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摘要

我们报告一个小发夹 RNA (shRNA) 和下一代测序协议, 以确定在小鼠细胞系的 X 染色体失活的监管者与萤火虫荧光素酶和潮霉素抵抗基因融合到甲基 CpG 结合蛋白 2 (MeCP2)非活性 X 染色体上的基因。

摘要

通过插入到染色质中的报告基因的正向基因筛已被广泛用于研究模型生物体的表观遗传控制机制。技术, 包括短发夹 rna (shRNAs) 和聚集定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR) 已启用这样的屏幕在双倍哺乳动物细胞。在这里, 我们描述了一个大规模的 shRNA 屏幕, 用于调节 X 染色体失活 (XCI), 使用小鼠细胞系与萤火虫荧光素酶和潮霉素抗性基因敲在 C 终点的甲基 CpG 结合蛋白 2(MeCP2) 基因不活跃的 X 染色体 (Xi)。在潮霉素 B 选择的情况下, 重新激活该构造, 使我们能够屏蔽一个大型 shRNA 库, 并通过测量其选择后的丰富度来确定重新激活记者的发夹。下一代测序。丰富的发夹, 然后通过测试他们的能力激活的荧光素酶记者在西安单独验证。

引言

女性遗传性精神损害最常见的形式之一, Rett 综合症, 是由MeCP2中的异型突变引起的, X 染色体基因编码了正常神经元功能所必需的蛋白质1。治疗这种紊乱的一种潜在的方法是重新激活在 Xi 上的野生型MeCP2等位基因, 因为MeCP2表达式的恢复被证明可以逆转这种疾病的老鼠模型的神经缺陷1,2,4. 然而, 在生物体34的整个生命周期中, 女性细胞中的两个 X 染色体之一的表观遗传沉默是严格维持的, 而一个 Xi 基因的健壮重新激活可能需要一个主要多种表观遗传调控途径的中断。

为了确定维护MeCP2沉默所需的因素, 我们首先开发了一种转基因小鼠模型, 它携带MeCP2-荧光素酶-潮霉素抗性基因融合(MeCP2-LUC-HR) 对两个 x 染色体之一 (xMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5。虽然从融合结构中表达的MeCP2被证明是不稳定的, 并导致函数丢失, 但表型在 hemizygous 雄性 (X MeCP2-LUC-HR/Y) 中模仿 MeCP2 删除, 报告基因的表达 在与内源 MeCP25的表达式一致的模式下易于检测。然后, 我们在非活动 X 染色体上生成永生化成纤维细胞克隆, 并证实前者表达的野型 MeCP2 而非记者构造;后者的逆是真的。当暴露在已知的 DNA 去甲基化剂被称为废除基因沉默, 5-azacytidine (5-AZA), 细胞与记者在 Xi ("记者细胞") 获得活性的生物发光检测, 表明我们的构造可以重新激活, 因此用于基因筛选。

接下来, 我们为MeCP2沉默的监管者开发了一个高通量的遗传屏幕。记者细胞线首先感染了一个包含 > 6万不同 shRNAs 靶向 > 2.5万基因的逆转录病毒库, 整个鼠标基因组5,6, 然后受到潮霉素 B 选择。用下一代测序方法比较了前、后选择样品中的发夹频率, 因为在潮霉素 B 选择的情况下, 记者重新激活赋予了增长优势, 导致了责任发夹的丰富。利用这一方法, 我们确定了30个与MeCP2沉默有关的基因, 随后通过传感与单个发夹的报告细胞并测量其荧光素酶活性来证实这一发现。

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研究方案

所有涉及动物的步骤都是使用弗雷德？哈钦森癌症研究中心机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。除了 5-azacytidine (5-AZA) 以外, 这里所用的试剂都不知道对人体健康有重大危害。

