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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Segnaliamo un short hairpin RNA (shRNA) e sequenziamento basato su protocollo di ultima generazione per l'identificazione dei regolatori di inattivazione del cromosoma x in una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina fuse con il metil CpG binding protein 2 ( MeCP2) gene sul cromosoma di X inattivo.

Abstract

Avanti schermi genetici usando geni reporter inseriti l'eterocromatina sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi di controllo epigenetico in organismi modello. Tecnologie tra cui short hairpin RNA (shRNA) e cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) hanno permesso tali schermi in cellule di mammifero diploide. Qui descriviamo una schermata di shRNA su larga scala per regolatori di inattivazione del cromosoma x (XCI), utilizzando una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina bussò in al C-terminale di methyl CpG binding protein al 2 (MeCP2) gene sul cromosoma x inattivo (Xi). Riattivazione del costrutto nella linea cellulare reporter conferiti vantaggio di sopravvivenza sotto selezione igromicina B, consentendoci di schermo una biblioteca grande shRNA e identificare forcine che riattivato il reporter misurando il loro utilizzo di arricchimento post-selezione sequenziamento di nuova generazione. Le forcine arricchite poi sono state convalidate individualmente verificando la loro capacità di attivare il reporter di luciferase su Xi.

Introduzione

Uno le forme più comuni di danno mentale ereditario nelle femmine, la sindrome di Rett, è causato da mutazioni eterozigoti in MeCP2, un gene del cromosoma x che codifica per una proteina essenziale per la normale funzione di un neurone1. Un potenziale approccio per trattare questo disordine sarebbe riattivazione del selvaggio-tipo allele di MeCP2 su Xi, come ripristino dell'espressione di MeCP2 è stata indicata per invertire i deficit neurologici in un modello murino di questa malattia1, 2 , 4. Tuttavia, silenziamento epigenetico di uno dei due cromosomi in cellule femminili X sia strettamente mantenuto durante tutta la durata della vita di un organismo3,4, e robusta riattivazione di un gene di Xi probabilmente richiederebbe una maggiore rottura in più vie di regolazione epigenetiche.

Per identificare i fattori necessari per la manutenzione del silenziamento di MeCP2 , abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico che trasportano una fusione del gene MeCP2- luciferasi - igromicina resistenza (MeCP2-LUC-HR) su uno dei due cromosomi X (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Sebbene la MeCP2 espresso dal costrutto fusione ha dimostrato di essere instabile ed ha provocato una perdita di funzione, fenotipico che imita l'eliminazione MeCP2 nei maschi emizigoti (X/y diMeCP2-LUC-HR), l'espressione dei geni reporter era prontamente rilevabile in un modello costante con l'espressione endogena di MeCP25. Abbiamo quindi generato cloni dei fibroblasti immortalati con il costrutto sul cromosoma x attivo o inattivo e ha confermato che l'ex espresso wild type MeCP2 e non la costruzione del reporter; l'inverso è vero per quest'ultimo. Quando esposto ad un DNA demethylating agente conosciuto per abrogare il silenziamento genico, 5-azacitidina (5-AZA), cellule con il reporter su Xi ("cellule di reporter") guadagnato attività in un'analisi di bioluminescenza, che indica che il nostro costrutto potrebbe essere riattivato e quindi utilizzato per lo screening genetico.

Abbiamo sviluppato successivamente una schermata genetica ad alta produttività per regolatori del silenziamento di MeCP2 . La linea cellulare reporter in primo luogo è stata infettata con una libreria retrovirale contenenti > 60.000 diversi shRNA targeting > 25.000 geni in tutto il genoma del mouse5,6e quindi sottoposti a selezione igromicina B. Frequenza tornante è stata confrontata in pre- e post-selezione campioni mediante sequenziamento di nuova generazione, come reporter riattivazione conferiti vantaggio di crescita sotto igromicina B selezione e arricchimento di forcine responsabile ha provocato. Utilizzando questo approccio, abbiamo identificato 30 geni implicati in MeCP2 silenziamento e successivamente ha confermato i risultati transducing le cellule reporter con forcine individuali e misurando la loro attività luciferasica.

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Protocollo

Tutti i passaggi che coinvolgono animali sono stati effettuati utilizzando protocolli approvati dal Fred Hutchinson Cancer Research Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Non utilizzare reagenti utilizzati qui sono noti rischi significativi per la salute umana ad eccezione di 5-azacitidina (5-AZA).

