口腔生物膜取样在健康儿童中的微生物分析

摘要

在整个儿童时期, 口腔微生物的变化越来越引起人们的兴趣。比较不同的微生物研究表明缺乏标准化的抽样协议。有限的空间使取样的儿童的声音龈下沟的挑战。本文详细地介绍了纸点取样作为该领域的选择方法。

摘要

口腔生物膜及其分子分析为调查各种牙科研究和临床问题提供了依据。对生物膜组成的认识, 可以更好地了解龋和 periopathogenic 机制。在儿童时期口腔内发生的微生物变化有几个原因引起了关注。儿童口腔微生物的演变和其组成的变化需要进一步分析, 以了解和可能预防疾病的发病。同时, 还需要对口腔生物膜的天然成分进行深入的了解。早期的无龋永久牙列与健康的牙龈提供了一个广泛不受影响的龈下栖息地, 可以作为一个原位基线, 研究口腔健康和疾病的特点。儿童口腔生物膜在生命不同阶段的分析是这一领域的一个重要课题。现代分子分析方法可以为生物膜的细菌多样性提供全面的信息。为了实现微生物数据的比较, 对分子数据生成过程中的每个步骤进行标准化是非常重要的。这个过程从临床取样, 下一代测序 (NGS), 生物数据处理, 到分类学解释。其中最关键的因素是生物膜取样。儿童取样更具挑战性, 特别是由于龈下地区的空间有限。因此, 我们的重点是使用纸点龈下取样。本文提供了一个详细的协议, 口腔生物膜取样的龈下沟, 黏膜, 和唾液的儿童。

引言

人体口腔生物膜包括主要由 commensals 和有益微生物组成的广泛群落^1,2,3。在这里找到的物种殖民地的所有利基, 口腔提供^4,5,6。在这些壁龛中, 生物膜的组成变化与生境一样广泛。唾液例如显示不同的细菌外形比匾样品。在健康成人的斑块样本中,放线菌的相对丰度超过 20%, 而唾液中却发现少于7%。Bacteroidetes和厚的对比度在唾液⁷中出现的数字要高得多。因此, 它是重要的样本在不同的位置, 在口中, 以获得整个图片。此外, 不同的因素, 如地理和种族差异, 年龄, 性别, 和许多其他因素, 使得很难确定一般规则的生物膜发展和疾病发作^8,9。多年来, periopathogenic 和龋生物膜的研究一直是一个中心问题^{8,10,11,12,13}。

近年来, 对健康学科的研究不仅对疾病的广泛了解, 而且对预防措施的实施也具有重要意义¹⁴。新技术和分子分析进一步阐明口腔生物膜的形成和功能^15,16, 并启用微生物多样性的完整分析^17,18。这也将导致对正畸治疗期间的微生物变化的新理解¹⁹。对正畸生物材料的发展的影响是可预见的。增强的视角将会对与生物膜有关的正畸治疗的并发症产生新的认识, 如釉质脱矿和牙周疾病^12,20,21。为了允许世界范围内的数据比较, 关键是要标准化数据生成的所有步骤。实验室程序的细微变化会对结果产生强烈影响。此外, 在数据处理中使用不同的计算平台可以导致 non-comparable 数据集。最后, 统计检验和修正的选择对结果有影响。然而, 在任何实验室工作或生物计算开始之前, 取样偏差已经发生很长时间了。非标准化抽样方法导致了一项固有的偏颇研究。鉴于相关研究中的标准化程度低到中等水平, 正畸与微生物的关系有很小的证据¹⁹。因此, 标准化方法的发展将有助于对实地数据进行合格的比较。

本文介绍了标准化的口腔生物膜取样程序。该议定书旨在促进产生全球可比的微生物序列数据的收集。介绍了一种用于健康儿童口腔生物膜取样的 step-by 步协议。作为选择的方法 , 纸点入 atraumatically 入声音龈下沟。为了便于生境比较, 根据同一协议对颊粘膜进行取样。本文还演示了并行和池式取样。此外, 唾液取样显示。还提出了一个简单的 color-coded 运输和存储系统, 便于标本管理, 进一步处理。关于存储介质、基因分析和生物信息学的下游操作选择取决于口腔研究中不同领域提出的临床问题。在这份手稿中, NGS 的 DNA 取样被选为一个可能用于正畸研究的例子。