1. 用MeCP2-卢克-HR 转基因在西安生成一个记者细胞线

  1. 从雌性 xMeCP2-LUC-HR /XMeCP2鼠标中制备小鼠肌腱成纤维细胞
    1. 弄死10-12 天大的女性 XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2鼠标。
    2. 使用直解剖剪刀, 做一个圆周切口通过皮肤的近尾部部分。
    3. 把尸体靠近尾部的底部, 从老鼠身上拉出皮肤, 露出尾部的 fibrocartilaginous 部分。使用手术手术刀将暴露组织的10毫米的末端切除并切割成1毫米长的碎片。
    4. 将零碎的组织转移到含有5毫升 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 的15毫升圆锥管中, 辅以1的 U/毫升青霉素, 1 µg/毫升链霉素, 1.5 毫克/毫升胶原酶, 预过滤通过0.45 µm, 然后0.2 µm 网状过滤器。连续旋转, 在37摄氏度孵育3-4 小时。
    5. 将样品在室温下离心 500 x g , DMEM 10 毫升的并用重悬颗粒, 辅以10% 胎牛血清、1 U/毫升青霉素、1µg/毫升链霉素 (DMEM-10) 和6井组织培养板上的板。通过细胞一次, 并扩大到一个10厘米板块, 然后继续下一步。
    6. 不朽细胞通过执行传导与表达载体携带 HPV-16 病毒癌基因 (E6/E7), 如前所述7。
  2. 选择单个单元格克隆并表征MeCP2报告器表达式
    1. 从10厘米厚的盘子里收割细胞。首先, 吸入培养基, 加入1毫升0.05% 胰蛋白酶-EDTA 和孵育2-5 分钟在37摄氏度。用9毫升的 DMEM-10 淬火, 在15毫升圆锥管中收集悬浮细胞。
    2. 用 DMEM-10 稀释细胞, 最终浓度为 1 cell/100 µL. 通过吹打100µL 将悬浮液输送到每个井中, 将其转移到96井板上。
    3. 孵化37摄氏度, 直到水井汇合, 这可能需要长达2-3 周。每3-5 天更换一次新鲜 DMEM-10 的媒体。当汇合时, 动员细胞与20µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 每井并且分裂他们成二个重复的套96井板材。
    4. 用一组钢板测定荧光素酶的活性。使用均匀的萤火虫荧光素酶检测试剂盒, 不需要去除介质。按照套件附带的协议进行。
    5. 使用步骤1.2.4 中的结果从剩余的板组中选择没有检测到的荧光素酶活性的克隆。将这些克隆扩展到24井, 然后再展开6井板。
    6. 对具有最高荧光素酶活性的克隆执行相同的操作;这将用作验证目的的正则控制。
    7. 在6井的板块中收获一整除, 为西方的印迹。动员细胞与200µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。孵育2-5 分钟, 在37摄氏度。用2毫升的 DMEM-10 淬火, 将一半的细胞转移到1.5ml 离心管。在株溶藻前用 PBS 清洗细胞。或者, 将一半的细胞转移到另一个6井板上。当细胞附着在盘子的底部时, 用 PBS 和溶解冲洗出印迹。
    8. 用 anti-MeCP2 抗体进行西方印迹, 确认荧光素酶阴性细胞表达, 而荧光素酶阳性细胞不表达活性 X 染色体上的野型 MeCP2;按照前面描述的协议8。使用任何野生类型的老鼠的脑组织裂解液作为一个积极的控制。
    9. 在6井板中, 在 2 x 105单元格/井中, 板数个负克隆。治疗一次与10µM 5 AZA, 孵化72小时不改变培养基, 并化验荧光素酶活性, 如步骤1.2.3 所述。
    10. 选择一个阴性克隆 (Xi 克隆), 获得荧光素酶活性与 5 AZA, 并开始扩大到多个10厘米板。将液氮中剩余的负克隆冻结为备用。阳性克隆 (Xa 克隆) 可以保持在组织培养或冷冻, 直到进一步使用。

