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Resumo

Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.

Resumo

Biofilme oral e sua análise molecular proporcionam uma base para investigar várias pesquisa odontológica e questões clínicas. Conhecimento da composição do biofilme leva a uma melhor compreensão dos mecanismos cariogênica e periopathogenic. Microbianas mudanças que ocorrem na cavidade oral durante a infância são de interesse por diversas razões. A evolução da criança microbiota oral e mudanças na sua composição precisa ser analisado ainda mais para compreender e possivelmente prevenir o aparecimento da doença. Ao mesmo tempo, é necessário conhecimento avançado de composição natural do biofilme oral. Primeiras fases da dentição permanente cáries com gengivas saudáveis fornecem um habitat subgengival amplamente afetado que pode servir como uma base em situ para estudar características de saúde bucal e doença. Análise de biofilme oral de crianças durante as diferentes fases da vida, portanto, é um tema importante no campo. Métodos de análise molecular moderna podem fornecer informações abrangentes sobre a diversidade bacteriana de tais biofilmes. Para permitir a comparação de dados da microbiota, é importante a padronização de cada etapa do procedimento para geração de dados moleculares. Este procedimento abrange clínico de amostragem, a próxima geração de sequenciamento (NGS), bioinformatic do processamento de dados, a interpretação taxonômica. Um dos fatores mais críticos aqui é amostragem de biofilme. Amostragem em crianças é ainda mais desafiador em particular devido ao espaço limitado em áreas subgengivais. Focalizamos, portanto, o uso de pontos de papel para amostragem subgengival. Este artigo fornece um protocolo detalhado para amostragem de biofilme oral do sulco subgengival, mucosa e saliva em crianças.

Introdução

Biofilme oral humana é composto por uma ampla comunidade que consiste principalmente de comensais e microorganismos benéficos1,2,3. Espécies encontradas aqui colonizam todos os nichos que a cavidade oral oferece4,5,6. Composição do biofilme nestes nichos varia tão amplamente como os habitats. Saliva, por exemplo, exibe diferentes perfis bacterianas do que amostras de placa. Nas amostras de placa de adultos saudáveis, a abundância relativa de Actinobacteria é mais 20%, enquanto menos de 7% é encontrado na saliva. Bacteroidetes e Firmicutes em contraste aparecem em números muito superiores em saliva7. Assim, é importante a amostra em locais diferentes na boca a fim de obter toda a imagem. Além disso, vários fatores como diferenças étnicas e geográficas, idade, sexo e muitos outros fatores dificultam a identificar as regras gerais de biofilme desenvolvimento e doença início8,9. Por muitos anos, a investigação de periopathogenic e cariogênica biofilme tem sido uma preocupação central8,10,11,12,13.

Nos últimos anos, a pesquisa em indivíduos saudáveis ganhou importância não só para uma compreensão mais ampla da doença, mas também para a implementação de medidas preventivas14. Novas tecnologias e análises moleculares mais elucidar a formação de biofilme oral e função15,16e permitem a criação de perfil completo da diversidade microbiana17,18. Isso é esperado para também levar a uma nova compreensão das mudanças microbianas durante a terapia ortodôntica19. Um impacto sobre o desenvolvimento de biomateriais ortodônticos é previsível. A perspectiva avançada irá lançar nova luz sobre complicações da terapia ortodôntica associada com biofilme, tais como a desmineralização do esmalte e doenças periodontais12,20,21. Para permitir comparações de dados em todo o mundo, é crucial padronizar todas as etapas de geração de dados. Pequenas alterações em procedimentos laboratoriais podem fortemente influenciar os resultados. Além disso, o uso de diferentes plataformas computacionais em processamento de dados pode levar a conjuntos de dados não comparáveis. Por último, a escolha de testes estatísticos e correções tem uma influência sobre os resultados. No entanto, o viés de amostragem já pode ocorrer muito antes de qualquer trabalho de laboratório ou bio-computação começa. Métodos de amostragem não-padronizados originar um estudo inerentemente tendencioso. Tendo em conta a baixa para níveis moderados de padronização nos estudos relevantes, pouca evidência existe na relação entre Ortodontia e microbiomes19. Portanto, o desenvolvimento de métodos padronizados facilitariam qualificado de comparação de dados no campo.

