풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

요약

우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.

초록

리포터 유전자는 섬으로에 삽입을 사용 하 여 앞으로 유전 스크린 모델 생물에서 후 컨트롤의 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs) 및 클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)를 포함 하 여 기술 2 중 포유류 세포에서 이러한 화면을 활성화 했습니다. 여기 우리 x 염색체 비활성화 (XCI)의 레 귤 레이 터에 대 한 대규모 shRNA 스크린 반딧불 luciferase murine 셀 라인을 사용 하 여 설명과 hygromycin 저항 유전자에서 절 메 틸 CpG 의무적인 단백질의 C-말단에 2 (MeCP2) 유전자 에 비활성 x 염색체 (Xi). 기자 셀 라인 구축의 재 활성화 hygromycin B 선택, 큰 shRNA 라이브러리 및 그들의 포스트 선택 농축을 사용 하 여 측정 하 여 기자를 다시 활성화 하는 헤어핀을 식별를 생존 우위를 수 여 다음-세대 시퀀싱입니다. 풍부한 헤어핀은 개별적으로 xi luciferase 기자를 활성화 하는 능력을 테스트 하 여 확인 됩니다.

서문

한 여성, 레트 증후군, 유전 성 정신 장애의 가장 일반적인 형태는 MeCP2, 정상적인 신경 기능¹에 필수적인 단백질을 인코딩하는 x 염색체 유전자 heterozygous 돌연변이 의해 발생 합니다. 이 장애를 치료 하는 잠재적인 접근 방식을 것 사이에 야생-타입 MeCP2 대립 유전자의 재 활성화 MeCP2 식의 유신이 질병^1, 의 마우스 모델에서 신경학 상 적자를 표시 했다 ^{2 , 그러나 4}., 단단히는 유기 체^3,4의 수명에 걸쳐 유지 한 개의 암 세포에서 염색체 X의 epigenetic 입을 하 고 사이 유전자의 강력한 재 활성화 가능성이 주요 요구 여러 epigenetic 규제 경로의 교란 한다입니다.

MeCP2 침묵의 유지 보수에 필요한 요소를 식별 하려면 우리가 먼저 개발 유전자 변형 마우스 두 X 염색체 중 하나에 MeCP2-luciferase-hygromycin 저항 유전자 융합 (MeCP2-뤽-시간)을 들고 (X ^MeCP2-LUC-HR/X^MeCP2)⁵. 비록 MeCP2 퓨전 구문에서 표현 된이 불안정 하 고 손실 함수, hemizygous 남성 (^{MeCP2 뤽 시간}/Y) X에 MeCP2 삭제 phenotypically 흉내 낸 리포터 유전자의 표현에에서 결과 판명 내 생 MeCP2⁵의 식과 일치 패턴에서 쉽게 감지 했다. 우리 다음 비활성 또는 액티브 x 염색체에 구조와 불멸 하 게 섬유 아 세포 클론을 생성 하 고 그 전 표현 야생 타입 MeCP2 하지 기자 구문; 확인 역은 후자에 대 한 사실 이다. DNA 유전자 침묵, 파기를 알려진 에이전트 demethylating 5-azacytidine (5-아 자)에 노출 되 면 셀 ("기자 셀") 사이에 기자와 얻은 활동 우리의 구문을 다시 활성화 수 나타내는 생물 발광 분석 결과에 따라서 유전자 검사에 대 한 사용.

우리는 다음 MeCP2 침묵의 레 귤 레이 터에 대 한 높은 처리량 유전 스크린을 개발 했다. 기자 셀 라인 처음 retroviral 라이브러리를 포함 하는 감염 > 60000 다른 shRNAs 대상 > 마우스 게놈^5,6, 걸쳐 25000 유전자 다음 hygromycin B 선택 대상. 헤어핀 주파수 사전에 비교 했다 고 후 선택 샘플 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여, 기자로 재 hygromycin B 선택 성장 이점 수 여 책임 헤어핀의 풍부 귀착되 었 다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 MeCP2 , 침묵에 연루 30 유전자를 확인 하 고 이후 개별 헤어핀 기자 셀 시험 그들의 luciferase 활동을 측정 하 여 결과 확인.

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프로토콜

동물을 포함 하는 모든 단계는 프레드 허 친 슨 암 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 되었다. 여기 사용 아니 시 약 5-azacytidine (5-아 자)를 제외 하 고 중요 한 인간의 건강 위험 포즈를 알려져 있습니다.

