マイクロバイにおける健常児の口腔バイオ フィルム サンプリング

Elisabeth Santigli; Martin Koller; Barbara Klug

doi:10.3791/56320

この記事について

要約
要約
概要
プロトコル
結果
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謝辞
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転載および許可

要約

小児期を通じて口腔マイクロバイ変更は、関心が高まるのです。異なるマイクロバイ研究の比較では、標準化されたサンプリングプロトコルの欠如を明らかにします。限られたスペースになります挑戦的な子供の健全歯肉縁下溝をサンプリングします。紙点サンプリングは、この領域の選択の方法として詳細にここで提示されます。

要約

口腔バイオフィルムとその遺伝子発現解析は、様々な歯科研究や臨床疑問を調査するため基礎を提供します。バイオフィルム構成の知識は、齲蝕原性および periopathogenic のメカニズムの理解につながります。小児期に口腔内で起こる微生物の変更いくつかの理由のため重要です。子口腔微生物叢とその組成の変化の進化は理解し、病気の発症を防ぐためにさらに分析する必要があります。同時に口腔バイオフィルムの天然成分の高度な知識が必要です。健康的な歯茎・むし歯のない永久歯の初期段階は、口腔の健康と疾患の特徴を勉強するためその場でベースラインとして使用できる広く影響を受けない歯肉縁下の生息地を提供します。子供たちの生活のさまざまな段階で口腔バイオフィルムの解析、分野で重要なテーマです。現代分子解析手法は、このようなバイオフィルム細菌の多様性について包括的な情報を提供できます。微生物叢のデータ比較を有効にするには、分子データを生成する手順の各ステップを標準化することが重要です。この手順は、臨床サンプリング、次世代シーケンス (NGS) バイオ情報データ処理から分類学的解釈にします。ここで最も重要な要因の 1 つはバイオフィルムのサンプリングです。子供のサンプリングは、限られたスペースに歯肉縁下のエリアの中でもさらに挑戦です。こうして歯肉縁下サンプリングのペーパーポイントの使用に着目します。歯肉縁下の溝、粘膜と唾液子供の口腔バイオフィルムのサンプリングのための詳しいプロトコルを説明します。

概要

人間の口腔バイオフィルムは、共生生物と有益微生物¹^,²^,³のほとんどで構成される広範なコミュニティを構成されています。ここで見られる種は、口腔内が⁴^,⁵^,⁶を提供しているすべてのニッチを植民地化します。これらのニッチのバイオフィルムの組成は、生息地として広く異なります。唾液は、たとえばプラークサンプルよりさまざまな細菌プロファイルを表示します。健康な成人の歯垢、アクチノバクテリアの相対的な豊かさは、以上 20%、7% 未満が唾で見つかった。バクテロイデス門とフィルミクテス門は、対照的に唾⁷ではるかに高い数字で表示されます。したがって、全体像を得るために口の中に別の場所でサンプルに重要です。さらに、地理的な民族の相違、年齢、性別、および他の多くの要因などさまざまな要因で作るバイオフィルムの開発と疾患発症⁸^,⁹の一般的な規則を識別することは困難。長年 periopathogenic と齲蝕原性バイオフィルムの調査の中心的関心⁸^,¹⁰^、¹¹^,¹²^,¹³をされています。

近年、健常者の研究は病気の広範な理解のみならず予防措置¹⁴の実装の重要性を得ています。新しい技術と分子解析さらに口腔バイオフィルム形成と機能¹⁵^,¹⁶、解明し、微生物多様性¹⁷^,¹⁸の完全なプロファイリングを有効にします。これはまた矯正治療¹⁹の間微生物変化の新たな理解につながる予定です。矯正歯科生体材料の開発への影響が予測可能です。強化された視点バイオフィルム、エナメル質脱灰と歯周疾患¹²^,²⁰^,²¹などに関連付けられている矯正治療の合併症に新たな光を当てます。世界データの比較を許可するには、データ生成にすべての手順を標準化することが重要です。検査手順に若干の変更は結果に強く影響を与えることができます。さらに、さまざまなデータ処理の計算プラットフォームの使用は、非対等なデータセットにつながります。最後に、統計的検定や修正の選択結果の影響があります。ただし、既に任意の実験室の仕事のずっと前に発生することがサンプリングバイアスまたはバイオコンピューティングを開始します。非標準のサンプリング方法は、本質的に偏りのある研究にします。関連研究における標準化の中程度のレベルを低の観点から証拠はほとんどは矯正と内細菌叢解析¹⁹関係に存在します。したがって、標準化された方法の開発は、フィールド内のデータの修飾された比較を容易でしょう。

