马达加斯加嘘声蟑螂作为非哺乳动物的替代动物模型来研究毒力、致病机制和药效

摘要

我们提出了一项协议, 利用马达加斯加嘶咝蟑螂作为替代哺乳动物模型, 以进行细菌的毒力, 发病机制, 药物毒性, 药物功效, 和先天免疫反应研究。

摘要

在哺乳动物和昆虫之间, 先天免疫的许多方面都是守恒的。一只昆虫, 马达加斯加咝嘶蟑螂从Gromphadorhina,可以作为一个替代动物模型, 研究的毒力, 宿主-病原体相互作用, 先天免疫反应, 和药物的功效。提供的细节为饲养, 关心和饲养的嘘声蟑螂。我们还说明了它如何感染细菌, 如胞内病原体霍尔德鼻疽, b. 鼻疽和 b. thailandensis。使用嘶咝的蟑螂是不贵的, 并克服了在研究中使用哺乳动物的管理问题。此外, 使用嘶咝蟑螂模型发现的结果是可重现的, 类似于使用哺乳动物模型获得。因此, 马达加斯加的嘘声蟑螂代表了一个有吸引力的代理主机, 应该探索时进行动物研究。

引言

近年来, 利用昆虫作为替代哺乳动物模型来研究细菌病机和先天宿主防御的作用已经越来越强劲。从后勤上来说, 这是由于他们相对低廉的成本和容易获得, 处理和照顾昆虫与哺乳动物相比。此外, 亦没有规管在研究中使用昆虫的政策;它不受任何动物使用委员会或政府机构规定的权限或限制的约束。昆虫作为替代动物模型特别适合于对毒力因子、宿主-病原体相互作用以及抗微生物药物功效的评估进行全面筛选研究。它们的使用可以减少用于研究的哺乳动物的数量从而克服动物实验行为所固有的一些伦理难题^1,2。

昆虫可以充当替代宿主, 因为昆虫和哺乳动物的先天免疫系统之间有高度的共同性^1,3。昆虫 plasmatocytes 和哺乳动物巨噬细胞吞噬微生物⁴。与中性粒细胞的昆虫对应的是血^5,6。昆虫和哺乳动物细胞的胞内氧化爆裂通路相似;活性氧在这两种生产的同源 p47^phox和 p67^phox蛋白质⁵。在昆虫和 toll 样受体和 Interleukin-1 中, 在哺乳动物的收费受体下游的信号瀑布也非常相似;这两种结果都产生抗菌肽, 如防御⁷。因此, 昆虫可以用来研究一般的先天免疫机制, 共享的后生。

一种名叫马达加斯加的昆虫, 来自于Gromphadorhina,是现存最大的蟑螂物种之一, 在成熟时通常达到5到8厘米。它只原产于马达加斯加的岛屿, 其特征是发出咝嘶声--发出嘶咝的蟑螂通过呼吸口排出空气的声音, 称为气孔⁸。独特的嘘声充当一种社会通信的形式在嘶咝的蟑螂之间为求爱和攻击⁹ , 并且可以听见 , 当一个男性在它的栖所扰。与美国蟑螂和其他城市害虫相比, 马达加斯加的嘶咝蟑螂的移动速度很慢。它是容易照料和养殖;一只怀孕的臭蟑螂每次能生20到30个孩子。一只名叫若虫的婴儿, 在经历 6 molts 后的5月内达到性成熟, 并且在野外和圈养的5年中都可以存活⁸。