1. 생성 하는 사이에 MeCP2뤽 HR transgene 기자 셀 라인

1. ^{MeCP2 뤽 시간} /X X 여성에서 마우스 힘 줄 섬유 아 세포를 준비^MeCP2 마우스
   1. 하루에 10-12를 안락사-^{MeCP2 뤽 시간}/X X 오래 된 여성^MeCP2 마우스.
   2. 바로 해 부가 위를 사용 하 여 인접 꼬리 부분의 피부를 통해 완곡 한 절 개를 확인 합니다.
   3. 꼬리의 기지 근처에 시체를 들고, 꼬리 fibrocartilaginous 부분을 노출 하는 마우스에서 피부를 당겨. 제거 하 고 잘라 터미널 노출 조직의 10 m m 1 m m 수술 메스를 사용 하 여 긴 조각.
   4. 전송 조각난된 조직 15 ml 원뿔 튜브 포함 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스, 그리고 콜라 1.5 mg/mL, 보충 사전 0.45 μ m 및 다음 0.2 µ m 메쉬 필터를 통해 필터링. 3-4 시간 연속 회전 37 ° C에서 품 어.
   5. 원심 분리기 샘플 500 x g 에 실 온에서 10 분에 대 한 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스 (DMEM-10)과 6 잘 조직 문화 접시에 접시와 보충 DMEM의 10 mL에 펠 릿을 Resuspend. 셀을 한 번 통과 하 고 단계로 진행 하기 전에 10 cm 접시에 확장.
   6. 앞에서 설명한⁷HPV 16 바이러스 성 oncogenes (E6/E7)를 들고 식 벡터와는 변환을 수행 하 여 세포를 불멸.
2. 단일 세포 클론 선택 및 MeCP2 기자 식
   1. 10 cm 접시에서 세포를 수확. 첫째, 미디어 발음, 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10의 9 mL와 quench 고 15 mL 원뿔 튜브에 resuspended 세포를 수집 합니다.
   2. 셀을 희석 DMEM-1 셀/100의 최종 농도에 10 µ L. 전송 96 잘 접시를 정지 pipetting 100 µ L에 의해 각 우물에.
   3. 우물은 최대 2-3 주를 걸릴 수 있습니다 합칠 때까지 37 ° C에서 품 어. 3-5 일 마다 신선한 DMEM-10 미디어를 교체 합니다. Confluent, 잘 당 0.05% 트립 신-EDTA의 20 µ L로 세포를 동원 하 고 96 잘 접시의 두 가지 중복 집합으로 그들을 분할.
   4. 격판덮개의 1 세트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과. 미디어 제거를 요구 하지 않는 균질 반딧불 luciferase 분석 결과 키트를 사용 합니다. 키트에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.
   5. 1.2.4 단계에서 결과 사용 하 여 격판덮개의 나머지 세트에서 감지 luciferase 활동 없이 클론을 선택. 이러한 24-잘, 다음 6-잘 접시를 확장 합니다.
   6. 가장 높은 luciferase 활동; 클론 동일을 수행합니다 이 유효성 검사를 위해서 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
   7. 서쪽 오 점을 위해 6 잘 플레이트에 각의 약 수를 수확. 0.05% 트립 신-EDTA의 200 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10, 2 mL와 quench 그리고 1.5 ml 원심 분리기 튜브에 세포의 절반을 전송. 서쪽 오 점을 위해 lysing 하기 전에 한 번 PBS와 셀을 세척. 또는, 다른 6 잘 플레이트 세포의 절반을 전송 합니다. 셀 접시의 바닥에 연결, PBS와 린스 그리고 서쪽 오 점을 위해 lyse.
   8. 수행 하는 서쪽 오 점 안티 MeCP2 항 체는 luciferase 부정적인 세포 표현, luciferase 긍정적인 세포 활성 X 염색체;에서 야생-타입 MeCP2 표현 하지 않는 하는 동안 확인 된 앞에서 설명한 프로토콜⁸을 따릅니다. 뇌 조직에서 어떤 야생 타입 마우스 lysate를 사용 하 여 긍정적인 통제로.
   9. 2 x 10⁵ 셀/잘 6 잘 플레이트에에서 여러 가지 부정적인 클론 접시 10 µ M 5-아 자 한 번 치료 하 고, 72 h에 대 한 미디어, 변경 하지 않고 품 어 1.2.3 단계에서 설명한 대로 luciferase 활동에 대 한 분석 결과.
   10. Luciferase 활동 5-아 자 고 여러 10 cm 접시에 그것을 확장을 시작 하는 클론 (사이 클론)이 부정적인 하나를 선택 합니다. 백업으로 액체 질소에 나머지 부정적인 클론을 고정 합니다. 긍정적인 복제품 (클론 Xa) 조직 문화에서 유지 하거나 추가 사용까지 냉동 수 있습니다.

