使用 DMAv为环境应用 DMMTAv和 DMDTAv的准备: 合成、纯化和确认

摘要

本文介绍了 dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTA^v) 和 dimethyldithioarsinic 酸 (DMDTA^v) 合成、诱导 dimethylarsinic 酸 (dma^v) thiolation 通过混合 DMA^{v 的改进实验协议。}, Na₂S, 和 H₂, 所以₄。修改后的协议提供了实验指导, 从而克服了在定量分析过程中可能导致实验失败的综合步骤的局限性。

摘要

Dimethylated thioarsenicals, 如 dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTA^V) 和 dimethyldithioarsinic 酸 (DMDTA^v), 是由 dimethylarsinic 酸 (DMA^V) thiolation 的新陈代谢途径产生的, 最近在环境和人体器官中发现的。DMMTA^v和 DMDTA^v可以量化, 以确定 dimethylated thioarsenicals 的生态效应及其在环境介质中的稳定性。这些化合物的合成方法是原始社会的, 使得复制以前的研究具有挑战性。此外, 缺乏关于储存技术的信息, 包括没有物种转化的化合物的储存。此外, 由于只有有限的合成方法信息, 在合成标准化学品和进行定量分析方面可能存在实验困难。本文提出的协议为 dimethylated thioarsenicals、DMMTA^v和 DMDTA^v提供了一个实际改进的合成方法, 并将有助于利用高性能液体进行物种分离分析的量化。用电感耦合等离子体质谱 (HPLC-ICP) 相结合的色谱法。通过对化学试剂的制备、过滤方法和贮存的研究, 对该过程的实验步骤进行了改进。

引言

由于 dimethylarsinic 酸 (DMA^V) 已被证明表现出急性毒性和遗传毒性由于正在接受甲基化和 thiolation 在摄取^1,2, 砷 thiolation 的代谢途径有深入研究了体外和体内^3,4以及环境介质 (例如,垃圾渗滤液)^5,6。以前的研究在活细胞中发现了 DMA^V的减少和 thiolated 类似物, 例如、 dimethylarsinous 酸 (DMA^III)、dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTA^V) 和 dimethyldithioarsinic 酸 (DMDTA^V)^7,8,9, 与 dimethylated thioarsenicals 如 DMMTA^V显示更大的毒性比其他已知的无机或有机砷¹⁰。高毒性 thioarsenicals 的丰度具有严重的环境影响, 因为它们在高度 sulfidic 条件下可能对人类和环境构成风险¹¹。然而, DMMTA^v和 DMDTA^v (横贯) 形成的机制及其在环境媒体中的命运仍然需要进一步研究。因此, 需要对 thioarsenicals 进行定量分析, 以提高对 DMMTA^v和 DMDTA^v的环境影响的理解。

虽然标准化学品是定量分析的关键要求, 但由于物种转化为其他物种的风险很高, DMMTA^v和 DMDTA^v的标准很难通过复制以前的研究获得。原始社会合成过程¹²。此外, 所提到的方法有局限性, 可能会导致在合成标准化学品和进行定量分析的实际困难。DMMTA^v和 DMDTA^v通常是通过 dma^{v 2}的解决方案混合 dma^v、Na₂和 H₂, 所以₄在某摩尔比率¹或冒泡 H₁₃₁₄的气体中进行的。冒泡方法使用 H₂S 气体的直接供应, 以硫磺代替氧气, 这是剧毒和难以控制的经验不足的用户。相反, 上述混合方法¹, 广泛用于定性分析 DMMTA^v和 DMDTA^V在环境研究^5,6,12, 功能 thiolation使用 H₂生成的 DMA^V由混合 Na₂s 和 H₂, 因此₄和生产 DMMTA^v和 DMDTA^v, 允许更容易的化学计量控制生产目标化学品, 与直接使用 H₂的气体。

参考混合方法过程^1,3,4,8,15在本研究中提到的一些关键实验步骤的局限性, 这可能导致实验失败。例如, 具体溶剂的详细情况 (即,去离子水) 的制备和合成砷的提取和结晶是过于缩写或没有充分详细说明。有关程序性步骤的这种分散和有限的信息可能导致 thioarsenicals 的不一致形成和不可靠的量化分析。因此, 本文所开发的修改后的协议描述了 DMMTA^v和 DMDTA^v库存解决方案的合成, 并进行了定量的物种分离分析。