我们已利用马达加斯加嘶咝蟑螂作为代理主机感染与胞内病原体霍尔德鼻疽, b. 鼻疽, 和B. thailandensis ^10,11.这些病原体的毒力与它们的毒力相比, 在霍尔德的基准动物模型, 叙利亚仓鼠。我们发现, 50% 致命剂量 (LD₅₀) 的b. 鼻疽和b. 鼻疽在两个模型中都是相似的¹¹。有趣的是, B. thailandensis,虽然无毒在啮齿目动物模型中, 是致命的在嘶咝蟑螂¹¹。与B. thailandensis感染有关的这种差异突出说明了嘶咝蟑螂模型的效用;B. thailandensis衰减突变体可以更容易地解决在嘶咝蟑螂比啮齿动物模型。此外, 由于b. thailandensis通常用作b. 鼻疽和b. 鼻疽 ^10、12、13的模型有机体, 因此可以识别衰减突变。在其毒性更强的亲属中导致类似的目标。

尽管thailandensis的毒力与叙利亚仓鼠的毒性不同, 但在严重毒力因子, 如6型分泌 system-1 (T6SS-1) 的突变, 在b. 鼻疽和B. 鼻疽, 同样为 B. thailandensis ¹¹而衰减。在该 T6SS 突变体 (T6SS-2 到 T6SS-6), 在B. 鼻疽中, 对叙利亚仓鼠的毒力没有任何影响, 在嘶蟑螂¹¹中仍然有剧毒。因此, 嘶咝蟑螂是一个可行的替代动物模型为三霍尔德物种。最近, 我们利用嘶咝蟑螂作为替代动物模型, 研究抗疟药物氯喹 (CLQ) 对霍尔德感染¹⁰的有效性及其毒性。

在这里, 我们描述的饲养和照顾的马达加斯加嘶咝蟑螂, 并提供有关如何感染这种昆虫与三霍尔德物种的细节。此外, 我们说明, 嘶咝蟑螂是一个可行的替代模型, 研究毒力和药物的有效性, 在霍尔德感染, 它可能也可以作为替代宿主的其他细菌病原体在类似的研究。

研究方案

1. 为维持一只嘘蟑螂蚁群作准备

1. 准备笼子里的嘶咝蟑螂住。应用一层薄薄的石油果冻, 大约20到30毫米宽, 到靠近笼子顶部的内壁的圆周, 以防止嘶咝的蟑螂从笼中爬出并逃逸。
   注: 嘶咝的蟑螂可以安置在有大面积、足够高、有盖子的各种容器中。使用鼠标笼 (〜43厘米 x 23 厘米 x 20 厘米)。对于运往37° c 的笼子, 不要使用凡士林。
2. 在笼子里放一把纸板蛋纸盒, 为自然害羞的昆虫提供一个藏身之处。不要用聚苯乙烯泡沫塑料制成的纸板鸡蛋纸盒来代替塑料的摄入。
3. 不要提供床上用品, 以便于清理和增加新孵出的若虫的能见度。
4. 获得含有20% 粗蛋白成分的干狗粮。用食品加工机或搅拌机粗略研磨狗粮, 贮存在4° c。
5. 获得一些浅菜和水族馆的石头或海绵的食物和水。
   注意: 培养皿是推荐的。

