在计算机设备中有 120-150 gb 的可用存储空间。
7. 在 "xyz 点" 选项卡菜单中, 选择由 x 和 y 坐标定义的图像位置和焦点距离 (z 坐标)。将参考点 (xyz 零坐标) 作为初始位置, 以便在任何时候检索坐标。
8. 选择 "波长选择选项卡菜单" 中的购置类型, 仅明或在需要时与荧光励磁结合使用。选择曝光时间。记住, 过度的传播, 特别是荧光灯, 可能危及细胞的生存能力 (如上所述)。
   1. 对于 aNSCs, 小脑星形胶质细胞和 N2a, 选择明 (10-50 毫秒曝光时间)。
   2. 对于转皮质星形胶质细胞选择明 (10-50 ms 曝光时间) 结合红色/绿色荧光, 根据记者使用的实验 (红色激发波长: 550 nm 和400毫秒曝光时间; 绿色励磁波长: 460-500 nm 和100毫秒曝光时间)。
9. 定义实验的名称和将存储图像的文件夹。保存位置列表以在任何时间重新加载实验, 一旦设置了所有条件, 请单击 "立即运行" 按钮运行实验。
10. 暂停实验并重新调整焦点条件, 每天单击一次 "覆盖 z 按钮", 直到实验完成。如果在现场成像过程中需要改变介质, 请暂停实验并从时间间隔内取出板。

接下来, 在无菌条件下改变培养基, 并将板材放回舞台 (见步骤 2.3)。重新调整焦点条件并恢复实验。
注意: 由于细胞死亡或繁衍, 以及室温的变化, pH 值的变化可能会影响显微镜对细胞的正确聚焦。对于敏感的文化 (如 aNSCs), 我们建议使用培养基补充 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) (最终浓度: 1 毫米)。

3. 后成像免疫细胞化学 (PICC), 数据收集和处理

1. 一旦实验完成, 暂停软件和检索板的固定和 PICC, 如下所述的步骤。
2. 执行细胞固定: 用1毫升磷酸酯缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞一次, 并添加500µL 甲醛 (4% 在 pbs), 孵化10分钟室温 (RT)。
   注意: 甲醛是一种强力固定剂, 应小心轻放, 避免与皮肤或眼睛接触。它必须只在通风罩内操作。
3. 用1毫升 pbs 洗涤细胞三次, 并添加500µL 的阻断溶液 (pbs 含有 2% (重量/卷) 的牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.2% (卷/卷) 的非离子表面活性剂)。在 RT 处孵育1小时。
4. 移除阻塞解决方案并添加250-400 µL 主抗体溶液。在 RT 处孵育2小时。主要抗体溶液含有在 PBS 中稀释的主要抗体, 其中含有 BSA 的 2% (重量/卷) 和非离子表面活性剂的 0.2% (卷/卷)。在这里所描述的实验中使用的抗体: 胶质纤维 (1:500), βIII-蛋白 (1:1, 000) 和α-蛋白 (1:1, 000)。由于这是直接在井中进行, 需要更大的体积的解决方案 (250-400 µL), 以覆盖所有的细胞。
5. 洗涤三次与1毫升 PBS 和增加250-400 µL 的二次抗体溶液 (稀释如步骤3.4 所述)。二次抗体用于在这里描述的实验: 抗鼠荧光素 (FITC) (1:800), 抗兔 Cy3 (1:500)。在黑暗中孵育1小时。
6. 在 PBS 1 毫升中洗涤三次。将1毫升的 PBS 中的细胞保存在协议的后续步骤中。
7. 将板放回显微镜阶段, 并将其牢固地附着在舞台上, 以避免在机动显微镜阶段的位移过程中不受欢迎的运动。
8. 使用步骤2.2 中所做的标记检索 xyz 零位置, 并通过按 "偏移所有 X、Y、Z" 按钮将位置重新定位到此参考点。重新设定每个位置的焦距。
9. 获取最后一轮图像, 配置在 "波长选择标签菜单" 中荧光发射所需的条件, 以检测以前在 PICC 中针对的抗原。
   1. 简要地, 除明之外, 激活 FITC (励磁: 495 毫微米) 和 Cy3 (励磁: 550 毫微米) 承购选择在软件。使用 10-50 ms 为明 400 ms 曝光检测荧光和按 "1 时间循环" 按钮, 获得最后一轮的图片。
      注意: 荧光强度可能因 PICC 的结果而异。调整展会时间, 以获得最佳的图像质量。
10. 选择软件的 "文件/导出" 选项, 然后将带标记的图像文件格式 (Tiff) 或联合图像专家组格式 (Jpeg) 中的图片导出到预定义的目标文件夹。
11. 将导出的图像转换为跟踪软件所需的格式: 跟踪工具¹⁷ (tTt)。要实现这一点, 请在 "tTt 转换器工具" 操作窗口中定义输入和输出文件夹, 以及用于位置 (xy)、通道 (c) 和时点 (t) 的标记, 然后按 "转换图像" 按钮。
    注意: 图像必须按照特定的设置进行重命名, 并且它们必须存储在单个文件夹中, 用于实验中使用的每个位置。有关安装、要求、重命名位置/图像以及使用跟踪工具的说明, 可在以下站点下载: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html。