Este artigo apresenta o biofilme oral padronizada procedimentos de amostragem. O protocolo destina-se a contribuir para gerar globalmente comparáveis coleções de dados da sequência microbiana. É apresentado um protocolo passo a passo para amostragem de biofilme oral em crianças saudáveis. Como o método de escolha, pontos de papel são atraumatically inserido no som sulco subgengival. Para facilitar as comparações de habitat, mucosa da bochecha é amostrado de acordo com o mesmo protocolo. Este artigo demonstra adicionalmente amostragem paralela e em pool. Além disso, a colheita de amostras de saliva é mostrada. Um simples código de cores transporte e sistema de armazenamento também é apresentado, facilitando o gerenciamento de amostra para processamento adicional. A escolha das operações a jusante sobre bioinformática, análises de metagenomic e meio de armazenamento depende da clínicas questões levantadas pelos diferentes campos de pesquisa oral. Neste manuscrito, amostragem de DNA para NGS foi escolhida como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica.

Protocolo

Protocolo e tiro vídeo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da universidade médica de Graz (Votum 27-126ex14/15). Consentimento por escrito para a publicação deste vídeo foi obtido por seu pai e o filho.

1. os instrumentos e materiais

  1. Corte calibrado (ISO 015/02) e pontos de papel estéril, geralmente utilizados na terapia endodôntica, na primeira marca de anel a fim de padronizar o seu comprimento (Figura 1).
  2. Aplicar a irradiação de luz UV a 260 nm por 30 min para evitar a contaminação de DNA e RNA dos pontos de papel (Figura 2).
  3. Autoclave os tubos para o armazenamento a 120 ° C e 1,2 bar por 20 min e UV-irradiar-lhes também ou empregar ready-to-use gama irradiados tubos.

2. preparação dos temas

Nota: Escrito consentimento informado foi obtido o filho e seu pai antes da inscrição.

  1. Aplique manteiga de cacau para os lábios.
  2. Montar a bochecha e língua afastador para completo de ambos os arcos dentários.
  3. Mancha a placa dentária com divulgação de placa.
  4. Retire o aparelho do campo seco.
  5. Enxague a boca com água até que a água é incolor.
  6. Escove bem os dentes com uma escova de dente elétrica na angulação de 45 °. Aplica água só, mas sem pasta de dente, como isto alteraria o biofilme oral.
  7. Monte o aparelho de campo seco novamente, incluindo a guarda de língua para manter a boca aberta e seca.
  8. Limpos e secos os dentes do índice cotonetes estéreis para evitar a absorção de fluido supragengival durante papel ponto de amostragem.

3. biofilme amostragem

  1. Ponto de amostragem do sulco subgengival de papel
    1. Compreender os pontos de papel com uma pinça estéril de dental.
    2. Inserir pontos de papel tangencialmente até para um comprimento definido de 4 mm. Tome especial cuidado para não traumatizar o epitélio juncional (Figura 3).
    3. Remover pontos de papel após 20 s.
    4. Acumule pontos de papel diretamente nos tubos preparados: Coloque a ponta de papel ponto diretamente em um frasco estéril e livre de DNA e cortá-lo na terceira marca a um comprimento padronizado de 4 mm (Figura 4).
    5. Se indicado pelos protocolos de estudo, inseri dois pontos de papel paralelos e simultaneamente no mesmo local (Figura 5A).
    6. Alternativamente, recolher pontos de papel de vários sites, se o protocolo de estudo requer "amostras em pool" (Figura 5B).
    7. Retirar o aparelho do campo seco para mucosas e recolha de amostras de saliva.
  2. Papel da mucosa ponto de amostragem
    1. Aplicam-se pontos de papel para a prega vestibular da face superior (Figura 6).
    2. Feche a bochecha e massageá-lo brevemente.
    3. Abra a face e remover os pontos de papel após 20 s.
    4. Cortar os pontos do papel na terceira marca e colocá-los em um tubo estéril como indicado para amostragem subgengival.
  3. Recolha de amostras de saliva
    1. Deixe a criança cuspir saliva unstimulated dentro de um vaso coleção esterilizado (Figura 7).