研究方案

1. DMMTA 的合成^V

1. 化学制剂和摩尔比混合 DMA^V, Na₂S, 和 H₂, 所以₄
   注意: DMA^V: Na₂S: H₂所以₄ = 1:1. 6:1. 6
   1. 将 5.24 g 的 DMA^V溶解在40毫升去离子和 N₂中 (在50毫升离心管中清洗至少30分钟) 水。
   2. 通过溶解14.41 克 na₂S·9H₂O 在50毫升去离子和 N₂-被清洗的水在250毫升瓶中, 准备 na₂S 试剂。
   3. 准备 H₂, 以便₄试剂通过在40毫升离心管中添加3.3 毫升的浓硫酸 (96%) 至2毫升去离子和 N₅₀清除水。
      注意:DMA 的最终摩尔比率^V: Na₂S: H₂所以₄ = 1:1. 6:1. 6 ^13,4,8,15。
   4. 将已准备好的40毫升 DMA^V解决方案 (步骤 1.1.1) 添加到250毫升烧瓶 (步骤 1.1.2) 中包含的 Na₂S 解决方案的50毫升。冲洗包含 DMA^V的10毫升清洗水的管, 并将其添加到250毫升烧瓶中。
   5. 用装有玻璃管的三孔橡胶塞子关闭烧瓶。分别使用用于 N₂气体流入、流出和 H₂的玻璃管, 因此₄解决方案入口。关闭烧瓶后立即, 允许 N₂气体流入烧瓶中。
      注: 应保持气体压力, 以在反应溶液表面流动而不飞溅。
   6. 将耐酸油管连接到 H₂的玻璃管, 使₄溶液入口与50毫升注射器一起添加准备好的40毫升的 h₂, 因此₄解决方案 (步骤 1.1.3)。添加40毫升的 H₂, 所以₄解决方案, 慢慢地和逐步地。
      警告:加入硫酸后, 会产生白烟;使用通风良好的油烟罩。
   7. 定期添加硫酸时, 监测反应混合物在烧瓶中的颜色变化。保持间隔为 4-5 毫升的 H₂, 因此₄;混合物应该是一个白色的多云溶液。
      注: 由于浓硫酸的快速添加, 瞬时黄沉淀可能出现。
   8. 确保反应解决方案自1.1.4 开始以来一直保持1小时。
2. 用液-液萃取法提取 DMMTA^V
   1. 1小时后, 将反应溶液倒入含有大约200毫升乙醚的部位漏斗中。
   2. 摇动漏斗 5-10 分钟, 释放气体几次通过切换旋塞阀。
      注意: 合成的 DMMTA^V将被转移到二乙基醚 (0.713 g·mL^-1) 的上层。
      警告:乙醚气体可能有害;使用通风良好的油烟罩。
   3. 在烧杯中收集反应溶液, 并分别收集含有 DMMTA^V的二乙基醚。将反应溶液放回同一部位漏斗中, 加入约200毫升的新鲜二乙基醚 reshaking。重复步骤 1.2.2-1.2.3 三次。
   4. 再将所收集的二乙基醚从步骤1.2.3 倒入同一部位漏斗中, 并添加约100毫升 N₂-清除去离子水。摇动 5-10 分钟, 并丢弃 N₂-清除去离子水和几毫升二乙基醚为纯净目的。在玻璃培养皿中收集剩余的二乙基醚 (最小内径为160毫米, 最小高度为50毫米)。
   5. 将玻璃培养皿转移到 N₂大气手套盒中, 以防止物种转化。
      警告:确保溶剂不被拉入真空泵通过出口的通行证箱。
   6. 干燥直到 dimethylmonothioarsinate 的白色沉淀 (结晶 DMMTA^V) 在玻璃培养皿上形成。
      注意: 协议可以在这里暂停。
3. 对合成 DMMTA^V和存储的验证
   1. 采取结晶 DMMTA^V的白色沉淀, 并测量并记录其总重量。
      警告:使用通风良好的油烟罩或手套箱, 防止吸入硫化氢气体。
   2. 将结晶 DMMTA^V分解为50毫升的 N₂-清除去离子水, 并通过 0.2-µm 注射器过滤器过滤黄色沉淀。
   3. 假定已使用的 DMA^v的总计转换为 DMMTA^v,即≈9,649 mg As·L^-1。稀释 DMMTA^V库存解决方案≈1毫克·L^-1和≈40µg·L^-1分别使用电喷雾电离质量 Spectromtery (ESI) 和 HPLC-电感耦合-ms 进行验证分析。
   4. 使用ESI (MS¹¹)¹⁶和在m/z 155 中的片段在正离子模式下或m/z 153 中的负离子模式 (表 1) 中, 分析 DMMTA^V的m/z 。
      注意: 请参阅m/z的引用值 (表 1)。
   5. 用高效液相色谱-ICP-MS^11,16,17 , 用适当的淋洗条件分析股票溶液中 DMMTA^V的色谱, 并确认主要峰值在文学.
      注意: 应使用步骤1.3.5 中的分析结果计算合成 DMMTA^V的纯度。
   6. 用 ICP-质谱分析酸消化后的总砷浓度¹¹ , 并用稀释因子和纯度计算合成 DMMTA^v库存溶液中的真实 DMMTA^v浓度, 如下面的公式所示:
      分析合计为浓度 (µg·L^-1) ·稀释因素·纯度 (%) = True DMMTA^v集中在 DMMTA^v库存解决方案 (µg·L^-1)
   7. 存储 DMMTA^V库存解决方案在4°c 在黑暗中进一步定量形态分析¹⁸。