1. generazione di una linea cellulare reporter con MeCP2- LUC-HR transgene su Xi

  1. Preparazione dei fibroblasti del tendine del mouse da una donna X/xMeCP2-LUC-HR MeCP2 mouse
    1. Eutanasia di un giorno di 10-12-vecchia femmina X/xMeCP2-LUC-HRMeCP2 mouse.
    2. Utilizzando le forbici dissezione dritto, praticare un'incisione circonferenza attraverso la pelle della parte prossimale della coda.
    3. Tenendo la carcassa vicino alla base della coda, tirare la pelle dal mouse per esporre la porzione fibrocartilaginous della coda. Togliere e tagliare il terminale 10 mm di tessuto esposto in 1 mm lunghi frammenti usando un bisturi chirurgico.
    4. Trasferimento al tessuto frammentato di una 15 mL conica tubo contenente 5 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con penicillina 1 U/mL, 1 µ g/mL di streptomicina e collagenasi di 1,5 mg/mL, pre-filtrata attraverso 0,45 µm e filtri a rete quindi 0,2 µm. Incubare per 3-4 h a 37 ° C con rotazione continua.
    5. Centrifugare il campione a temperatura ambiente a 500 x g per 10 min. Risospendere il pellet in 10 mL di DMEM completati con 10% siero bovino fetale, 1 U/mL di penicillina e 1 µ g/mL di streptomicina (DMEM-10) e piatto su una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Le cellule del passaggio una volta ed espandere un piatto di 10 cm prima di procedere al passaggio successivo.
    6. Immortalare le celle eseguendo una trasduzione con un vettore di espressione che trasportano oncogeni virali di HPV-16 (E6/E7), come descritto in precedenza7.
  2. Selezione dei cloni di singola cellula e caratterizzare l'espressione di MeCP2 reporter
    1. Raccogliere le cellule da un piatto di 10 cm. In primo luogo, i media di aspirare, aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% e incubare per 2-5 min a 37 ° C. Dissetare con 9 mL di DMEM-10 e raccogliere il sedimento cellule in una provetta conica da 15 mL.
    2. Diluire le cellule con DMEM-10 a una concentrazione finale di 1 cella/100 µ l. trasferire per piastre da 96 pozzetti pipettaggio 100 µ l della sospensione in ciascun pozzetto.
    3. Incubare a 37 ° C fino a quando i pozzi sono confluenti, che possono richiedere fino a 2-3 settimane. Sostituire il supporto con fresco DMEM-10 ogni 3-5 giorni. Quando confluenti, mobilitare le cellule con 20 µ l di tripsina-EDTA 0,05% per pozzetto e dividerli in due insiemi di duplicati di piastre da 96 pozzetti.
    4. Utilizzare un set di piastre di test per l'attività luciferasica. Utilizzare un kit di saggio di luciferasi firefly omogeneo che non richiede la rimozione di supporti. Seguire il protocollo incluso con il kit.
    5. Utilizzare i risultati del passaggio 1.2.4 per selezionare cloni con nessuna attività luciferasica rilevabile dal restante set di piastre. Espandere questi cloni a 24 pozzetti e poi 6-pozzetti di piastre.
    6. Eseguire la stessa cosa per un clone con il più alta attività di luciferase; Questo verrà utilizzato come controllo positivo per scopi di convalida.
    7. Raccogliere un'aliquota di ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti per un Western blot. Mobilitare le cellule con 200 µ l di tripsina-EDTA 0,05%. Incubare per 2-5 min a 37 ° C. Dissetare con 2 mL di DMEM-10 e trasferire la metà delle cellule in provetta per centrifuga da 1,5 ml. Lavare le cellule una volta con PBS prima di fare l'elettrolisi per Western blot. In alternativa, trasferire la metà delle cellule di un'altra piastra a 6 pozzetti. Quando le cellule si collega alla parte inferiore della piastra, risciacquare con PBS e lyse per Western blot.
    8. Eseguire un Western blot con anticorpi anti-MeCP2 per confermare che le cellule luciferasi-negativi esprimono, mentre le cellule luciferasi-positive non esprimono il selvaggio-tipo MeCP2 sul cromosoma di X attivo; seguire il protocollo descritto in precedenza8. Utilizzare tessuto cerebrale lisato da qualsiasi tipo di wild mouse come controllo positivo.
    9. Diversi cloni negativi a 2 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti della piastra. Trattare una volta con 10 µM 5-AZA, incubare per 72 h senza cambiare i mezzi di comunicazione e di analisi per l'attività luciferasica come descritto al punto 1.2.3.
    10. Scegliere un clone negativo (clone di Xi) che ha guadagnato l'attività luciferasica con 5-AZA e inizia espandendo e a piastre multiple di 10 cm. Congelare i cloni negativi rimanenti in azoto liquido come una copia di backup. Il clone positivo (clone di Xa) può essere mantenuto nella coltura del tessuto o congelato fino al successivo utilizzo.