2. 使用潮霉素 B 选择对库进行重新激活的筛选

  1. 感染测试克隆, 应用选择, 采集 DNA 进行测序
    1. 获得病毒浓缩物的逆转录病毒构造表达发夹从一个 shRNA 图书馆, 或生产浓缩病毒上清, 使用所包含的协议所需的库。
    2. 在继续使用屏幕之前, 滴定库 (如果可用, 则使用 GFP 标记)。目的为传染多样性在0.3 和0.5 之间。
      注: 至少执行四个独立屏幕, 以尽量减少假阳性率。每屏使用20个板, 以获得100倍的库覆盖率, 以保持发夹的适当表示, 并避免随机辍学9。然而, 考虑到积极的选择屏幕和较大的库大小, 更低的覆盖率很可能就足够了。
    3. 上午, 板 1 x 106 Xi 细胞到 10 cm 组织培养板材。
    4. 下午, 通过更换含有病毒上清的新鲜 DMEM-10 和5-10 µg/毫升的凝聚胺来感染盘子。使用步骤2.1.2 中确定的病毒上清液量。
    5. 18-24 小时后, 吸入介质, 并添加10毫升新鲜 DMEM-10 到每个板块。文化为另外 48 h。
    6. 早晨, 用1毫升的0.05% 胰蛋白酶-EDTA 每板和淬火每板9毫升 DMEM-10 细胞。通过100µm 网格过滤器运行悬架。将过滤后的悬浮池组合在一起, 并在 1 x 106单元格/板上种子两组10厘米的板。
    7. 下午, 在一组盘子中更换介质, DMEM-10 含有15µg/毫升的潮霉素 B (0 天)。在另一组中, 仅用新鲜 DMEM-10 替换介质。
    8. 48小时后, 用1毫升0.05% 胰蛋白酶-EDTA 将细胞从未经处理的钢板中动员出来。孵育2-5 分钟, 在37摄氏度。用9毫升的 DMEM-10 淬火。将细胞转移到15毫升圆锥管和离心机在 500 x g 5 分钟室温。吸入上清液并立即进行, 从颗粒中提取 DNA。或者, 在离心步骤之前将细胞放入较大的管中。
    9. 利用苯酚和 chroroform 的混合物提取 dna, 用醋酸钠和冷乙醇沉淀 dna, 如前所述10。池的个人预选 DNA 样品和存储在-20 °c, 直到进一步使用。
    10. 继续培养潮霉素 B 选择集4天。在2天后, 用含有潮霉素 B 的新鲜 DMEM-10 补充选择介质。
    11. 在7天, 只用新鲜的 DMEM-10 替换选择介质。允许2到4天的恢复, 然后按照步骤2.1.8 中的描述来收获细胞。按照步骤2.1.9 中的描述进行 DNA 提取。
  2. 在选择后的样品中识别出的发夹
    1. 使用 5 ' 上下文 (5 '-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG 3 ') 和 3 ' 反向环引物 (5 '-ACATCTGTGGCTTCACTA-3 '), 以放大半发夹从预选和后选择 DNA 样本。使用所有提取的 dna 在不同的 PCR 反应与 100-200 ng dna 每反应。
      注: 这 5 ' 上下文底漆和 3 ' 反向环引物对应于 miR-30 上下文序列上游的 shRNA 插入和序列在 shRNA 循环, 分别。不同的库将需要不同的寡核苷酸。根据需要调整净化步骤以隔离不同的产品尺寸。
    2. 使用尺寸选择珠去除引物和基因组 DNA, 并恢复100和 200 bp 的 PCR 产品. 按照珠子附带的协议。
    3. 准备一个测序库来序列半发夹。每屏至少生成5000万个读取。按照适合于排序工具包和设备的协议进行。
      注: 5000万读取每屏幕提供1000倍的表示, 每个 shRNA 在图书馆和大约10倍覆盖每一个独立的感染 (执行在100倍的代表, 每 shRNA), 确保充分的代表性每个感染事件。
    4. 使用 Perl 脚本枚举每个 shRNA, 它用完美匹配来计算序列。选择在预选池中至少有10个读数的 shRNAs 进行进一步分析。根据1000年的置换计算充实作为后预选计数的比率, 并确定假发现率 (罗斯福)。选择的基因 shRNAs 与 < 5% 罗斯福作为 "命中" 进一步测试。

3. 验证已识别的发夹 ("命中")