研究方案

格拉茨医科大学机构审查委员会 (Votum 27-126ex14/15) 批准了礼宾和视频拍摄。此视频出版物的书面同意书是从孩子和她的父母获得的。

1. 仪器和材料

1. 切割校准 (ISO 015/02) 和无菌纸点, 通常用于牙髓治疗, 在第一环标记, 以规范其长度 (图 1)。
2. 应用 UV 光照射在 260 nm 30 分钟, 以避免 DNA 和 RNA 污染的纸张点 (图 2)。
3. 蒸压管在120° c 和1.2 酒吧为存贮在 20 min 和紫外-照射他们以及或使用可利用的伽玛辐照管。

2. 专题的编写

注: 书面知情同意是从孩子和她的父母在入学前获得的。

1. 把可可黄油涂在嘴唇上。
2. 安装脸颊和舌牵引器, 完全进入两个牙科拱门。
3. 在牙菌斑上染色。
4. 卸下干燥的现场设备。
5. 用水冲洗嘴, 直到水无色。
6. 用电刷在45°角度彻底刷牙。只用水, 但不使用牙膏, 因为这将改变口腔生物膜。
7. 再装上干场仪, 包括舌部保持口张开和干燥。
8. 用无菌棉签清洁和干燥索引牙, 避免在纸点取样时吸收龈液。

3. 生物膜取样

1. 龈下沟的纸点取样
   1. 用无菌牙科镊子抓纸点。
   2. 将纸点切至 4 mm 的定义长度。特别注意不要伤害连接上皮 (图 3)。
   3. 二十年代后移除纸张点。
   4. 将纸点直接收集到准备好的管子中: 将纸点尖端直接放在无菌和无 DNA 的瓶子中, 并将其在第三个标记处切割为 4 mm 的标准长度 (图 4)。
   5. 如果由研究协议指示, 在同一站点 (图 5A) 并行插入两个纸点。
   6. 或者, 如果研究协议需要 "汇集样本" (图 5B), 则从多个站点收集纸张点。
   7. 取出干场装置进行黏膜和唾液取样。
2. 黏膜纸点取样
   1. 将纸张点应用于上颊的前庭褶皱 (图 6)。
   2. 闭上脸颊, 简单地按摩一下。
   3. 在二十年代以后打开面颊并且去除纸点。
   4. 在第三个标记处切纸点, 并将其放置在无菌管中, 如龈下取样所示。
3. 唾液取样
   1. 让孩子吐出刺激唾液到一个灭菌的收集容器 (图 7)。

4. 转让和储存

1. 根据研究设计 (图 8), 收集纸点作为单个、池或并行示例。
2. 应用 color-coded 存储系统以便于进一步的示例管理 (图 9)。
3. 最后, 将样品存放在−80° c 等待微生物分析。

结果

在本刊物中, NGS 的 DNA 取样被证明是一个可能应用于正畸研究的例子。细菌 DNA 直接从纸点样品中提取。这种 DNA 可以用于临床或研究问题的微生物组成的研究 (如图 10中所总结的)。

现代分子分析方法, 如 NGS 方法 454-序概述了完整的微生物的样本。数千种细菌的 DNA 在不同的系统发育水平上在 16s rRNA 序列差异中同时被识别。需要生成生物平台, 以便将从大型数据集中检索到的信息构建成集群。统计分析可以应用到微生物数据集。

某些细菌种类的总相对丰度可以被分析, 因为由于生境条件的改变, 微生物可能发生变化。条形图 (图 11) 和 heatmaps (图 12) 在门级或按顺序显示龈下细菌成分。不同的个体和治疗可以通过描述和推断统计来比较。图 13给出了两种不同分类级别的龈下纸点取样模式的直方图比较。表 1显示了在比较两个时间点 (T1 和 T3) 的体外研究中生物膜组成的变化。统计显著的变化是计算与魏氏签名秩测试和以下 Bonferroni 校正从 454-序数据。