4. transferência e armazenamento

  1. Acumule pontos de papel como amostras simples, em pool ou paralelas, dependendo do projeto de estudo (Figura 8).
  2. Aplica um sistema de armazenamento codificados por cores para facilitar ainda mais a gestão de amostra (Figura 9).
  3. Finalmente, armazene as amostras em −80 ° C pendente microbiome análise.

Resultados

Na presente publicação, amostragem de DNA para NGS é demonstrada como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica. ADN bacteriano é extraído diretamente de amostras de papel de ponto. Este DNA pode ser usado em estudos da composição microbiana para clínicas ou perguntas de investigação (como resumidos na Figura 10).

Métodos de análise molecular moderna como o método NGS 454-pyrosequencing dar uma visão geral da microbiota completa de uma amostra. O DNA de milhares de bactérias é identificado simultaneamente em diferentes níveis filogenéticos sobre o 16s diferenças de sequência de RNA ribossomal. Plataformas de Bioinformatic precisam ser gerado como um meio de estruturação em clusters, a informação obtida de grandes conjuntos de dados. Análise estatística pode então ser aplicada a microbiota datasets.

A global relativa abundância de determinadas espécies bacterianas pode ser analisada como podem turnos na microbiota devido a mudanças nas condições de habitat. Gráficos de barras (Figura 11) e heatmaps (Figura 12) exibir a composição bacteriana subgengival no nível de filo ou no nível de ordem. Vários indivíduos e tratamentos podem ser comparados por estatística descritiva e inferencial. Figura 13 apresenta uma comparação histograma dos dois modos de ponto papel subgengival de amostragem em diferentes níveis taxonômicos. A tabela 1 mostra a mudança na composição do biofilme durante um estudo em vitro comparando dois pontos de tempo (T1 e T3). Mudanças estatisticamente significativas foram calculadas com o teste de Wilcoxon rank-assinado e correção de Bonferroni seguir a partir dos dados de 454-pyrosequencing.

Finalmente, análise de coordenadas principais (PCoA) permite comparação 3D direta no nível de unidade taxonômica operacional (OTU) conforme identificado em amostras diferentes. As parcelas de PCoA na Figura 14 exibem diferenças intra e inter individual da microbiome subgengival em uma série de casos de cinco filhos. Figura 15 mostra os resultados de um estudo de caso-controle ortodôntico: rosa para pontos vermelhos são os casos, a luz à obscuridade pontos azuis são os controles, todos incluídos na amostra repetidamente durante um período de quatro meses. Um cluster clara dos casos após a intervenção ortodôntica (pontos vermelhos) representa uma mudança na microbiome. Pontos azuis, representando o grupo de controle, são distribuídos uniformemente.

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Figura 1 : Preparar pontos de papel de comprimento padronizado. Pontos de papel calibrado estéril são cortados na primeira marca de anel para padronizar o seu comprimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 : Pontos de papel livre de DNA e esterilize. Pontos de papel padronizados são esterilizados e UV irradiados em uma bancada limpa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 : Inserção de papel subgengival ponto. Pontos de papel calibrado estéril são inseridos tangencialmente ao sulco subgengival até a marca do anel de 4 mm por 20 s.