4. 单细胞跟踪

1. 重命名数据后, 运行 tTt 软件。选择用户名和 tTt 工作文件夹。
   注意: "跟踪工具" 工作文件夹将保存所有分析的数据和导出的结果。工作文件夹必须命名为 tTtexport, 其中包含名为 "AVIexport"、"配置"、"TreeExport" 和 "tTtfiles" 的子文件夹。
2. 选择要在 "选择实验文件夹窗口" 中加载的实验, 指示存储实验的文件夹路径, 然后单击 "负载实验" 按钮。
3. 运行日志文件转换器以将加载的图像转换为可由跟踪软件读取的格式 (对于第一次加载的实验, 该软件将自动请求)。
4. 通过单击其符号来选择要跟踪的位置 (转换后, 在实验过程中记录的位置的概览将显示在 "位置布局窗口" 中)。每个位置将由一个符号组成, 其中包含位置的图片及其相应的数字 (请参见图 1)。
5. 一旦选择了位置, 并在 "位置布局" 窗口的右侧显示了可用图像的列表, 请选择它们并单击 "加载图像" 按钮。
6. 加载完成后, 出现 "单元格编辑器窗口", 选择要在 "单元格编辑器" 窗口中跟踪的波长和图像间隔。波长0对应于明, 1 对应于 FITC, 2 至 Cy3, 3 至 DAPI。在这里描述的实验中, 使用了间隔 1,即, 所有加载的图像。为了澄清, 间隔2意味着每秒图像的加载。
7. 加载图像后, 返回到 "位置布局" 窗口, 然后双击表示先前加载位置的图标。将出现 "影片窗口", 允许执行单个单元格跟踪。
8. 跟踪工具说明后, 继续跟踪。选择0通道 (对应于明), 并调整亮度和对比度 ("调整伽玛按钮")。按 F2 键启动跟踪。
   注意: 在跟踪过程中, 跟踪的单元格后面将放置鼠标指针并按下 "0" 键。细胞分裂, 细胞凋亡和丢失的细胞按钮可以监测这些特定的细胞事件。

在跟踪实验时, 在跟踪实验时, 这些选项中的每一个都将自动显示在 "单元格编辑器" 窗口中绘制的沿袭树中。

一旦克隆被跟踪, 匹配明图片与 PICC 获得的免疫荧光图像, 以确定细胞的后代的性质。每个荧光通道都将在 "影片窗口" (通道1、2、等) 中表示。

5. 最后结果

1. 一旦完成单单元格跟踪并识别后代, 请将实验 (单元格编辑器窗口/文件选项卡/保存当前树) 保存起来, 然后继续导出结果。
2. 导出位于 "单元格编辑器" 窗口中的 "导出" 菜单中的沿袭树和单元格数据。同样, 通过 "电影窗口" 可访问的 "导出菜单" 导出单元格图像和电影。图像、沿袭树、数据和影片将被导出到 tTt 工作文件夹中。

结果

所描述的方法能够解决有关多个神经种群的细胞生物学的关键问题。例如, 可以监视 aNSCs^{7、8、14、18}的神经源和 oligodendrogliogenic 沿袭的进程。通过跟踪单个 aNSCs 及其子代 (图 2A, B), 可以证明 aNSCs 分离的在体外保持其神经原性, 主要是生成细胞, 并且它们遵循建议的序列体内¹⁹ , 但以前未在单个单元格级别演示。此外, 这种文化系统允许不对称的细胞分裂第一次可视化的新谱系从经济特区 (图 2B), 提供一个独特的模型来研究国安局自我更新^8,14。同样地, 无论血统如何分析, 都有可能获得关于细胞生长、分裂、细胞活力或细胞周期长度的有价值的数据。

图 2.aNSCs 孤立于特区的例子, 并通过现场成像和单细胞追踪进行分析。相位对比图描述了克隆在不同时间点 (天 h: min) 的进展情况。最后的图像对应于后免疫细胞化学 (PICC) 的胶质纤维酸性蛋白 (胶质, 红色), βIII-蛋白 (绿色) 和 4 ", 6-diamidino-2-吲 (DAPI, 蓝色)。(A) 通过不同的放大除法来分析对称的神经源树, 以生成有丝分裂细胞。红色箭头指向对称树中包含的单元格。在右侧, 显示与克隆对应的沿袭树并由 tTt 软件生成。(B) 生成非对称神经源树的祖例, 其中一个分支正在进行放大除法以产生细胞, 而另一根则通过潜在的自我更新事件产生静态胶质细胞。在右侧, 将显示由 tTt 软件生成的沿袭树。在所有世系树: "N" 描述有丝分裂细胞;"G", 淡蛋白胶质阳性细胞;"X", 细胞死亡;和 "？" 一个丢失的细胞。缩放条代表50µm.请单击此处查看此图的较大版本.