最后, 主坐标分析 (动脉) 使在操作分类学单元 (OTU) 级别的直接3D 比较能够在不同的样本中识别出来。在图 14中的动脉图形显示了龈下微生物在五儿童系列中的个体差异。图 15显示了正畸病例对照研究的结果: 粉红色到红色点的情况下, 光到深蓝色的点是控制, 所有取样重复超过四月。在正畸干预 (红点) 后, 明确的病例聚类是微生物群的一个转变。代表控制组的蓝点分布均匀。

图 1: 准备标准长度的纸张点.在第一个环标记处切割无菌校准的纸点, 以使其长度标准化。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2:从 DNA 中消毒和释放纸张点.标准化的纸张点是消毒和紫外线照射在一个干净的长凳。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 龈下纸张点插入.无菌校准的纸点入到龈下的沟中 , 直到 4 毫米圆环标记二十年代。

图 4: 将纸张切割成管子.直接取样后, 在第三环标记 (4 mm) 上将纸张点切割成无菌和无 DNA 的1.5 毫升瓶。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 池和并行取样。两个纸点同时插入到龈下沟的一个牙齿 (A) 或几个纸点到龈下沟的几个牙齿 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 粘膜取样.无菌校准的纸点被放置在前庭褶皱的粘膜上。请单击此处查看此图的较大版本.

图 7: 唾液收集.刺激唾液被吐在一个无菌的烧杯里。请单击此处查看此图的较大版本.

图 8: 取样方案.样品可以收集为单一 (左侧, 一颗牙齿), 汇集 (几个到所有条纹在一个小瓶), 或平行 (蓝色条纹, 两个纸点在一颗牙齿) 样本。请单击此处查看此图的较大版本.

图 9:彩色编码存储一个参考色码为板料和小瓶促进进一步样品处理。请点击这里查看更大版本的这个数字。

图 10: 龈下生物膜分析.临床生物膜取样 (A)、DNA 提取 (B) 和不同 NGS 技术 (C) 的示意图演示。请单击此处查看此图的较大版本.

图 11: 条形图.用 454-序分析了门层细菌的相对丰度。从 Santigli et al.中修改的图像²² 请单击此处查看此图的较大版本.

图 12: 图.用 454-序分析了细菌数量的相对丰度。暗红色代表较高的相对丰度 (和 #62; 10%)。深蓝色代表一个非常低到没有各自细菌顺序的相对丰盈。从 Santigli et al.中修改的图像²² 请单击此处查看此图的较大版本.

图 13: 直方图.不同分类水平下两种纸点取样方式 (a 和 B) 的比较。用 454-序生成的数据。从 Santigli et al.中修改的图像²² 请单击此处查看此图的较大版本.

图 14: 2D 动脉图.一个案例系列 (n=5) 显示个体和个体的差异, 由于两个龈下取样方法 (1 颜色是1主题)。用 454-序生成的数据。从 Santigli et al.中修改的图像²² 请单击此处查看此图的较大版本.

图 15: 3D 动脉绘图动画的快照.显示龈下菌群转移在正畸病例对照研究 (n = 16; 每组, 3 点的时间; 案例: 粉红色到红色, 控制: 光到深蓝色)。用 454-序生成的数据。工作组 Santigli 未公布的数据。请单击此处查看此图的较大版本.