  1. 包装慢病毒包含在屏幕上标识的 shRNAs
    1. 种子 8 x 106 293FT 单元格每板在 10 cm 板材。
    2. 第二天, 用9毫升的无抗生素 DMEM-10 每片更换培养基;在转染前30分钟进行。
    3. 在30分钟间隔内, 准备两个混合用于转染:
      1. 准备混合 1 (每板/shRNA; 根据 shRNAs 的总数扩大):10 µL 2 毫克/毫升聚乙烯亚胺 (裴) 在0.5 毫升的最佳最低基本介质。吹打混合, 室温孵育5分钟。
      2. 准备混合 2 (每 shRNA): 4 µg 的 shRNA 向量被封装, 1.5 µg 的 VSV-g 信封向量 (pMD2) 和2.5 µg 的包装载体 (psPAX2), 混合在0.5 毫升的最佳最低基本介质。
        注: 在包装中包括一个空的慢病毒载体向量, 用于以后的感染作为阴性控制。
    4. 加入0.5 毫升混合1到每整除混合 2, 并轻轻地混合吹打。室温下在黑暗中孵化20分钟。
    5. 用滴状的方式将混合物从步骤3.1.2 上涂抹到每个盘子上;轻轻地将盘子搅拌。
    6. 第二天, 用5毫升的新鲜 DMEM-10 取代媒体。
    7. 48小时后, 首次转染, 收集上清, 并通过一个0.22 µm 过滤器运行。预湿过滤器与 DMEM-10, 以最大限度地恢复。
    8. 将过滤后的上清液整除为感染6井板的理想量。
    9. 冷冻整除数在-80 摄氏度以后使用, 或立即进行转导。
  2. 荧光素酶的转导和试验研究 MeCP2 野生型基因在西安的活化和活化。
    1. 上午, 板 1 x 105 Xi 单元格/井到6井板。
    2. 下午, 用2毫升含有慢病毒载体上清的新鲜 DMEM-10 和5-10 µg/毫升的凝聚胺来取代培养基, 从而感染板块。通过一个空的慢病毒载体载体产生的病毒上清液感染控制良好。
    3. 第二天, 用含有1毫克/毫升嘌呤霉素的2毫升 DMEM-10 取代培养基。文化四天。
    4. 用2毫升新鲜 DMEM-10 替换培养基, 并允许48-72 小时恢复。
    5. 动员细胞与150µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。孵育2-5 分钟, 在37摄氏度。用1.5 毫升的 DMEM-10 淬火。将细胞转移到15毫升圆锥管和离心机在 500 x g在室温下10分钟。
    6. 取出介质并并用重悬在荧光素酶检测试剂盒中提供的100µL 裂解缓冲液中的细胞。在室温下孵育5分钟。使用套件附带的协议将裂解物转移到白色96井板上, 并对荧光素酶活性进行检测。以 Xa 细胞为阳性对照, 并以慢病毒载体为阴性对照的 Xi 细胞感染。
      注: 在化验前避免将白板暴露在荧光灯上;这将减少背景和增加化验灵敏度。如果可能的话, 检测试剂盒中提供的议定书被认为是最有效的。
    7. 为了确定发夹是否对活性 X 染色体上的 MeCP2 表达水平有影响, 从 tranduced Xi 细胞中分离 RNA, 并采用定量 PCR 方法测定 MeCP2 mRNA 水平, 并将其用于扩增野生型 MeCP2 (F:5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3 ', R: 5 '-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ')。
    8. 可选:在细胞从嘌呤霉素选择中恢复后, 增加 5-AZA 到最终浓度0.2 µM, 提高测定的灵敏度。在不替换培养基的情况下培养细胞72小时, 然后使用商业荧光素酶检测试剂盒检测荧光素素活性。
    9. 测量沉默野生型 MeCP2 的恢复。在3.2.1 的协议步骤之后, 感染了 MeCP2 在 Xi 上的野生类型的 Xa 细胞, 含有单个发夹的载体。-3.2.4。将 RNA 从细胞中分离出来, 并用引物进行定量 PCR 测量 MeCP2 mRNA 水平, 目的是只放大野生型 MeCP2 (F: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3 ', R: 5 '-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ')。

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结果

小鼠肌腱成纤维细胞是从先前描述的 xMeCP2-LUC-HR/XMeCP2雌性小鼠身上收获的, 它由 HPV-16 virus7 的逆转录病毒传导 E6 和 E7 癌基因所永生化, 并通过限制性稀释进行克隆, 并测试荧光素酶活性和野生型 MeCP2 蛋白的表达 (图 1A 和 1B)。荧光素酶活性是健壮的, 如果记者是在 Xa, 并不能察觉, 如果在西安;本机 MeCP2 表达了一个相互的模式。我们选择了一个克隆?...

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讨论

在我们最近的研究6, 我们产生了一个小鼠细胞系与荧光素酶和潮霉素抵抗基因融合到MeCP2 上的 Xi, 并转基因它与 > 6万 shRNAs 目标 > 2.5万基因的图书馆。我们发现30基因的潮霉素在 B 选择下赋予生存优势, 表明它们在控制MeCP2 和 X 染色体沉默中的作用。这些结果通过传感报告的细胞线与单独发夹和评估激活的无声荧光素酶记者证实。

由于XIST?...

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披露声明

莱科博士作为弗雷德？哈钦森癌症研究中心的一名雇员对这篇文章做出了贡献。 所表达的观点是他自己的, 不一定代表国家卫生研究院或美国政府的意见。

致谢

我们感谢墨尔本大学的罗斯 Dickins 慷慨地提供了 shRNA 图书馆在屏幕上使用。这项工作由 Rett 综合症研究信托基金资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
293FT Cell LineInvitrogenR700-07
5-AzacytidineSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
Anti-MECP2 antibodyMillipore07-013
CollagenaseSigmaC2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene MicroplatesFisher Scientific07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)Open BiosystemsEAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir libraryOpen BiosystemsRMM3796
Fetal Bovine SerumFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY–401–2501Or equivalent
Hygromycin BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2610Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay SystemPromegaE4530Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXTPerkin ElmerN/AOr similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2IlluminaMS-102-2001Use kit compatible with your equipment
Opti-MEMGibco31985-070
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259VSV-G envelope vector
PolybreneSigmaTR-1003-G
PolyethyleniminePolysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260Packaging vector
PuromycinGibcoA11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300-054

参考文献

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  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

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