この記事は、標準化された口腔バイオフィルムサンプリング手順を示します。プロトコルは、グローバルに匹敵する微生物のシーケンスデータ集の生成に貢献するものです。小児の口腔バイオフィルムサンプリング手順プロトコルが表示されます。選択の方法、紙が音の歯肉溝に挿入された atraumatically です。生息地の比較を容易にするには、頬粘膜は、同じプロトコルにしたがってサンプリングされます。この記事では、並列およびプールされたサンプリングさらに示します。さらに、唾サンプリングを示します。単純な色分けトランスポートとストレージ・システムも表示され、さらに処理するための検体管理を促進します。記憶媒体、メタゲノム解析、バイオインフォマティクスなど下流の操作は、口腔研究で異分野の臨床疑問によって決まります。本稿では、NGS の DNA サンプルを矯正研究の応用の例として選ばれています。

プロトコル

プロトコルおよびビデオ撮影は、グラーツ医科大学 (Votum 27-126ex14/15) の倫理委員会によって承認されました。このビデオの出版物の書面による同意は、子と彼女の親から入手されました。

1. 機器・材料

カット (ISO 015/02) を校正、滅菌紙のポイントは、通常の長さが (図 1) を標準化するために最初のリングマークでの歯内療法で使用されます。
260 で紫外線照射を適用紙ポイント (図 2) の DNA と RNA の汚染を避けるために 30 分の nm。
オートクレーブ 120 ° C および 1.2 でストレージ用バー 20 分、UV 照射のそれら同様または採用に使えるガンマ照射管。

2 科目の準備

注: 子と入学前に彼女の親から書面によるインフォームドコンセントが得られました。

唇にココアバターを適用します。
頬をマウントし、舌を両方の歯列弓へのフルアクセス用。
プラークの開示と歯垢を染色します。
乾燥したフィールド装置を削除します。
水が無色になるまでは、水で口をすすいでください。
徹底的に 45 ° の角度で電動歯ブラシで歯を磨きます。これが口腔バイオフィルムに変更、水なしの歯磨き粉のみを適用します。
再度、オープンと乾燥、口の中を維持する舌ガードを含む乾燥したフィールド装置をマウントします。
清潔で乾いた紙における歯肉縁上液の吸収を避けるために滅菌綿棒でインデックス歯はサンプリングをポイントします。

3. バイオフィルムサンプリング

歯肉縁下の溝のサンプリングポイントを紙します。
1. 滅菌歯科ピンセットでペーパーポイントを把握します。
2. 定義された 4 mm の長さに接線方向まで紙を挿入します。(図 3) 上皮を傷つけるように注意します。
3. 20 後ペーパーポイントを削除 s。
4. 準備管に直接紙を収集: 滅菌と DNA 無料バイアル内ペーパーポイントの先端を直接を置き、第 3 のマークで 4 mm (図 4) の標準化された長さに切る。
5. 研究プロトコルによって示されると同時に同じサイト (図 5 a) 並列 2 紙点を挿入します。
6. 研究プロトコル「御府内」が必要な場合また、いくつかサイトから紙を収集 (図 5 b).
7. 乾燥したフィールド装置を削除粘膜と唾液サンプリング。
粘膜紙ポイントサンプリング
1. (図 6) の上部の頬の前庭の倍に紙のポイントを適用します。
2. 頬を閉じて、それを簡単にマッサージします。
3. 20 後ペーパーポイントを外し、頬を開く s。
4. 3 番目のマークで紙をカットし、歯肉縁下サンプリングに示されてと生殖不能の管に配置します。
唾サンプリング
1. 滅菌採 (図 7) に刺激されない唾液を吐く子供ができます。