活体成像和单细胞追踪分析也提供了一个准确的读数的迁移能力的神经人口。这些信息是从产后小脑星形胶质细胞提交到一个划伤化验²⁰, 产生的信息, 有关的平均距离移动的星形胶质细胞当关闭伤口 (图 3)。此外, 有可能看到一些星形胶质细胞在愈合过程中分裂, 而另一些则在整个实验中保持不变。引人注目的是, 那些分裂的人似乎比他们的 non-dividing 者表现出更多的迁徙行为 (平均旅行两倍)。这一现象表明, 星形胶质细胞能力的一个非常有趣的异质性, 在损伤时形成瘢痕, 这在经典的 end-point 分析实验的出中会被稀释。

图 3.产后小脑星形胶质细胞在刮伤中的迁移行为分析。相衬图像描述的伤口在不同的时间点 (天 h: 分钟)。tTt 软件生成的谱系树, 说明了在闭合伤口时星形胶质细胞的代表性行为。直方图显示由单细胞跟踪分析的星形胶质细胞的平均距离 (平均值± S.E.M.)。缩放条代表50µm.请单击此处查看此图的较大版本.

另一个有趣的特点的延时视频显微镜实验是能力比较增殖和分化在一个细胞的人口。我们测试了 N2a 细胞的条件下, 促进要么增殖 (在存在的10% 胎牛血清 (FBS)) 或分化 (存在 0.5% FBS + 10 µM 花生四烯酸)。在增殖条件下 (图 4A) 可以跟踪这些细胞的谱系进展, 而区分细胞不增殖, 形成突起 (图 4B)。值得注意的是, 单细胞跟踪允许不同增殖能力的菌落进行鉴别, 并对突起伸长 (和收缩) 进行评估, 提供可随后出口的精确和定量数据。

图 4.N2a 细胞生物学在增殖 (A) 或分化条件 (B) 中的监测。相位对比图描述克隆在不同时间点 (天 h: min) 的进展。最后的图像对应于后免疫细胞化学 (PICC) 的α-蛋白 (绿色)。(A) 单个单元格跟踪允许对分部进行监测, 以及不同细胞增殖反应的异质性。在右边, tTt 软件生成的谱系树说明了 N2a 细胞的增殖行为。(B) 分化条件下的细胞退出细胞周期并生成突起, 这一过程可以通过后分析进行有效的测量。单细胞跟踪, 代表的血统树在右侧, 说明如何 N2a 细胞退出细胞周期和停止细胞分裂在分化条件下。缩放条代表50µm。请点击这里查看更大版本的这个数字。

最后, 实时成像和单细胞跟踪是非常有用的监测形态学和分子的变化, 当细胞提交重新编程。活体成像转星形胶质细胞与 Achaete-鳞甲同源 1 (Ascl1) 提供有价值的数据有关的形态学变化发生在重新编程或堵塞细胞分裂时, 星形胶质细胞正在重新编程 (见图 5)。此外, 当 Ascl1 转导与在双肾上腺皮质激素 (DCX) 启动子控制下的绿色荧光蛋白 (GFP) 的构造编码的转导相结合时, 可以定义神经元特异标记的精确时间点开始在重新编程的单元格 (图 5) 中表示。延时视频显微镜还允许成功完成重新编程的细胞数量, 并与在此过程中死亡的细胞进行比较。监视这些事件导致在成功重新编程⁹的单元格中识别关键的 "检查点"。

图 5.神经元重编程后皮层星形胶质细胞的分析。pro-neurogenic Ascl1-Red 荧光蛋白 (RFP) 载体转导诱导。在 DCX 启动子的控制下, 通过 co-transduction 的矢量编码, 对神经元转换进行监测。相位对比图显示了在不同时间点 (天 h: min) 重新编程的进展。荧光图像的 RFP 和 GFP 的表达, 分别。实时成像和单细胞跟踪允许关键事件被遵循, 如形态学改变, 在重新编程期间没有细胞分裂, 细胞死亡, 和精确的时间, 当重组细胞开始表达神经元标记可以定义.缩放条代表80µm.请单击此处查看此图的较大版本.