2. 심사 hygromycin B 선택을 사용 하 여 다시 활성화에 대 한 라이브러리

1. 테스트 복제 감염, 선택, 적용 및 시퀀싱에 대 한 DNA를 수확
   1. ShRNA 라이브러리에서 헤어핀을 표현 하는 retroviral 구문의 바이러스 집중 얻거나 집중된 바이러스 상쾌한 원하는 라이브러리에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 생산.
   2. 화면을 계속 하기 전에 적정 라이브러리 (사용 하 여 GFP 마커 사용 가능한 경우). 0.3에서 0.5 사이 감염의 다양성에 대 한 목표.
      참고: 거짓 긍정적인 요금을 최소화 하기 위해 적어도 4 개의 독립적인 화면 수행 합니다. 헤어핀의 적절 한 표시를 유지 하 고 임의의 중단⁹피하십시오 도서관의 100 범위를 화면 당 20 접시를 사용 합니다. 그러나, 그것은 가능성이 낮은 범위 겠지만 긍정적인 선택 화면과 큰 도서관 크기를 감안할 때.
   3. 아침에, 1 x 10⁶ 사이 셀 10cm 조직 문화 접시에 접시.
   4. 오후에 신선한 DMEM 10 바이러스 상쾌한과 polybrene의 5-10 µ g/mL를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 2.1.2 단계에서 확인 하는 바이러스 성 상쾌한의 금액을 사용 합니다.
   5. 18-24 h 후 미디어 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 DMEM-10의 10 mL를 추가 합니다. 또 다른 48 h에 대 한 문화입니다.
   6. 아침에 접시 당 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL를 사용 하 여 셀을 동원 하 고 접시 당 DMEM-10의 9 mL와 끄다. 100 µ m 메쉬 필터를 통해 정지를 실행 합니다. 필터링 된 정지를 함께, 수영장 그리고 1 x 10⁶ 셀/접시에 10 cm 격판덮개의 2 세트 씨앗.
   7. 오후에 격판덮개의 1 세트에 미디어를 DMEM 10 15 µ g/mL hygromycin B의 (0 일) 포함 된 바꿉니다. 다른 세트에는 미디어를 신선한 DMEM-10만 바꿉니다.
   8. 48 시간 후 치료 접시 0.05% 트립 신-EDTA의 1 ml를 사용 하 여 집합에서 셀을 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 9 mL와 끄다. 실 온에서 5 분 동안 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g에서 원심 분리기를 셀을 전송. supernatants 발음 하 고 즉시 알 약에서 DNA를 추출 진행. 또는, 원심 분리 단계 전에 큰 튜브로 셀 풀.
   9. 페 놀 및 chroroform의 혼합물을 사용 하 여 DNA를 추출 하 고 앞에서 설명한¹⁰으로 나트륨 아세테이트와 냉 에탄올과 DNA를 침전. 개별 사전 선택 DNA 샘플을 보유 하 고 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 합니다.
   10. 계속 경작 hygromycin B 선택 4 더 많은 일에 대 한 설정. 2 일 후 신선한 DMEM-10 포함 hygromycin B와 선택 미디어를 보충.
   11. 7 일에 신선한 DMEM-10만 선택 미디어를 교체 합니다. 복구에 2 ~ 4 일을 허용 하 고 단계 2.1.8에서에서 설명한 대로 셀을 수확. 2.1.9 단계에서 설명한 대로 DNA 추출 진행.
2. 확인 후 선택 샘플에 농축 헤어핀
   1. 사용 5' 컨텍스트 (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') 3 ' 반전 루프 뇌관 (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3')에서 사전 및 사후 선택 DNA 샘플 반-헤어핀을 증폭. 모든 추출 된 DNA를 사용 하 여 별도 PCR 반응에 100-200 ng와 DNA의 반응 당.
      참고: 이러한 컨텍스트 뇌관 5'과 3' 반전 루프 뇌관 및 해당 합니다 미르-30 컨텍스트 시퀀스 shRNA 삽입의 상류 shRNA 루프에서 순서 각각. 다른 라이브러리는 다른 oligos를 요구할 것 이다. 정화 단계 분리 필요에 따라 다른 제품의 크기를 조정 합니다.
   2. 뇌관 및 genomic DNA를 제거 하 고 100과 200 bp. 사이 PCR 제품을 복구를 사용 하 여 크기 선택 구슬 구슬에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.
   3. 하프-헤어핀을 시퀀싱 하는 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다. 스크린 당 50 백만 이상 읽기를 생성 합니다. 시퀀싱 장비 및 장비에 대 한 적절 한 프로토콜을 따릅니다.
      참고: 각 shRNA 라이브러리에서의 1000-fold 표현 및 약 10의 범위 (각 shRNA 100 표현에서 실시) 각 독립적인 감염의 적절 한 표현을 보장 화면 당 50 백만 읽기 제공 합니다. 각 감염 이벤트입니다.
   4. 완벽 한 일치와 시퀀스를 계산 하는 펄 스크립트를 사용 하 여 각 shRNA 열거 합니다. 추가 분석을 위해 미리 선택 수영장에서 적어도 10 읽기를 했다 shRNAs를 선택 했다. Preselection를 후의 비율 계산 하 고 틀린 발견 비율 (FDR) 1000 순열 기준 결정은 풍부를 계산 합니다. 유전자와 shRNAs의 대상 선택 < 5%로 루즈벨트 "조회 수" 추가 테스트를 위해.