2. la biblioteca di riattivazione utilizzando igromicina B selezione di screening

  1. Infettare il clone di prova, applicando la selezione e la raccolta del DNA per il sequenziamento
    1. Ottenere concentrati virale di retrovirali esprimendo forcine da una libreria di shRNA oppure produrre concentrata surnatante virale utilizzando il protocollo incluso con la libreria desiderata.
    2. Prima di procedere con lo schermo, titolare della libreria (utilizzando un marcatore GFP, se disponibile). Obiettivo per una molteplicità di infezione tra 0,3 e 0,5.
      Nota: Eseguire almeno quattro schermi indipendenti per ridurre al minimo i falsi positivi. Utilizzare 20 piastre per schermo per ottenere 100 volte copertura della biblioteca per mantenere un'adeguata rappresentanza di forcine ed evitare forcellini casuale9. Tuttavia, data la schermata di selezione positiva e una dimensione di grande biblioteca, è probabile che sarebbe sufficiente una copertura inferiore.
    3. Al mattino, piastra 1 x 106 cellule Xi sulle piastre di coltura del tessuto di 10 cm.
    4. Nel pomeriggio, infettare le piastre sostituendo i media con DMEM-10 fresco contenente surnatante virale e 5-10 µ g/mL di polybrene. Utilizzare la quantità del surnatante virale determinato al punto 2.1.2.
    5. Dopo 18-24 h, aspirare i media e aggiungere 10 mL di fresco DMEM-10 per ogni piatto. Cultura per altri 48 h.
    6. Al mattino, a mobilitare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% per piastra e dissetare con 9 mL di DMEM-10 per piastra. Eseguire la sospensione attraverso un filtro a rete 100 µm. Riunire le sospensioni filtrate e due set di piastre di 10 cm a 1 x 106 cellule/piastra di semi.
    7. Nel pomeriggio, è possibile sostituire il supporto in un unico set di piastre con DMEM-10 contenente 15 µ g/mL di igromicina B (giorno 0). In altro set, sostituire il supporto con fresco DMEM-10 solo.
    8. Dopo 48 ore, mobilitare le cellule non trattate set di piastre con 1 ml di tripsina-EDTA 0,05%. Incubare per 2-5 min a 37 ° C. Dissetare con 9 mL di DMEM-10. Trasferire le cellule alle provette coniche da 15 ml e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare i sovranatante e procedere immediatamente con l'estrazione del DNA dai pellet. In alternativa, la piscina le cellule nelle più grandi provette prima della fase di centrifugazione.
    9. Estrazione del DNA usando una miscela di fenolo e chroroform e precipitare il DNA con etanolo freddo e acetato di sodio come descritto in precedenza10. I campioni di DNA di pre-selezione individuali della piscina e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
    10. Continuare la coltura igromicina B gruppo di selezione per 4 giorni. Reintegrare i media di selezione con fresco DMEM-10 contenente igromicina B dopo 2 giorni.
    11. Il giorno 7, è necessario sostituire il supporto di selezione con fresco DMEM-10 solo. Consentire 2-4 giorni per il recupero e quindi raccogliere le celle come descritto nel passaggio 2.1.8. Procedere con l'estrazione del DNA come descritto nel passaggio 2.1.9.
  2. Identificazione di forcine arricchite nei campioni post-selezione
    1. Contesto di utilizzo 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') e 3' invertire il ciclo primer (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') per amplificare la metà-forcine dai campioni del DNA pre- e post-selezione. Uso tutte le estratto il DNA in reazioni di PCR separate con 100-200 ng di DNA per reazione.
      Nota: Questi contesto primer di 5' e 3' ciclo inverso primer corrispondono alla sequenza di miR-30 contesto a monte dell'inserto shRNA e la sequenza del ciclo di shRNA, rispettivamente. Diverse biblioteche richiederà i oligos differenti. Regolare le fasi di purificazione per isolare le diverse dimensioni del prodotto come necessario.
    2. Perline di dimensione-selezione uso per rimuovere gli iniettori e il DNA genomico e recuperare i prodotti di PCR tra 100 e 200 BP. seguono il protocollo incluso con le perline.
    3. Preparare una libreria di sequenziamento per sequenziare le metà-forcine. Generare letture almeno 50 milioni per ogni schermo. Seguire il protocollo appropriato per il sequenziamento kit e attrezzature.
      Nota: letture 50 milioni al schermo fornisce volta 1000 rappresentazione di ogni shRNA nella libreria e circa 10 volte copertura di ogni infezione indipendente (effettuato alle 100 volte rappresentazione di ogni shRNA), che garantisce un'adeguata rappresentanza di ogni evento di infezione.
    4. Enumerare ogni shRNA utilizzando uno script Perl che conta sequenze con partite perfetto. Ha scelto shRNA che aveva letto almeno 10 volte nel pool di preselezione per ulteriore analisi. Calcolare gli arricchimenti come rapporti di post-a preselezione conta e determinare il tasso di falsi scoperta (FDR) sulla base di 1000 permutazioni. Ha scelto di geni bersaglio di shRNA con < 5% FDR come "colpisce" per ulteriori test.