讨论

活成像的最重要的价值之一是有可能进行准确的血统追踪, 阐明在神经种群中的血统进展的关键方面。沿袭跟踪定义为标识和监视单个祖的所有子代, 从克隆的创建者到随后形成的²¹克隆。值得注意的是, 用于沿袭追踪的替代方法 (例如、病毒转导或多色记者构造²¹) 有一个关键的缺点, 即最终结果基于静止图片, 它不一定构成了整个序列。这意味着细胞死亡, 细胞的行为的异质性, 稀释, 传播或效率低下的标记, 连同其他重要的障碍, 导致不完整或不正确的结果的读出²。此外, 活体成像使研究员能够分析神经种群生物学的重要特征, 如细胞分裂的模式和时间、细胞生长、迁移、增殖与分化、细胞周期长度、突起形成, 复杂和长度, 细胞命运选择 (分化), 或转换 (重新编程)。

此外, 实时成像可以很容易地补充其他的分析, 目的是从单个细胞获得数据, 例如, RNA 测序。然而, 要实现实时成像和其他技术的综合效益, 需要那些以前在电影中监控的细胞以后重新和单独收集进行二次分析。这可以通过使用显微镜, 包括位置坐标, 应用荧光记者对特定的细胞或分析细胞组的分布作为参考。事实上, 转录剖面和个体细胞行为的结合可能是阐明细胞生物学中新的分子线索的有力途径。

一个主要的问题, 可能危及一个活体成像实验是一个不充分的细胞培养密度。如前所述, 在高密度的情况下, 碎片的过剩或不充分的离解 (丛形成) 可能影响图像的质量和空间分辨率, 使单细胞跟踪成为不可靠的。因此, 在不损害细胞培养活力的前提下, 应将研究中不同细胞数量的条件调整到尽可能少的细胞。

图像采集的频率也是至关重要的, 应仔细调整, 特别是在使用荧光照明时。过度暴露于传播, 特别是荧光光可能损害细胞的生存能力。或者, 捕获图像之间的过度延迟可能会干扰分析的时间分辨率。

在现场成像实验中的另一个关键步骤是聚焦的周期性调整。在焦距的正确设置/重新的故障可能会阻碍单个细胞的跟踪。此外, 有必要仔细检查孵化室保存适当的温度、湿度和 CO₂级, 修正可能导致细胞死亡的不希望的变化。

最后, 一旦 PICC 完成后, 在最后一轮图像采集之前正确地检索 xyz 零位是很重要的。不正确的重新的 xyz 零位将使它难以匹配的相衬和免疫荧光图像, 阻碍了识别的细胞后代。

尽管这种方法有许多积极的方面, 但对神经种群的活体成像的一些限制仍然存在。例如, 对 aNSCs 进行成功的单细胞跟踪所需的低细胞密度使得无法使用生化检测, 如西印迹¹⁴。此外, 监测快速分裂的人群, 如小脑星形胶质细胞或 N2a 的单元, 是世俗的限制, 因为它往往是很难跟踪细胞的文化附近的汇合。此外, 许多培养方法, 以及与细胞隔离相关的固有的生物限制, 往往损害细胞的长期生存能力, 限制了实时成像实验的时间。最后, 从它们的自然环境中分离细胞既有积极的一面也有消极的影响。细胞从他们的生理生态位被隔绝可能不接受重要信号调控他们的行为, 而同时, 它代表一个强有力的手段单独地测试这些信号的作用在特定神经的世系进展人口.

鉴于上述限制, 很明显, 完美的方法学方案将是在正常生理情况下进行活体成像和单细胞跟踪实验在体内。但是, 当前的技术无法在大脑的深层区域中长时间地跟踪单个单元格²。因此, 活成像的未来应着眼于克服这一局限性, 旨在充分分析单细胞生物学的细胞在体内与最轻微的干扰可能的生理环境³。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-lysine	Sigma	P0899	Working solution 0.02 mg mL-1
24 wells plate	Falcon	352047
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine)	Invitrogen	21331-020
DMEM High Glucose medium	Sigma	D6546
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003
Triton X-100	Merck	11869	non-ionic surfactant
Mouse anti-β III Tubulin	Sigma	T8660
Rabbit anti-GFAP	DakoCytomation	Z0334
Mouse anti-α Tubulin	Sigma	T5168
Anti-Mouse FITC	Jackson Laboratories	715-095-150
Anti-Rabbit Cy3	Jackson Laboratories	711-165-152
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope	Nikon	TE-2000-E
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives	Nikon	Ref 280MRH10101
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives	Nikon	Ref 280MRH48230
pE-300 LED fluorescence	Cool LED	Ref Number 1981
310M-201 Incubation system (temperature)	OKO-Lab	Serial Nº VOF007307
Pro-ScanII  Motorized stage system	Prior	Serial Nº 60018
High precision microscope camera version 4.2	ANDOR Zyla	VSC-03650
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5	Nikon	NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E
OKO touch Incubation system (CO2)	OKO-lab	Serial number 1716
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line	ATCC	ATCCCCL131
HEPES buffer solution 1 M	Invitrogen	15630-056