4. 転送とストレージ

研究デザイン (図 8) によって 1 つ、プール、またはパラレルのサンプルとしてペーパーポイントを収集します。
サンプル管理 (図 9) さらに容易にするために色分けされたストレージ・システムを適用します。
最後に、保留中のマイクロバイ解析 −80 ° C でサンプルを格納します。

結果

現在の発行物は、NGS の DNA サンプルは矯正歯科研究のための可能なアプリケーションの例として示されています。紙のポイントサンプルから直接細菌 DNA が抽出されます。この DNA が微生物の組成の研究で使えるし、臨床または質問 (図 10の要約) を研究します。

NGS 法 454-パイロシークエンスなど現代の分子生物学的解析方法は、サンプルの完全な微生物叢の概要を与えます。何千もの細菌の DNA を識別同時に系統の異なるレベルで、16 歳以上の rRNA 配列の差異。バイオ情報プラットフォームは大きなデータセットから取得した情報のクラスターに構造化するための手段として生成する必要があります。統計解析は、細菌叢のデータセットに適用できます。

生息地の環境の変化による細菌叢の変化をことができます、特定の細菌種の全体的な相対的な豊かさを分析できます。バーのグラフ (図 11)、ヒートマップなど (図 12) 門レベルでまたは順序のレベル、歯肉縁下の細菌の組成を表示します。説明的な推論の統計では、様々な個人やトリートメントを比較できます。異なる分類レベルでサンプリングを歯肉縁下紙ポイントの 2 つのモードのヒストグラム比較を図 13に示します。表 1は、2 つの時間ポイント (T1 と T3) を比較する生体外で研究中にバイオフィルム構成でシフトを示します。ウィルコクソンの符号順位検定と 454 パイロシークエンスデータから次のボンフェローニ補正有意な変化を求めた。

最後に、主座標分析 (PCoA) により運用分類単位 (乙) レベルで直接 3 D 比較、異なるサンプルで示す。図 14に PCoA プロットは、5 人の子供のケースシリーズで歯肉縁下のマイクロバイの内および個人間の違いを表示します。図 15は、矯正の症例対照研究の結果を示しています: 赤のドットとピンクの場合、暗い光の青いドットは、4 ヶ月の期間にわたって繰り返しサンプリングされたすべてのコントロール。(赤のドット) の矯正歯科の介入後、ケースの明確なクラスタリング、マイクロバイでシフトを表します。コントロールグループを表すブルーのドットが均等に分散します。

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図 1: 標準化された長さの用紙位置を準備します。滅菌の校正紙は、その長さを標準化する最初のリングマークでカットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2:定置滅菌と DNA からフリーペーパーポイントします。クリーンベンチで UV を照射して標準化された紙が滅菌されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 歯肉縁下紙点挿入します。20 の 4 mm リングマークまで歯肉縁下の溝に滅菌校正紙を接線方向挿入 s。

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図 4: 紙管にポイントを切断します。直接サンプリング後、第 3 リングマーク (4 mm) に、滅菌と DNA 無料 1.5 mL バイアルで紙がカットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 5: プールおよび並列サンプリング。紙の 2 点は、1 つの歯 (A) または (B) いくつかの歯の歯肉縁下の溝にいくつかのペーパーポイントの歯肉縁下の溝に同時に挿入されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 6: 粘膜サンプリングします。滅菌の校正紙は、前庭の倍の粘膜に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 7: 唾コレクション。安静時唾液は滅菌ビーカーに唾を吐きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 8: サンプリング方式。シングル (左側、1 歯)、プール (1 バイアルですべてのストライプにいくつか) または並列 (青のストライプ、1 つの歯で 2 紙点) サンプルとして採取することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 9:ストレージを色分けします。参照色コードシートとバイアルを容易に、さらに処理をサンプルします。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。

