JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья представляет изменение экспериментальные протоколы для dimethylmonothioarsinic кислоты (VDMMTA) и dimethyldithioarsinic кислота (VDMDTA) синтеза, вызывая dimethylarsinic кислоты (VDMA) thiolation путем смешивания DMAV , Na2S и так4H2. Измененный Протокол обеспечивает экспериментальный руководящего положения, тем самым преодоления ограничений синтеза шагов, которые могло вызвать экспериментального сбоев в количественном анализе.

Аннотация

Dimethylated thioarsenicals как dimethylmonothioarsinic кислоты (DMMTAV) и dimethyldithioarsinic кислота (DMDTAV), которые производятся метаболический путь dimethylarsinic кислоты thiolation (VDMA), были недавно Найдено в окружающей среде, а также органов человека. DMMTAV и DMDTAV может быть определена количественно определить экологические последствия dimethylated thioarsenicals и их устойчивость в окружающей среде. Метод синтеза этих соединений нестандартизированного, делая репликации предыдущие исследования сложной. Кроме того существует недостаток информации о технологии хранения, включая хранение соединений без видов трансформации. Кроме того потому что доступен лишь ограниченный объем информации о методах синтеза, может быть экспериментальной трудности в обобщения стандартных химических веществ и количественного анализа. Протокол, представленная в настоящем документе предоставляет метод практически модифицированных синтез dimethylated thioarsenicals, DMMTAV иVDMDTA и поможет в количественной оценке видов разделение анализа с использованием высокопроизводительных жидкости хроматографии в сочетании с масс-спектрометрия индуктивно связанной плазмы (ВЭЖХ-ICP-MS). Экспериментальные шаги этой процедуры были изменены, сосредоточив внимание на подготовке химических реагентов, методы фильтрации и хранения.

Введение

Так как dimethylarsinic кислоты (VDMA) была продемонстрирована выставлять острой токсичности и генотоксичности благодаря метилирования и thiolation после приема1,2, метаболический путь thiolation мышьяка имеет был интенсивно изучали как in vitro и in vivo3,4 , также как и окружающей среды (например, фильтрата полигона)5,6. Предыдущие исследования показали, как сокращение и аналогов thiolatedV DMA в живых клеток, например, dimethylarsinous кислоты (IIIDMA), dimethylmonothioarsinic кислоты (VDMMTA) и dimethyldithioarsinic кислоты ( DMDTAV)7,8,9, с dimethylated thioarsenicals например DMMTAV экспонируется более токсичностью, чем другие известные неорганические или органические связи10. Обилие высокотоксичных thioarsenicals имеет серьезные экологические последствия, поскольку они могут создать угрозу для людей и окружающей среды весьма сульфидный условия11. Однако механизмы DMMTAV и DMDTAV (Транс) формирования и их судьбы в окружающей среды все еще требуют дальнейшего изучения. Таким образом количественный анализ thioarsenicals требуется для улучшения понимания экологических последствий DMMTAV иVDMDTA.

Хотя стандартные химические вещества являются ключевым требованием для количественного анализа, стандарты DMMTAV иV DMDTA трудно получить путем репликации предыдущих исследований, ввиду высокого риска видов трансформации в других видов и нестандартизированного синтеза процедуры12. Кроме того ссылки на методы имеют ограничения, которые могут привести к практические трудности в обобщения стандартных химических веществ и количественного анализа. DMMTAV иV DMDTA обычно готовят путем смешивания DMAV, Na2S и H2,4 в некоторых молярное соотношение1 или восходящей H2S газа через решенияV 13,14DMA. Восходящей замена функции метод кислорода, серы, используя прямые поставки газа H2S, который, высоко токсичен и трудно контролировать для неопытного пользователя. И наоборот выше смешивания метод1, широко используется для качественного анализа DMMTAV и DMDTAV в экологических sudies5,6,12, предлагает thiolation из V DMA с H2S, созданный путем смешивания Na2S и H2,4 и производит DMMTAV и DMDTAV, позволяя легче стехиометрическим управления для получения целевых химических веществ, как по сравнению с прямой использование газа H2S.

Ссылка, смешивания метод процедуры1,3,4,8,15 упоминается в это исследование экспонат ограничения в некоторых из их важнейших экспериментальных шагов, которые могут привести к экспериментальный провал. Например сведения о подготовке конкретных растворителя (т.е., деионизированная вода) и извлечения и кристаллизации синтезированных связи чрезмерно сокращенно или достаточно подробно не описаны. Такие дисперсионные и ограниченную информацию о процедурных шагов может привести к несовместимым формирования thioarsenicals и ненадежных количественной оценки анализа. Таким образом измененный Протокол, разработанный в настоящем документе описывается синтез DMMTAV и DMDTAV акций решения с количественной видов разделение анализа.