3. convalida le forcine identificate ("hits")

  1. Lentivirus imballaggi contenenti shRNA identificato nella schermata
    1. Seme 8 x 106 FT 293 cellule per piastra sulle piastre di 10 cm.
    2. Il giorno seguente, sostituire il supporto con 9 mL di antibiotico-libero DMEM-10 per piastra; fare questo 30 minuti prima di transfezione.
    3. Durante l'intervallo di 30 minuti, preparare due miscele per la transfezione:
      1. Preparare il Mix 1 (a piastra/shRNA; aumentare il secondo il numero totale di shRNA): 10 µ l di 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) in 0,5 mL di multimediale essenziale minimo ottimale. Mescolare pipettando e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      2. Preparare 2 Mix (per shRNA): 4 µ g del vettore shRNA da confezionare, 1,5 µ g del vettore busta VSV-G (pMD2.G) e 2,5 µ g del vettore (psPAX2), imballaggi misti in 0,5 mL di multimediale essenziale minimo ottimale.
        Nota: Include un vettore lentivirale vuoto nell'imballaggio da utilizzare nelle successive infezioni come controllo negativo.
    4. Aggiungere 0,5 mL di miscela 1 ad ogni aliquota di mix 2 e mescolare delicatamente pipettando. Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min.
    5. Applicare la miscela su ogni piatto da passo 3.1.2 in modo goccia a goccia; Agitare la piastra delicatamente per mescolare.
    6. Il giorno seguente, sostituire il supporto con 5 mL di fresco DMEM-10.
    7. 48 ore dopo la trasfezione iniziale, raccogliere il surnatante e correre attraverso un filtro da 0,22 µm. Pre-bagnato il filtro con DMEM-10 per massimizzare il recupero.
    8. Aliquota del surnatante filtrato in quantità ideale per infettare una piastra a 6 pozzetti bene.
    9. Congelare le aliquote a-80 ° C per un uso successivo, o procedere immediatamente con trasduzione.
  2. Trasduzione e test di singole forcine per riattivazione del reporter di luciferase e riattivazione del gene MeCP2 selvaggio-tipo il Xi.
    1. Al mattino, piastra 1 x 105 Xi cellule/pozzetto su 6 piatti ben.
    2. Nel pomeriggio, infettare le piastre sostituendo i media con 2 mL di fresco DMEM-10 contenente lentivirali surnatante e 5-10 µ g/mL di polybrene. Infettare un controllo bene con surnatante virale prodotta da un vettore lentivirale vuoto.
    3. Il giorno seguente, sostituire il supporto con 2 mL di con puromicina DMEM-10 contenente 1 mg/mL. Cultura per quattro giorni.
    4. Sostituire il supporto con 2 mL di fresco DMEM-10 e consentire di 48-72 h per il recupero.
    5. Mobilitare le cellule con 150 µ l di 0.05% tripsina-EDTA. Incubare per 2-5 min a 37 ° C. Dissetare con 1,5 mL di DMEM-10. Trasferire le cellule alle provette coniche da 15 ml e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il supporto e risospendere le cellule in 100 µ l di tampone di lisi fornito nel kit di saggio di luciferasi. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Trasferire i lisati in un bianco piastra a 96 pozzetti e analisi per l'attività luciferasica utilizzando il protocollo incluso con il kit. Utilizzare le celle Xa come Xi cellule infettate con un vettore lentivirale vuoto come controllo negativo e un controllo positivo.
      Nota: Evitare di esporre le piastre bianche a luce fluorescente prima del dosaggio; Questo ridurrà lo sfondo e aumentare la sensibilità del test. Il protocollo fornito nel kit di dosaggio è stato trovato per essere più efficaci se eseguiti al buio quando possibile.
    7. Per determinare se il tornante ha avuto un effetto sul livello di espressione di MeCP2 sul cromosoma x attivo, isolare RNA da cellule Xi trasdotti e misurare il livello di mRNA di MeCP2 mediante PCR quantitativa con primer disegnati per amplificare solo wild-type MeCP2 (f: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. Opzionale: Aumentare la sensibilità del dosaggio con l'aggiunta di 5-AZA a una concentrazione finale di 0,2 µM, dopo che le cellule hanno recuperato dalla selezione con puromicina. Coltura delle cellule per 72 h senza sostituire i media e quindi analizzare per l'attività luciferasica utilizzando il kit di saggio di luciferasi commerciale.
    9. Misurare la riattivazione del MeCP2 di selvaggio-tipo silenziato. Infettare cellule Xa, che porto il tipo selvaggio MeCP2 su Xi, con il vettore che contiene singoli forcine, seguendo i passi di protocollo 3.2.1. -3.2.4. Isolare il RNA da cellule e misurare il livello di mRNA di MeCP2 mediante PCR quantitativa con primer disegnati per amplificare solo wild-type MeCP2 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r.: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