figure-results-4816
図 10: 歯肉縁下バイオ解析します。臨床バイオフィルムサンプリング (A)、(B) の DNA の抽出とは異なる NGS 技術 (C) の図式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5260
図 11: 棒グラフ。454 パイロシークエンスを用いて門レベルで細菌の相対量を示します。Santigliらから変更イメージ²² この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 12: ヒートマップ。454 パイロシークエンスを用いて細菌の注文の相対的な存在量を表示しています。濃い赤が高い相対的な豊かさを表します (> 10%)。濃い青を表すそれぞれの細菌のためのない相対的な豊かさに非常に低い。Santigliらから変更イメージ²² この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 13: ヒストグラム。紙の 2 つのモードの比較は、異なる分類レベルでサンプリング (モード A と B) をポイントします。454 パイロシークエンスで生成されたデータ。Santigliらから変更イメージ²² この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 14: 2次元 PCoA プロットします。ケースシリーズ (n = 5) (1 色は 1 科目) 2 つの歯肉縁下のサンプリング方法の結果として個体と個体間の違いを示します。454 パイロシークエンスで生成されたデータ。Santigliらから変更イメージ²² この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 15: 3 D PCoA プロットアニメーションのスナップショット。矯正のケースコントロール研究で示す歯肉縁下マイクロバイシフト (n = 16; 各グループ、時間の 3 点の場合: 赤、コントロールにピンク: 濃い青色に光)。454 パイロシークエンスで生成されたデータ。ワーキンググループ Santigli から未発表のデータ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

分類: 安心	時間ポイント 1 [%]			時間ポイント 3 [%]			ウィルコクソンの符号順位検定
門/属	25	中央値	75	25	中央値	75	p 値	p 値調整 #
その他
その他	0.70	1.07	1.28	1.32	1.63	1.93	.000	.005 メートル式
アクチノバクテリア
放線菌	0.00	0.04	0.13	0.06	0.30	0.97	.001	.021
Rothia	0.00	0.00	0.05	0.00	0.13	0.32	.001	.009
バクテロイデス門
Prevotella	0.00	0.01	0.22	0.15	1.02	2.44	.000	.006
ファーミキューテス門
その他 (細菌)	0.00	0.01	0.06	0.00	0.04	0.10	.706	1.000
黄色ブドウ球菌	0.00	0.01	0.12	0.00	0.07	0.17	.548	1.000
(Gemellaceae)	0.00	0.00	0.07	0.12	0.77	1.24	.005 メートル式	.091
(Lactobacillales)	0.00	0.00	0.04	0.00	0.12	1.50	.004	.073
Granulicatella	0.09	0.23	0.37	0.64	1.59	2.28	.000	.003
乳酸菌	0.00	0.00	0.18	0.00	0.00	0.04	.700	1.000
その他 (Streptococcaceae)	0.00	0.04	0.13	0.00	0.10	0.19	.768	1.000
(Streptococcaceae)	0.04	0.10	0.23	0.12	0.37	0.69	.005 メートル式	.083
連鎖球菌	53.42	61.96	88.38	48.44	60.83	73.97	.055	.930
その他 (Lachnospiraceae)	0.00	0.00	0.01	0.00	0.00	0.11	.003	.058
Dialister	0.00	0.00	0.04	0.00	0.00	0.04	.240	1.000
Veillonella	3.43	27.15	42.78	6.69	13.38	27.05	.157	1.000
プロテオバクテリア
ヘモフィルス	0.00	0.00	0.03	0.31	0.84	2.38	.000	.008
p # - ウィルコクソンの符号順位の値テストに従ってボンフェローニ補正の調整
P < 0.0026 が重要視され