2. 嘘声蟑螂关心和饲养

1. 从一个商业化的饲养员那里获得 outbred 马达加斯加的嘘声蟑螂 (约5厘米)。此协议中使用的物种是Gromphadorhina 金樱子。在收到后立即解包含有嘶咝蟑螂的装运箱。
2. 遵循适当的机构准则, 在处理动物时使用个人防护设备。
   注: 使用厚重的一次性手套来处理蟑螂, 因为蟑螂的跗爪锋利。
3. 每大笼可转移多达75只大的咝嘶声蟑螂 (> 3 厘米)。将新孵出的和较小的若虫 (< 3 厘米) 转移到一个单独的笼子里。
   注: 每只老鼠笼中有超过75只大的嘶咝蟑螂, 可能导致蜂群健康恶化, 也可能导致死亡。
4. 处理一个新的蟾蟑螂, 这是白色的颜色, 轻轻地, 避免挤压它。另外, 在处理前允许外骨骼变暗和硬化。
   注意: 没有必要去除螨, Gromphadorholaelaps schaeferi, , 通常伴随着嘶咝蟑螂收到育种者。有益的螨保持嘘声蟑螂清洁和对人类无害。
5. 一周或两次在浅盘中用地面干狗粮喂嘶蟑螂。提供足够的狗粮, 以确保在下一次喂食之前, 嘶嘶叫的蟑螂有足够的食物。丢弃任何已变湿和发霉的食物。
6. 除了狗食外, 还提供切的水果和蔬菜, 如苹果、马铃薯或生菜, 在浅盘中。丢弃发霉或腐烂的食物。
7. 在浅盘中每周提供一两次饮用水, 但不要溢, 以防在笼子里溅出水。将小鱼缸石或海绵放在盘子里, 为小仙女提供一个着陆垫。使用反渗透水, 如果可用。
8. 在温度范围从21° c 到30° c 时, 在黑暗中保持嘶咝蟑螂。在较低温度 (〜21° c) 下, 留出大的嘘蟑螂, 用于试验2月, 以减少繁殖和怀孕。相反, 保持若虫在更高的温度 (28 ° c 到30° c) 加速成长。
   注: 在室温下 (21 ° c) 在黑暗的柜子里保持笼子。
9. 如果在孵化箱里放有嘶咝的蟑螂, 可以通过包括一个单独的水锅来提供湿度。
10. 定期舀出干粪便, 或每2至3周将嘶咝的蟑螂转移到干净的笼子, 以清洁笼子。保持笼底干燥。如果允许过量的水积聚并与笼底的粪便混合, 立即清洁笼子。

3. 蟑螂的实验准备

1. 在一项驯化实验之前, 把适当数量的嘶咝蟑螂在笼子里的37° c 的湿式孵化箱中1到3周。包括用于注入的控制组。这种驯化期对于避免实验过程中的温度冲击是至关重要的。
2. 不要把凡士林放在37° c 的笼子里, 因为温度越高, 果冻就会融化。
3. 每隔1至2天, 检查嘶咝蟑螂, 更换食物和水, 清洁笼子。
4. 获得明确的一次性塑料食品容器和盖子, 用于在实验中对嘶咝的蟑螂进行分组。对于通风, 在盖子或容器的侧面打孔用钉子和锤子。
   注: 在生物安全等级3的设置中, 使用螺丝盖容器。如有必要, 可以用胶带加固止动盖容器。
5. 在注射的当天, 将6至12只水土不服的蟑螂放入每个容器中, 确保按性别和身体质量分配相等的数量。
6. 确定个别的嘘声蟑螂的性别。确定性别的突出角发现男性和缺乏女性。
7. 称其为单独的嘶声蟑螂。为了方便在天平上的一只嘶咝的蟑螂称量, 将它放在两艘已 tared 的重量船内。
   注意: 为了在实验之间保持一致, 使用4到8克的嘶咝蟑螂。然而, 在小 (1.5 至2克) 和大 (6 至8克) 嘶咝蟑螂之间发现感染后的生存没有差异。对于药物研究, 使用重量为5克的嘶咝蟑螂, 以获得更一致的每体质量的药物浓度。
8. 代替水盘, 包括高含水量水果或蔬菜, 如一片苹果或马铃薯。丢弃腐烂的食物。不要提供额外的水来保持容器干燥。
9. 直到注射到37° c 为止

4. 细菌培养和制剂

注: 本协议中使用的细菌种类为b. 鼻疽、b. 鼻疽和 b. thailandensis.所有使用b. 鼻疽和b. 鼻疽的操作必须在安全级别 (BSL) 3 实验室中的第二类或第三类生物安全柜中执行。在位于 BSL2 或 BSL3 实验室的类似生物安全柜中执行与B. thailandensis的操作。遵循 BSL3 工作的制度标准操作程序。在处理细菌时, 遵循使用个人防护设备的机构指南。