2. DMDTA 的合成^V

1. 化学制剂和摩尔比混合 DMA^V , Na₂S, 和 H₂, 所以₄
   注意: DMA^V: Na₂S: H₂所以₄ = 1:7. 5:7. 5
   1. 在50毫升离心管中, 将1.38 克的 DMA^V溶解在40毫升去离子水中。
   2. 通过在50毫升去离子水中溶解18.01 克 na₂S·9H₂O, 将钠₂的试剂制备为一瓶。
   3. 准备 H₂, 使₄试剂添加4毫升浓硫酸 (96%) 到40毫升的去离子水中, 其中含有50毫升离心管。
      注意:DMA 的最终摩尔比率^V: Na₂S: H₂所以₄ = 1:7. 5:7. 5^13,4,8,15。
   4. 将已准备好的40毫升 DMA^V解决方案 (步骤 2.1.1) 添加到250毫升烧瓶 (步骤 2.1.2) 中包含的 Na₂S 解决方案的50毫升。用10毫升去离子水冲洗含有 DMA^V的管, 并将其添加到250毫升烧瓶中。
   5. 将准备好的40毫升 H₂, 使₄解决方案 (步骤 2.1.3), 慢慢地和逐步地, 进入烧瓶。
   6. 定期添加硫酸时, 监测反应混合物在烧瓶中的颜色变化。保持间隔为 4-5 毫升的 H₂, 因此₄;混合物应为白色/黄色多云溶液。
      注: 由于浓硫酸的快速添加, 瞬时黄沉淀可能会出现。
      警告:加入硫酸后, 会产生白烟;使用通风良好的油烟罩。
   7. 在瓶中保持反应液过夜不覆盖。
      注意: 协议可以在这里暂停。
2. 使用固相萃取 (SPE) 方法提取的 DMDTA^V
   1. 在隔夜反应之后, 用 C18 注射器型硅基 SPE 过滤反应溶液, 以便在树脂上捕获合成的 DMDTA^V 。
      警告:使用通风良好的油烟罩。
   2. 用10毫米醋酸铵 (pH 6.3) 将0.77 克醋酸铵溶解在去离子水的1升中。通过 C18 注射器 (步骤 2.2.1) 洗脱足够的10毫米醋酸铵, 提取吸附 DMDTA V.在玻璃培养皿中收集过滤过的醋酸铵 (最小内径为160毫米, 最小高度为50毫米)。
   3. 将玻璃培养皿转移到 N₂大气手套盒中, 以防止物种转化。
      警告:确保溶剂不被拉入真空泵通过出口的通行证箱。
   4. 干燥直到 dimethyldithioarsinate 的白色沉淀形成 (结晶 DMDTA^V) 在玻璃培养皿上。
      注意: 协议可以在这里暂停。
3. 对合成 DMDTA^V和存储的验证
   1. 取结晶 DMDTA^V的白色沉淀, 并测量其总重量, 记录测量结果。
      警告:使用通风良好的油烟罩或手套箱, 防止吸入硫化氢气体。
   2. 在50毫升的 N₂中溶解结晶 DMDTA^V -在50毫升离心管中清除去离子水, 并通过 0.2-µm 注射器过滤器过滤任何沉淀。
   3. 假定已使用的 DMA^V的总计转换为 DMDTA^v,即≈2,539 mg As·L^-1。稀释 DMDTA^V库存解决方案≈1毫克·L^-1和≈40µg·L^-1分别使用 ESI-ms 和高效液相色谱-ms 进行验证分析。
   4. 使用ESI (MS¹¹)¹⁶和在m/z 171 中的片段在正离子模式下或m/z 169 中的负离子模式 (表 1) 中, 分析 DMDTA^V的m/z 。
      注意: 请参阅m/z的引用值 (表 1)。
   5. 用高效液相色谱-ICP-MS¹¹,^{16,17 ,}用适当的淋洗条件分析 DMDTA 中的^V的色谱, 并确认在保留时间内发现的峰值文学。
      注意: 应使用步骤2.3.5 中的分析结果计算合成 DMDTA^V的纯度。
   6. 用 ICP-质谱分析酸消化后的总砷浓度¹¹ , 并用稀释因子和纯度计算合成 DMDTA^v库存溶液中的真 DMDTA^v浓度如下方程式:
      分析合计为浓度 (µg·L^-1) ·稀释因素·纯度 (%) = True DMDTA^v在库存解决方案中 DMDTA^v的浓度 (µg·L^-1)
   7. 存储 DMDTA^V库存解决方案在4°c 在黑暗中进一步定量形态分析¹⁸。