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Risultati

Fibroblasti di topo del tendine sono state raccolte da un precedentemente descritto X/xMeCP2-LUC-HRmouse femminileMeCP2 , immortalata da trasduzione retrovirale degli oncogeni E6 ed E7 di HPV-16 virus7, clonate mediante diluizione limitante e testato per l'attività luciferasica ed espressione della proteina MeCP2 selvaggio-tipo (Figura 1A e 1B). L'attività luciferasica era robusto, se il giornalista era XA e non rilevabile se il Xi; l'espressione di M...

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Discussione

Nel nostro recente studio6, abbiamo generato una linea cellulare murina con luciferasi e geni di resistenza igromicina fusa per MeCP2 su Xi ed esso trasdotte con una libreria di > 60.000 shRNA targeting > 25.000 geni. Abbiamo trovato 30 geni cui vantaggio di sopravvivenza hanno conferito colpo sotto selezione igromicina B, suggerendo loro ruolo nel controllo di MeCP2 e silenziamento del x-cromosoma. Questi risultati sono stati convalidati trasdurre la linea cellulare segnalati co...

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Divulgazioni

Dr. Leko ha contribuito a questo articolo come un dipendente del Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Le opinioni espresse sono proprie e non rappresentano necessariamente le opinioni di National Institutes of Health o di governo degli Stati Uniti

Riconoscimenti

Grazie Ross Dickins dell'Università di Melbourne per fornire gentilmente la libreria di shRNA utilizzata nella schermata. Questo lavoro è stato finanziato da Rett sindrome Research Trust (A.B.).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
293FT Cell LineInvitrogenR700-07
5-AzacytidineSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
Anti-MECP2 antibodyMillipore07-013
CollagenaseSigmaC2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene MicroplatesFisher Scientific07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)Open BiosystemsEAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir libraryOpen BiosystemsRMM3796
Fetal Bovine SerumFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY–401–2501Or equivalent
Hygromycin BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2610Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay SystemPromegaE4530Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXTPerkin ElmerN/AOr similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2IlluminaMS-102-2001Use kit compatible with your equipment
Opti-MEMGibco31985-070
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259VSV-G envelope vector
PolybreneSigmaTR-1003-G
PolyethyleniminePolysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260Packaging vector
PuromycinGibcoA11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300-054

Riferimenti

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  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
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  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

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