1. 在感染前至少3天准备霍尔德的主控板。使用 Luria Bertani (蓝诺克斯) (lb) 琼脂为b. 鼻疽或b. thailandensis , 并使用磅琼脂补充4% 甘油为B. 鼻疽。25% 甘油储存在-80 ° c 时的条纹细菌。
   注: 总板直接从冷冻甘油库存条纹;避免细菌从板到板的连续通道, 因为这可能会导致毒性降低.
2. 接种10至20毫升 LB 肉汤与几个殖民地的b. 鼻疽或b. thailandensis从主板。同样接种 LB 肉汤, 并辅以4% 甘油, 用于B. 鼻疽。
3. 摇肉汤文化在175到 250 rpm 在37° c 为〜 18 h。
4. 离心机2到3毫升的文化在 5000 x g 为10分钟。
5. 在无菌磷酸缓冲盐水中丢弃上清和重细菌颗粒 (PBS, 137 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10 mm Na₂PO₄, 1.8 mm,₂PO₄, pH 7.4)。
6. 用 PBS 稀释细菌以达到0.5 的光学密度 (OD), 在分光光度计中以 600 nm 的光度测量。
7. 连续稀释细菌十倍的 PBS 从开始 OD 0.5。使用这些悬浮液感染。
8. 通过琼脂培养基上100µL 等分的连续稀释和电镀, 确定接种的菌落形成单元 (CFU)。孵育板在37° c 为24到 48 h。

5. 药物制剂

1. 确定适当数量的药物, 以每体质量。CLQ 的剂量给嘶咝蟑螂是基于标准剂量的哺乳动物, 这是50毫克/公斤/天。
2. 重或稀释车辆的利息。例如, 在 PBS 中稀释 CLQ 浓度为12毫克/毫升。这种浓度提供了300µg 的药物到一个〜6克嘘蟑螂在25µL 注射量。
3. 如有必要, 通过0.22 µm 注射器过滤器对药物溶液进行消毒。
4. 将药物溶液贮存在4° c 直至使用。将药物溶液加热到至少21° c (室温) 注射前。

6. 喷油器的装配

1. 通过在重复吸管上旋转调整螺钉, 将指针设置为所需的音量 (25 µL)。
2. 将重复吸管的释放杆向内推, 向外拉推。重复的吸管现在已经准备好容纳一个装有注射器。
   注: 通过测量在天平上喷出的水量来校准重复吸管排出的体积。
3. 用含有细菌或药物的悬浮液填充1毫升注射器。
4. 将注射器连接到无菌26或27克 x ½英寸 (或更短) 的针头。
5. 轻敲注射器, 将气泡浮到顶部, 并将气泡和悬浮液放入装有10% 漂白剂的容器中。
6. 将注射器放在重复吸管的注射器夹上, 针锥朝上。
7. 向外拉出释放条, 然后按下 "分配器" 按钮, 在装满10% 漂白剂的容器中执行空白注射, 直到注射器柱塞与推器对中。
8. 执行1或2额外的空白注射, 以确保液体被逐出注射器。重复的吸管已经准备好注射了。