分类: Bacteriae		时间点 1 [%]			时间点 3 [%]			魏氏签名测试
门/属		第二十五	中	第七十五	第二十五	中	第七十五	p-值	p 值调整 #
其他
其他		0.70	1.07	1.28	1.32	1.63	1.93	. 000	. 005
放线菌
放线菌		0.00	0.04	0.13	0.06	0.30	0.97	. 001	. 021
Rothia		0.00	0.00	0.05	0.00	0.13	0.32	. 001	. 009
Bacteroidetes
菌		0.00	0.01	0.22	0.15	1.02	2.44	. 000	. 006
厚
其他 (杆菌)		0.00	0.01	0.06	0.00	0.04	0.10	. 706	1.000
葡萄球菌		0.00	0.01	0.12	0.00	0.07	0.17	. 548	1.000
(Gemellaceae)		0.00	0.00	0.07	0.12	0.77	1.24	. 005	. 091
(Lactobacillales)		0.00	0.00	0.04	0.00	0.12	1.50	. 004	. 073
Granulicatella		0.09	0.23	0.37	0.64	1.59	2.28	. 000	. 003
乳酸		0.00	0.00	0.18	0.00	0.00	0.04	. 700	1.000
其他 (Streptococcaceae)		0.00	0.04	0.13	0.00	0.10	0.19	. 768	1.000
(Streptococcaceae)		0.04	0.10	0.23	0.12	0.37	0.69	. 005	. 083
链球菌		53.42	61.96	88.38	48.44	60.83	73.97	. 055	. 930
其他 (Lachnospiraceae)		0.00	0.00	0.01	0.00	0.00	0.11	. 003	. 058
Dialister		0.00	0.00	0.04	0.00	0.00	0.04	. 240	1.000
Veillonella		3.43	27.15	42.78	6.69	13.38	27.05	. 157	1.000
Proteobacteria
嗜血		0.00	0.00	0.03	0.31	0.84	2.38	. 000	. 008
基于 Bonferroni 校正的 #p 值魏氏符号秩检验
p 和 #60; 0.0026 被认为是重要的

表 1:统计分析健康儿童口腔微生物在两个时间点的差异。用 454-序生成的数据。从斯科特·克鲁格et al.中修改的图像²³

讨论

在口腔内的所有部位都有细菌^24,25,26。许多研究集中在使用唾液作为取样媒介来映射口腔定植, 因为它可以很容易地通过随地吐痰^{27,28,29,30,31, 32}。然而, 唾液生物膜并不能反映龈下生物膜的组成。因此, 使用其他抽样方法是至关重要的创造整个图片, 并将唤起新的讨论, 在牙科研究。几篇文章比较了刮和纸点对周病患者龈下取样的使用情况^8,33,34。然而, 目前还没有一个研究小组关注于对不同年龄组的标准化取样设备的应用, 特别是对儿童¹⁹。

在这段视频中, 我们介绍了口腔生物膜在健康儿童中的三口腔生境的取样。

修改和故障排除:

本论文的目的是对健康儿童龈下生物膜取样的临床方案进行研究。选择的方法是指在有限的空间使取样特别具有挑战性的声音龈下沟。在这个视频中, 该方法适用于早期恒牙。它也可以应用于混合或成熟的牙列, 以及儿童和/或成人。我们的抽样方法允许修改, 如单一或汇集样本。后者可能成为一个关键因素的分子分析, 由于少量的 DNA 收集从健康的龈下沟。可根据需要修改指标牙的选择;特别是, 另一颗牙齿可以作为替代品, 当上皮细胞受到创伤和出血, 从而使纸张的点不可用。平行抽样使用两个纸点同时在一个站点上呈现样本复制的一个步骤, 除了缩短儿童的椅子时间。

与轻微的修改病牙周袋可以取样。这里的纸点将需要插入到口袋的全长, 这可以达到10毫米。纸张的长度和圆锥, 以及插入深度必须适应的口内栖息地的利益, 但应始终是标准化的材料和尺寸。样品也可以从粘膜上使用纸点。相同的协议允许比较不同的口腔生境和各种牙科材料。病人准备和样品存储可以按照本视频中的描述进行。对于 metatranscriptome 的研究, RNA 可以用同样的方法取样。因此, 在取样后, 应直接在 RNA 稳定液中插入纸点。

技术的局限性:

无论如何修改, 我们描述的临床取样方法仅限于龈下沟。其他抽样地点, 例如周病的口袋, 不是我们的研究设计的一部分。由于需要对这些口袋的全部深度进行取样, 纸张点可能不够大, 无法充分收集样本。如果实验目的是比较从龈下沟和周病囊取样的数据, 重要的是要知道与不同的临床取样方法相关的固有偏见。因此, 不宜比较这些数据。

在这里提出的方法的一个限制是抽样不使用碘 monoazide。在取样后直接添加该剂, 可以对生物膜中的活细胞进行具体分析。这里所描述的取样方法反映了活细胞和死体细胞的数量。对于严重牙周炎的研究, 纸点可能需要被刮取代, 因为在深口袋里的生物膜形成强烈。在这些情况下, 纸点取样可能无法反映整个微生物谱, 因为它们的表面可能饱和得太快。

关于现有方法的意义:

本文提出的原稿是在健康沟中用纸点规范龈下取样的第一种方法。其他报告提到使用金属刮^35、36或纸张点^37、38、39, 但没有描述在取样之前发生的过程, 如作为斑块控制, 牙齿清洁, 牙齿隔离, 干燥, 以及由于取样技术和时间线的规格不足而导致的过程。

在前两篇文章中, 我们表明, 使用纸点是一种可重现的方法龈下生物膜取样在儿童^22,40。由于其设计, 刮太大, 对于狭窄的沟, 空间有限, 对嫩连接上皮来说过于尖锐。这是至关重要的, 进入龈下沟没有创伤的上皮。这样, 避免了因出血引起的偏倚。因此, 使用薄和招标的纸张点是首选的这一领域。纸点功能, 以监测在正畸治疗过程中生物膜组成的变化^21,41。他们是苗条和足够灵活的, 以适应之间的固定矫治器具的元素。这是一个主要的优势, 其他抽样方法, 如刮。创伤取样简化, 少量的 DNA 取样是可能的。

未来应用:

在这个视频中, 我们展示了 non-diseased、早、恒牙列的方法。它也可以用于混合或成熟的牙列。随着一些适应, 它是可能的样本周生病的网站, 如牙齿或植入物和其他利基由于牙科材料遵循相同的协议。龋病研究可以受益于这一标准化的协议, 特别是对根龋的研究。从我们的采样视频最重要的讲座是标准化的协议, 使数据可比较, 无论是什么和如何测量样本。未来的视频演示可以提高临床取样领域的总体情况。

如录像所示的口腔生物膜用于诊所和科学调查。这个体内方法代表了一个良好的除了体外分子技术, 如荧光原位杂交和共焦激光扫描显微镜¹⁵。NGS 方法, 如序所示, 适用于收集的生物膜, 允许分析完整的微生物。计算某些细菌种类的相对丰度可用于支持治疗或比较不同的患者或不同的治疗方法。与我们先前描述的⁴⁰的标准化排序协议和序列分析工作流一起, 此抽样方法允许序列分析下至属级别。进一步 "元"-研究例如 metatranscriptomic 或代谢研究是可能的根据在这个录影提供的抽样协议。

关键步骤:

避免污染是一个关键的步骤: 不育仪器必须应用在一个消毒的在体内环境。从口腔到工作台的转移必须由有经验的考官快速而安全地进行, 以便尽可能缩短学习参与者的时间。协议中最关键的步骤是将纸点创伤插入龈下沟。连接上皮和出血的破坏绝对必须避免。为了不沾染带有外源 DNA 或 RNA 的纸点和储存瓶, 必须进一步注意。存储本身也是一个关键步骤。样品需要直接冷冻, 至多在−80° c。这避免了细菌组成后取样的变化, 这将伪造测序结果。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper Points Taper .02, sterilised	VDW Dental	550 029 015	http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g	GC EUROPE N.V.	000387	http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue	DIRECTA AB	Rondell Tablets	http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System	Great Lakes Ortho	300-401	http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush	Oral-B		http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11	Hain Lifescience GmbH	23312	http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck	Greiner Bio One International GmbH	460020	https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
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