3. 유효성 확인 된 헤어핀 (이 하 "조회 수")

1. 화면에서 식별 하는 shRNAs를 포함 하는 포장 하는 lentiviruses
   1. 시드 8 × 10 10 cm 접시에 접시 당⁶ 293 피트 셀.
   2. 다음 날, 항생제 무료 DMEM-당 10의 격판덮개; 9 mL 미디어를 바꿉니다 이 분 transfection 전에 마십시오.
   3. 30 분 간격 동안 두 믹스 transfection에 대 한 준비:
      1. 믹스 1 준비 (접시/shRNA; 당 최대 규모 shRNAs의 총 수에 따라): 10 µ L의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 2 mg/mL polyethylenimine (페이). Pipetting으로 혼합 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
      2. 믹스 2 (shRNA) 당 준비: 패키지 될 shRNA 벡터의 4 µ g, VSV G 봉투 벡터 (pMD2.G)의 1.5 µ g 그리고 2.5 µ g 포장 벡터 (psPAX2)의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 혼합.
         주: 부정적인 컨트롤로 나중 감염에 사용 하 여 포장에 빈 lentiviral 벡터를 포함 합니다.
   4. 믹스 2, 각 약 수를 믹스 1의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 품 어.
   5. 단계 3.1.2 dropwise 패션;에서 각 접시에 혼합물을 적용 부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다.
   6. 다음 날, 신선한 DMEM-10의 5 mL는 미디어를 바꿉니다.
   7. 48 시간 후에 초기 transfection는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 실행. 사전 필터 DMEM-10 복구를 최대화 하기를 젖은.
   8. 6 잘 플레이트를 잘 감염에 대 한 이상적인 금액으로 필터링 된 상쾌한 약 수.
   9. 나중에 사용 하기 위해-80 ° C에서 aliquots 고정 또는 즉시 변환 진행.
2. 변환 및 luciferase 기자 재 활성화 및 야생-타입 MeCP2 유전자는 xi의 재 조직에 대 한 개별 헤어핀의 테스트.
   1. 아침에, 1 x 10⁵ 사이 6 잘 플레이트에 셀/잘 플레이트.
   2. 오후에 lentiviral 상쾌한 및 polybrene의 5-10 µ g/mL 신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 바이러스 성 상쾌한 빈 lentiviral 벡터에서 생산으로 잘 컨트롤을 감염.
   3. 다음 날, 2 mL DMEM-10 포함 1 mg/mL puromycin의 미디어를 바꿉니다. 4 일에 대 한 문화입니다.
   4. 신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 교체 하 고 48-72 h 복구에 대 한 허용.
   5. 0.05% 트립 신-EDTA의 150 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 1.5 mL와 끄다. 실 온에서 10 분간 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g 에서 원심 분리기를 셀을 전송.
   6. 미디어를 제거 하 고 resuspend 100 µ L 세포의 용 해 버퍼 luciferase 분석 결과 키트에 제공 된에 셀. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 흰색 96 잘 접시와 키트에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과 lysates 전송. Xa 세포를 사용 하 여 긍정적인 제어 및 부정적인 컨트롤로 빈 lentiviral 벡터와 감염 사이 세포로.
      참고: 분석 결과; 전에 형광등에 흰색 번호판을 노출 하지 않도록 이 배경 하는 분석 결과 감도 증가 하십시오. 분석 결과 키트에 제공 된 프로토콜 가능한 어둠 속에서 수행 하는 경우 가장 효과적인 것으로 발견 되었다.
   7. 액티브 x 염색체에는 머리 핀에 MeCP2 식 수준에 영향을 했다 여부를 확인 하려면 tranduced 사이 세포에서 RNA를 분리 하 고 뇌관만 야생 타입 MeCP2 (f:를 증폭 하도록 설계 되었습니다으로 양이 많은 PCR를 사용 하 여 MeCP2 mRNA 수준 측정 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
   8. 옵션: 셀 puromycin 선택에서 회복 후 0.2 µ M의 최종 농도에 5-아를 추가 하 여 분석 결과의 감도 증가. 미디어를 교체 하지 않고 72 h에 대 한 셀을 문화 그리고 상업 luciferase 분석 결과 키트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 다음 분석 결과.
   9. 입 막 음된 야생-타입 MeCP2의 재 활성화를 측정 합니다. 단계는 프로토콜 3.2.1 개별 헤어핀을 포함 하는 벡터와 xi, 야생 타입 MeCP2 항구 Xa 세포를 감염. -3.2.4. 세포에서 RNA를 분리 하 고 정량 PCR 뇌관만 야생 타입 MeCP2를 증폭 하도록 설계 되었습니다 사용 하는 MeCP2 mRNA 수준 측정 (f: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', r: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').