表 1:統計解析します。時間の 2 つの点で健康な子どもの口腔マイクロバイの違い。454 パイロシークエンスで生成されたデータ。Klugらから変更イメージ²³

ディスカッション

細菌は口腔内²⁴^,²⁵^,²⁶内のすべてのサイトで発見されます。多くの研究は、²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^{、唾を吐きを通じて簡単にサンプリングできるよう口腔植民地化をマップするサンプリング媒体として唾液の使用に焦点を当てています。} ³²。しかし、唾液中バイオフィルムは細菌バイオフィルム構成を反映しません。したがって、他のサンプリングメソッドを使用は全体の画像を作成するために重要です、歯科研究で新しい議論を呼び起こすでしょう。いくつかの記事は、罹患科目⁸^,³³^,³⁴の歯肉縁下サンプリング用キュレットと紙の使用を比較します。まだ子供¹⁹の特に、異なった年齢別グループのための標準化されたサンプリングデバイスのアプリケーションに焦点を当てている研究グループはわかっていません。

このビデオでは、小児の口腔生息地 3 口腔バイオフィルムサンプリングが表示されます。

変更とトラブルシューティング:

原稿の目的は健康な子どものポケット内のバイオフィルムをサンプリングするため臨床プロトコルに焦点を当ててください。選択の方法は、限られたスペースが特に困難なサンプリング音の歯肉縁下の溝を指します。このビデオでは、メソッドは早期永久歯に適用されました。または成熟した混合歯列し、子供や大人にも適用できます。サンプリング手法は単一またはプールされたサンプルなど変更をことができます。後者は、DNA 健康な歯肉縁下溝から回収量が少ない原因分子解析のための重要な要因になるかもしれない。インデックス歯の選択は、オンデマンドでの修正が可能特に、別の歯は上皮の傷を負ったときの代替としてサンプリングで出血、ペーパーポイントになり、使用できなくなる可能性があります。1 つのサイトで同時に 2 つの紙のポイントを使用して並列サンプリングは、サンプル子供用椅子時間の短縮だけでなく、1 つのステップでレプリケートをレンダリングします。

わずかな修正と病的歯周ポケットをサンプリングできます。ここで紙が 10 mm に達することができるポケットの完全な長さを挿入する必要があります。長さと挿入の深さだけでなく、紙のイモガイ、関心の口腔内生息地に適応する必要がありますが、材質・寸法等により常に標準化されるべき。サンプルは、ペーパーポイントを使用して粘膜からも撮影することができます。同一プロトコルは、別の口腔生息地と様々な歯科材料の比較を許可します。サンプル・患者の準備はこのビデオで説明されているように実行できます。Metatranscriptome 研究と同じ方法で RNA をサンプリングできます。したがって、サンプリング後、ペーパーポイントが RNA 安定化溶液に直接挿入されます。

技術の制限:

変更に関係なく述べる臨床サンプリングメソッドはサウンドの歯肉溝に限定されます。例罹患ポケットに関しては、他のサンプリングサイトは私たちの研究デザインの一部でした。このようなポケットの完全な深さへのサンプリングは、必要に応じて、紙は十分なサンプルを収集するために十分な大きさかもしれないです。実験目標健全歯肉縁下溝と罹患ポケットからサンプリングしたデータを比較する場合は、さまざまな臨床的サンプリングメソッドに関連付けられている固有のバイアスを認識することが重要です。したがってそれはそのようなデータを比較することをお勧めではありません。

ここで紹介した方法の制限は、propidium monoazide の後に使用することがなくサンプリングです。サンプリング後直接このエージェントを追加する場合は、分析バイオフィルム中で生きた細胞のみの特定の分析できます。ここで述べるサンプリング方法は、生活と死細胞の数を反映しています。重度歯周炎の研究、深いポケット内のバイオフィルム形成が強いので紙ポイントおそらく用キュレット、置き換えする必要があります。紙ポイントサンプリングが彼らの表面を余りにすぐに飽和可能性があります、これらのケースで全体の微生物スペクトルを反映していません。

既存のメソッドの意義:

提案の原稿紙と健常者の溝を歯肉縁下サンプリングを標準化するには、その種の最初のです。金属用キュレット³⁵^,³⁶の使用に言及している他のレポートまたは論文³⁷^,³⁸^,³⁹, をポイントしますが、サンプリングの前に行われるプロセスを説明していませんでしたこのようなプラークコントロールとして歯のクリーニング、歯の分離、乾燥、サンプリング技術と時間のラインに不十分な仕様に起因するプロセスだけでなく。