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Figura 4 : Corte no papel ponto no tubo. Diretamente após a amostragem, pontos de papel são cortados na terceira marca de anel (4 mm) em uma estéril e livre de DNA 1,5 mL frasco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 : Amostragem em pool e paralela. Dois pontos de papel são inseridos simultaneamente ao sulco subgengival de um dente (A) ou vários pontos de papel para os sulcos subgengivais de vários dentes (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6 : Amostragem mucosal. Pontos de papel calibrado estéril são colocados em mucosa da prega vestibular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7 : Coleta de saliva. Unstimulated saliva é cuspir em um béquer estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8 : Plano de amostragem. As amostras podem ser coletadas como single (lado esquerdo, um dente de cada), pool (várias de todos os matizes em um frasco), ou amostras de paralelo (listras azuis, dois pontos de papel em um dente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9 : Color-coded armazenamento. Um código de cor referente para folhas e frascos facilita a mais, amostra de manipulação.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10 : Análise do biofilme subgengival. Apresentação esquemática da amostragem de biofilme clínico (A), extração de DNA (B) e diferentes tecnologias NGS (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11 : Gráfico de barras. Mostrando a abundância relativa de bactérias no nível de filo analisados usando 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 12 : Heatmap. Mostrando abundâncias relativas das ordens bacterianas analisadas usando 454-pyrosequencing. Vermelho escuro representa uma alta abundância relativa (> 10%). Azul escuro representa uma muito baixa para não abundância relativa da respectiva ordem bacteriana. Imagem modificada de Santigli et al . 22 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 13 : Histograma. Comparação de dois modos de papel ponto de amostragem (modos A e B) em diferentes níveis taxonômicos. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 14 : 2D enredo PCoA. Uma série de casos (n = 5) mostrando diferenças individuais intra e inter individuais, como resultado de dois métodos de amostragem subgengival (1 cor é 1 tema). Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 15 : Instantâneo de uma animação 3D de enredo PCoA. Microbiome subgengival apresentando desloca-se em um estudo de caso-controle ortodôntico (n = 16; cada grupo, 3 pontos no tempo; casos: rosa vermelha, controles: luz para azul escuro). Dados gerados com 454-pyrosequencing.Dados inéditos do grupo de trabalho Santigli. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Táxon: BacteriaePonto do tempo 1 [%]Ponto do tempo 3 [%]Teste de Wilcoxon rank-assinado
Filo/génerodia 25Median75ºdia 25Median75ºp-valorp-valor ajustado #
Outros
Outros0.701,071.281.321.631.93.000.005
Actinobacteria
Actinomyces0,000,040.130,060,300,97.001.021
Dentocariosa0,000,000.050,000.130.32.001.009
Bacteroidetes
Prevotella0,000.010.220.151,022,44.000.006
Firmicutes
Outros (bacilos)0,000.010,060,000,040,10.7061,000
Staphylococcus0,000.010.120,000.070.17.5481,000
(Gemellaceae)0,000,000.070.120,771.24.005.091
(Lactobacillales)0,000,000,040,000.121.50.004.073
Granulicatella0,090.230,370.641,592.28.000.003
Lactobacilo0,000,000.180,000,000,04.7001,000
Outros (Streptococcaceae)0,000,040.130,000,100,19.7681,000
(Streptococcaceae)0,040,100.230.120,370,69.005.083
Streptococcus53,4261.9688.3848,4460.8373.97.055.930
Outros (Lachnospiraceae)0,000,000.010,000,000.11.003.058
Dialister0,000,000,040,000,000,04.2401,000
Veillonella3.4327.1542.786,6913,3827.05.1571,000
Proteobactérias
Haemophilus0,000,000,030.310,842.38.000.008
teste de Wilcoxon assinou-rank # valor p ajustado de acordo com correção de Bonferroni
Um p < 0.0026 foi considerado significativo

Tabela 1: Análise estatística. Diferenças na microbiome oral de crianças saudáveis em dois pontos no tempo. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Klug et al . 23

Discussão

As bactérias são encontradas em todos os locais dentro da cavidade oral24,25,26. Muitos estudos têm-se centrado sobre o uso de saliva como um meio de amostragem para mapear a colonização oral como isso facilmente pode ser saboreado através de cuspindo27,28,29,30,31, 32. No entanto, biofilme salivar não reflete composição do biofilme subgengival. Assim, o uso de outros métodos de amostragem é crucial para a criação de toda a imagem e evocará novas discussões na pesquisa odontológica. Vários artigos de comparam o uso de Curetas e pontos de papel para amostragem subgengival de indivíduos doentes remover8,33,34. Ainda nenhum grupo de pesquisa é conhecido por centraram-se sobre a aplicação de dispositivos de amostragem padronizada para diferentes faixas etárias, especialmente para crianças,19.