7. 蟑螂注射液

1. 使用机构推荐的个人防护设备, 在 BSL2 或 BSL3 设置的第二类或第三类生物安全柜中执行所有蟑螂注射。
2. 清洁的工作表面在安全柜, 可能会接触到嘶咝的蟑螂。使用10% 漂白剂和70% 乙醇去除残留的漂白剂。允许表面风干。
3. 用一只手, 握住嘶咝蟑螂的一侧。固定一个嘶咝的蟑螂, 使它无法在注射时反冲。轻微地弯曲嘶声蟑螂, 使腹部 terga 之间的皮肤膜暴露。
4. 另一方面, 持有重复的吸管, 使针是在一个0°到30°的角度从背腹中线的嘶咝蟑螂。刺穿 3^rd、4^th或 5^th剃的皮肤膜, 从后端。
   注: 针进入咝嘶的蟑螂的角度表明, 确保针不经过和退出的嘘声蟑螂。注射部位确保喷射出的物质包含在充满血淋巴的腹腔内。在用活细菌或药物进行注射之前, 练习拿起嘶咝的蟑螂并注入水。
5. 用力按下分配按钮以注入音量。用相同的角度轻轻地取出针, 用于进入。
6. 在一个单独的容器中放置注射过的嘶咝蟑螂, 以区别它与尚未注射的嘶咝蟑螂。清除注射部位可能渗出的血淋巴。
7. 使用相同的注射器和针头继续在一个组内注射其他的嘶咝蟑螂。在注射器柱塞到达桶底前停止注射, 以防止最后一次注射中的不完全剂量。
8. 在一个单一的嘘声蟑螂, 如那些与细菌和药物的多注射, 注射在不同的一侧的一个剃的背侧嘶咝蟑螂。或者, 通过注入不同的 terga (3^rd到 5^th) 执行多次注射。
9. 确保容器的盖子牢固地被紧固。必要时用胶带加固眼睑。
10. 在一个湿润的37° c 孵化箱里孵化嘶咝的蟑螂。

8. 记录嘶咝蟑螂的发病率和死亡率

1. 在二级或 III 级生物安全柜内进行所有嘶咝蟑螂检查, 并提供机构推荐的个人防护设备。在安全柜中用10% 漂白剂清洁表面, 然后用70% 乙醇。允许工作区域风干。
2. 使用发病率评分表 (表 1) 在1到2周内每天进行一次或两次的嘘蟑螂评分。
3. 从容器中取出死嘶咝的蟑螂, 记录幸存者的数量。
4. 如果容器的底部积聚了过量的水分, 则将剩余的活嘶蟑螂转移到一个干净的容器中。或者, 使用一次性纸巾擦拭多余的水分。
5. 每天更换腐烂的食物, 并将嘶咝的蟑螂返回湿37° c 恒温箱。
6. 在研究结束时, 将剩余的幸存者放在一个生物危害袋中, 并在-80 ° c 安乐。
7. 统计分析数据¹⁴以确定 LD₅₀和卡普兰-梅尔和日志秩分析的生存。和所有的昆虫实验一样, 控制组可能会发生一些死亡。这些死亡归因于昆虫的自然死亡¹⁵。有关如何在控制组中解释死亡的详细讨论, 请参阅参考¹⁵。

结果

本节说明了当马达加斯加的蟑螂被b. 鼻疽、b. 鼻疽、或b thailandensis感染时所取得的结果;结果表明, 该昆虫是一种适合于不同种类的霍尔德的动物模型, 用于研究毒力、药物毒性和细菌感染的药效。在感染了减毒突变体 (Δhcp1) 的组中, 比在感染野生b 鼻疽K96243、父母b . 鼻疽 SR1 或b. thailandensis DW503 (图 1)。反...

讨论

最佳的实验条件始于一个健康的嘶咝蟑螂殖民地, 这需要一个最小的, 但一致的时间承诺。虽然嘶咝的蟑螂可以在一段较长的时间 (〜周) 没有食物和水, 每周或双周的笼子维护必须提供。这包括检查食物和水的供应, 确保笼子是干的。在高温的驯化和孵化过程中, 保持干燥的生活条件尤为重要;我们发现, 更多的嘘声蟑螂死亡, 并在更高的速度在较高的温度下, 容器没有每天清洗。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madagascar hissing cockroach	Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC	143668
Kibbles n Bits, any flavor	Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA	UPC #079100519378
Snap on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7F71RETCHIL
Screw on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7J0000TCHIL
Tridak STEPPER series repetitive pipette	Dymax Corporation www.dymax.com	T15469
Syringe (1 mL)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	309659
Needle (26 or 27G x 1/2)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	305109, 305111
Chloroquine diphosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	C6628
Phosphate buffered saline	Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD	10010023
Difco Luria- Bertani (Lennox)	Becton Dickinson, Sparks, MD	240230
Agar	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1296
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G6279