结果

由于 DMA^III合成方法¹⁹错误地编写了 DMMTA^V , 因此对合成的 DMMTA^v和 DMDTA^v的验证是合成和提取和确定理想标准的关键步骤。化学材料。合成化学物质可以通过 DMMTA^V (兆瓦 154 g·mol^-1) 和 DMDTA^V (兆瓦 170 g·mol^-1) 质量-电荷比 (m/z) 的峰值来验证, 使用的是电喷雾电离质量的正负离子模式。通过?...

讨论

已开发的协议澄清了以前研究的关键步骤^1,3,4,8,15省略或缩写, 这可能导致困难或失败期间DMMTA^v和 DMDTA^v合成。由于 DMMTA^V是氧化敏感的^1,5, 使用 N₂清除的去离子水 (步骤 1.1.1-1.1.3) 来制备合成试剂, 以防...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodylic acid	Sigma-Aldrich	20835-10G-F
Sodium sulfide nonahydrate	Sigma-Aldrich	S2006-500G
Sulfuric acid 96%	J.T.Baker	0000011478
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A7262-500G
Formic acid 98%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	066-00461
Diethyl ether (Extra Pure)	Junsei Chemical	33475-0380
Adapter cap for 60 mL Bond Elut catridges	Agilent Technologies	12131004	Syringe type of SPE
Bond Elut C18 cartridge	Agilent Technologies	14256031	Syringe type of SPE
HyPURITY C-18	Thermo Scientific	22105-254630	5 um, 125 x 4.6 mm
Glovebox	Chungae-chun, Rep. of Korea		Customized
Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC	Agilent Technologies	DEAB600252, DEACH00245
Agilent Technologies 7700 Series ICP-MS	Agilent Technologies	JP12031510
Finnigan LCQ Deca XP MAX Mass Spectrometer System	Thermo Electron Corporation	LDM10627