Neste vídeo, é apresentada o biofilme oral amostragem de três habitats orais em crianças saudáveis.

Modificações e solução de problemas:

O objetivo do manuscrito enfoca o protocolo clínico para recolha de amostras de biofilme subgengival de crianças saudáveis. O método de escolha refere-se ao som sulci subgengival onde o espaço limitado torna especialmente desafiador de amostragem. Neste vídeo, o método foi aplicado a dentição permanente precoce. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura e para crianças e/ou adultos. Nosso método de amostragem permite modificações como única ou em pool de amostras. Este último pode tornar-se um fator crucial para análises moleculares devido à pequena quantidade de DNA colecionável do sulco subgengival saudável. A escolha dos dentes índice pode ser modificada sob demanda; em particular, outro dente pode ser incluídos na amostra como uma alternativa quando o epitélio é traumatizado e sangrando, tornando o ponto de papel inutilizável. Amostragem paralela usando dois pontos de papel simultaneamente em um local processa amostra repetições em uma única etapa, além de encurtar o tempo de cadeira para crianças.

Com pequenas modificações podem ser degustadas doentes periodontais. Aqui pontos papel precisará ser inserido em todo o comprimento do bolso, que pode atingir até 10 mm. O comprimento e conus dos pontos de papel, bem como a profundidade de inserção devem ser adaptados ao habitat intra-oral de interesse, mas sempre deve ser padronizado pelo material e dimensões. Podem também ser recolhidas amostras de mucosa usando pontos de papel. Protocolos idênticos permitem comparações de diferentes habitats orais e vários materiais dentários. Preparação do paciente e armazenamento da amostra podem ser realizadas conforme descrito neste vídeo. Para pesquisa de metatranscriptome, RNA pode ser saboreado com o mesmo método. Assim, após a amostragem, os pontos de papel devem ser inseridos diretamente na solução de estabilização de RNA.

Limitações da técnica:

Independentemente de modificações, o método de amostragem clínicos que descrevemos é limitado ao som sulco subgengival. Outros locais de amostragem, quanto remover doentes bolsos de exemplo, não eram parte do nosso projeto de estudo. Como amostragem de toda a profundidade de tais bolsas é necessário, pontos de papel podem não ser grandes o suficiente para coletar amostras suficientemente. Se o objetivo experimental é comparar os dados amostrados de som sulci subgengival e bolsos remover doentes, é importante estar ciente de viés inerente associado com métodos de amostragem clínicos diferentes. Portanto, não é aconselhável comparar esses dados.

Uma limitação do método aqui apresentado é amostragem sem o uso subsequente de propidium monoazídico. Adicionar este agente diretamente após a amostragem permite a análise específica de apenas as células vivas no biofilme analisados. O método de amostragem descrito aqui reflete o número de células vivas e mortas. Para a pesquisa da periodontite severa, pontos de papel provavelmente precisará ser substituído por curetas, como formação de biofilme em bolsos é forte. Ponto de papel amostragem pode não refletir a todo o espectro microbiano nestes casos, como a sua superfície pode ser saturado muito rapidamente.

Importância no que diz respeito a métodos existentes:

O manuscrito proposto é o primeiro de seu tipo para padronizar subgengival amostragem no sulco saudável com pontos de papel. Outros relatórios referiram-se ao uso de curetas metal35,36 ou papel pontos 37,38,39, mas não descrever os processos que ocorrem antes da amostragem, tais como o controle de placa bacteriana, limpeza do dente, dente isolamento e secagem, bem como os processos que resultam de especificações inadequadas nas linhas de técnica e tempo de amostragem.