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결과

마우스 힘 줄 fibroblasts 수확 했다^{MeCP2 뤽 시간}/X X 이전 설명에서 HPV 16 virus7에서 e 6와 E7 oncogenes의 retroviral 변환에 의해 불후^MeCP2 여성 마우스 제한 희석을 사용 하 여 복제 및 테스트 luciferase 활동과 표현 야생-타입 MeCP2 단백질 (그림 1A 및 1B). Luciferase 활동은 기자, Xa에 있었다면 강력 하 고 탐지 사이; 하는 경우에 네이티브 MeCP2 식 전시 상호 패턴. ?...

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토론

우리의 최근 연구⁶, luciferase murine 셀 라인 생성 그리고 hygromycin 저항 유전자는 사이에 MeCP2 융합의 도서관으로 불리고 > 60000 shRNAs 대상 > 25000 유전자. 우리는 발견 30 유전자 hygromycin B 선택, 누구의 노크 다운 수 여 생존 이점을 MeCP2 x 염색체 입을 통제에서 그들의 역할을 제안. 이러한 결과 개별 헤어핀으로 보고 셀 라인을 시험 하 고 침묵 luciferase 기자의 재 활성화를 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT Cell Line	Invitrogen	R700-07
5-Azacytidine	Sigma	A2385-100MG
Agencourt AMPure XP	Beckman-Coulter	A63881
Anti-MECP2 antibody	Millipore	07-013
Collagenase	Sigma	C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates	Fisher Scientific	07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)	Open Biosystems	EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library	Open Biosystems	RMM3796
Fetal Bovine Serum	Fisherbrand	03-600-511
HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	Or equivalent
Hygromycin B	Calbiochem	400051-1MU
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System	Promega	E4530	Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT	Perkin Elmer	N/A	Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2	Illumina	MS-102-2001	Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM	Gibco	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
pMD2.G	Addgene	#12259	VSV-G envelope vector
Polybrene	Sigma	TR-1003-G
Polyethylenimine	Polysciences	23966-1
psPAX2	Addgene	#12260	Packaging vector
Puromycin	Gibco	A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054