2 つ前の記事で紙の使用が子供²²^,⁴⁰ポケット内のバイオフィルムをサンプリングするための再現可能な方法であることを示します。それらの設計によって用キュレット、限られたスペースで浅い溝に対して大きすぎると柔らかい上皮に鋭すぎます。歯肉溝上皮をトラウマなしにアクセスすることが重要です。この方法で出血に起因するバイアスを回避できます。したがって、この領域のスリムで柔らかいペーパーポイントを使用してお勧めします。ペーパーポイントは矯正治療²¹^,⁴¹バイオフィルム組成の変化を監視するための機能です。スリムと固定式矯正装置の要素間に合うように十分な柔軟性です。これは治療用キュレットのような他のサンプリング方法の主な利点です。非外科的サンプリングが単純化され、DNA の少量のサンプリングが可能です。

将来のアプリケーション:

このビデオでは、非病気にかかった、初期の永久的な歯のメソッドを示しました。または成熟した混合歯列にも適用することができます。いくつかの適応と同じプロトコルに従うことによって歯やインプラントと歯科材料のための他のニッチのような歯周病罹患のサイトをサンプルすることが可能です。齲蝕の研究は、この標準化されたプロトコルを根面齲蝕に関する特定研究から寄与できます。ビデオ私たちのサンプリングから最も重要な講義は、何とサンプルの測定方法に関係なく、対等なデータを作るためのプロトコルの標準化です。今後のビデオのデモは、一般的に臨床的サンプリングのフィールドを高めることができます。

口腔バイオフィルムのビデオで示すように取得は、診療所で、科学的な調査のために使用されます。この体内の方法は、蛍光の in situハイブリダイゼーションなど共焦点レーザー走査顕微鏡¹⁵分子技術体外に良い付加を表しています。ここに示すパイロシークエンスとして NGS メソッドと、収集したバイオフィルムに適用を完全な微生物叢の解析。治療をサポートする異なる患者またはさまざまな治療法を比較する、特定の細菌種の相対的な存在量の計算を使用できます。このサンプリング法によりシーケンス解析、属レベルまで、標準化されたシーケンスプロトコル、シーケンス解析ワークフローと共に私達が以前持っている⁴⁰の説明。さらに「メタ」-研究など metatranscriptomic やメタボローム研究することがこのビデオで示されるサンプリングプロトコルに基づきます。

重要なステップ:

汚染を避けることは重要なステップ: 滅菌器具が滅菌体内環境に適用されます。口からベンチへの転送は、できるだけ短く研究参加者の椅子の時間を維持する経験豊富な審査官によって迅速かつ安全に行います。プロトコルの最も重要なステップは、歯肉縁下の溝に紙ポイントの非外科的挿入です。上皮と絶対に出血の混乱を避けなければなりません。さらに注意は、紙と外因性の DNA または RNA を持つストレージ・バイアルを汚染するためにしてください。ストレージ自体はその後も、重要なステップです。サンプルは −80 ° C で直接、最高の状態で凍結する必要があります。これはシーケンスの結果を改ざんと、細菌の組成ポストサンプリングの変更を回避できます。

開示事項

この科学的なビデオ生産に関わる利益相反報告なし。

謝辞

著者は、声優として優秀なテクニカルサポートビデオ制作、モニカー・ファレル (研究管理、グラーツ医科大学) ヨアヒム Theussl (医学研究センターは、グラーツ医科大学) に感謝しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper Points Taper .02, sterilised	VDW Dental	550 029 015	http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g	GC EUROPE N.V.	000387	http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue	DIRECTA AB	Rondell Tablets	http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System	Great Lakes Ortho	300-401	http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush	Oral-B		http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11	Hain Lifescience GmbH	23312	http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck	Greiner Bio One International GmbH	460020	https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik	Carpegen GmbH		http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml	Lactan	CH77.1 to CH81.1	www.lactan
cotton swabs	Henry Schein	9003182	www.henryschein.at

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