Em dois artigos anteriores, mostramos que o uso de pontos de papel é um método reprodutível para recolha de amostras de biofilme subgengival em crianças22,40. Devido ao seu design, curetas são demasiado grandes para o sulco raso com espaço limitado e muito afiada para o epitélio juncional concurso. É crucial acessar o sulco subgengival sem traumatizar o epitélio. Desta forma, evita-se preconceito decorrentes da hemorragia. Assim, o uso dos pontos de papel fino e macio é preferencial para esta área. Pontos de papel são funcionais para monitorar as alterações na composição do biofilme durante o tratamento ortodôntico21,41. Eles são magros e flexível o suficiente para caber entre os elementos dos aparelhos ortodônticos fixos. Esta é uma grande vantagem para outros métodos de amostragem como curetas. Atraumatic amostragem é simplificada e amostragem de pequenas quantidades de DNA é possível.

Aplicações futuras:

Neste vídeo demonstramos o método na dentição permanente, precoce e não-doentes. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura. Com algumas adaptações é possível remover doentes sites como dentes ou implantes e outros nichos devido a materiais dentários da amostra, seguindo o mesmo protocolo. Pesquisa de cárie pode beneficiar deste protocolo padronizado, em particulares estudos sobre cárie de raiz. A palestra mais importante de nossa vídeo de amostragem é a padronização dos protocolos para tornar os dados comparáveis, não importa o que e como as amostras são medidas.Futuras demonstrações de vídeo poderiam melhorar o campo de colheita de amostras clínicas em geral.

Biofilme oral obtido como mostrado no vídeo é usado em clínicas e para investigações científicas. Esta abordagem na vivo representa uma boa adição a em vitro técnicas moleculares como a hibridação do in situ de fluorescência e microscopia15de exploração do laser confocal. NGS métodos, como mostrado aqui, o pyrosequencing aplicada para o biofilme coletado, permitem a análise da microbiota completa. Calcular a abundância relativa de certas espécies bacterianas pode ser usado para tratamentos de suporte ou para comparar diferentes pacientes ou tratamentos diferentes. Juntamente com um sequenciamento padronizado protocolo e sequência de análise de fluxo de trabalho que temos anteriormente descrevem40, este método de amostragem permite a análise de sequência até ao nível de gênero. Mais "meta"-estudos, tais como metatranscriptomic ou metabolómica estudos são possíveis baseiam no protocolo de amostragem apresentado neste vídeo.

Passos críticos:

Evitar a contaminação é uma etapa crítica: instrumentos esterilizados têm de ser aplicadas em um ambiente não-estéril na vivo . A transferência da boca para o banco tem de ser realizada rapidamente e firmemente por um examinador experiente para manter o tempo de cadeira para os participantes do estudo tão curtos quanto possível. O passo mais crítico no protocolo é a inserção atraumática do ponto para o sulco subgengival de papel. Ruptura do epitélio juncional e sangramento absolutamente tem que ser evitado. Mais tem que ser tomado para não contaminar pontos de papel e armazenamento frascos com exógeno DNA ou RNA. O armazenamento em seguida também é uma etapa crítica. Precisam de amostras a serem congelados directamente, na melhor das hipóteses, −80 ° C. Isso evita mudanças na amostragem de post composição bacteriana, que iria falsificar resultados de sequenciamento.

Divulgações

Os autores relatam que não há conflitos de interesse relacionados com esta produção científica de vídeo.

Agradecimentos

Os autores são gratos a Joachim Theussl (centro de pesquisa médica, universidade médica de Graz) para a excelente assistência técnica na produção da vídeo e a Monica Farrell (gestão de pesquisa, universidade médica de Graz) como talento de voz.

Materiais

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Paper Points Taper .02, sterilisedVDW Dental550 029 015http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 gGC EUROPE N.V.000387http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blueDIRECTA ABRondell Tabletshttp://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field SystemGreat Lakes Ortho300-401http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brushOral-Bhttp://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11Hain Lifescience GmbH23312http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheckGreiner Bio One International GmbH460020https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio DiagnostikCarpegen GmbHhttp://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 mlLactanCH77.1  to CH81.1www.lactan
cotton swabsHenry Schein9003182www.henryschein.at

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