протокол

1. синтез DMMTAV

  1. Химическая подготовка и молярное соотношение смешивания DMAV, Na2S и H2т4
    Примечание: DMAV: Na2S:H2так4 = 1:1.6:1.6
    1. Распустить 5.24 gV DMA в 40 мл деионизированная и N2-очищенные (очищенные для по крайней мере 30 мин) воды в пластиковых пробирок 50 мл.
    2. Подготовка реагента2S Na, растворяя 14.41 g Na2S·9H2O в 50 мл деионизированная и N2-очистка воды в колбу 250 мл.
    3. Подготовка H2так деионизированная4 реагента, добавив 3,3 мл концентрированной серной кислоты (96%), 40 мл и N2-очистка воды в пластиковых пробирок 50 мл.
      Примечание: Окончательный молярное соотношение DMAV: Na2S:H2т4 = 1:1.6:1.6 1,3,4,8,15.
    4. Добавьте подготовленные 40 мл раствора DMAV (шаг 1.1.1) 50 мл Na2S решения, содержащиеся в 250 мл флакон (шаг 1.1.2). Промойте трубка, содержащаяV DMA с 10 мл очищенные воды и добавить к этому также флакон 250 мл.
    5. Закройте колбу с 3 отверстие резиновой пробкой с стеклянных трубок. Использовать стеклянные трубки для N2 газа приток и отток H2т4 решения входе, соответственно. Сразу же после закрытия колбу, позволяют N2 потока газа в колбу.
      Примечание: Давление газа следует сохранить для потока над поверхностью реакции раствора без брызг.
    6. Подключение, кислотоупорные трубки стеклянные трубы H2так4 решения входе с 50 мл шприц для добавления подготовлены 40 мл H2так4 решения (шаг 1.1.3). ТАК добавить 40 мл H24 решения, медленно и в виде ступенчатой.
      Осторожностью: При добавлении серной кислоты, белый дым будет создаваться; использование хорошо проветриваемом зонта.
    7. Изменение цвета монитора реакционной смеси в колбу при добавлении серной кислоты на регулярной основе. Поддерживать интервал 4-5 мл капли H2так4; смесь должна быть Белый облачный решение.
      Примечание: Мгновенная желтых осадков может появиться из-за быстрого добавления концентрированной серной кислоты.
    8. Убедитесь, что реакция решение стоит за 1 ч с момента начала шага 1.1.4.
  2. DMMTAV Добыча методом экстракции жидкости жидкостью
    1. После 1 h Залейте раствор реакции в воронку separatory, содержащие около 200 мл диэтиловом эфире.
    2. Встряхните воронка для 5-10 мин, выпуская газ несколько раз путем переключения краном.
      Примечание: Синтезированных DMMTAV будет передана верхний слой диэтиловым эфиром (0.713 g·mL-1).
      Осторожностью: Диэтиловым эфиром газовый могут причинить вред; использование хорошо проветриваемом зонта.
    3. Сбор реакции раствора в стакан и отдельно собирать диэтиловым эфиром, содержащие DMMTAV в бутылке. Место реакция решение обратно в том же separatory воронка и добавить около 200 мл свежего диэтиловым эфиром для reshaking. Повторите шаги 1.2.2 - 1.2.3 в три раза.
    4. Снова залить собранных диэтиловый эфир от шага 1.2.3 в том же separatory воронку и добавить около 100 мл N2-очищенные деионизированную воду. Shake для 5-10 мин и отбросить N2-очищенные деионизированной воды и несколько мл диэтиловым эфиром для целей чистоты. Соберите оставшиеся диэтиловый эфир в чашку Петри стеклянная (минимальный внутренний диаметр 160 мм) и минимальная высота 50 мм.
    5. Перенесите стекла Петри в N2 атмосферы перчаточный ящик для предотвращения видов трансформации.
      Осторожностью: Убедитесь, что растворитель не вытянули в вакуумный насос через выход окна перевал.
    6. Сухой до Белый преципитат dimethylmonothioarsinate (кристаллические DMMTAV) формируется на стекло Петри.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  3. Проверка хранения и синтезированных DMMTAV
    1. Принять Белый преципитат выкристаллизовались DMMTAVи измерять и записывать его общий вес.
      Осторожностью: Используйте хорошо проветриваемом Зонта или бардачок для предотвращения вдыхания газа сероводородом.
    2. Растворите выкристаллизовалисьV DMMTA в 50 мл N2-очищенные деионизированной воды и фильтров желтый осадок через фильтр шприц 0,2 мкм.
    3. Предположим, что общее число используемых DMAV преобразуется в DMMTAV, то есть≈9, 649 мг As· L-1. Разбавить DMMTAV Стоковый раствор для ≈1 mg· L-1 и ≈40 µg· L-1 для проверки анализа с использованием электроспрей ионизации массы Spectromtery (ESI-МС) и ВЭЖХ-ICP-MS, соответственно.
    4. Анализируйте m/z DMMTAV с использованием11,еси-MS16 и фрагменты на m/z 155 в положительный ион режиме или на 153 m/z в режиме отрицательной Ион (Таблица 1).
      Примечание: См. справочные значения m/z (Таблица 1).
    5. Анализировать ХроматограммаV DMMTA в раствор с помощью ВЭЖХ-ICP-MS11,,1617 с условиями соответствующего элюента и подтвердить основной пик находится на время удерживания, описанные в литература.
      Примечание: Чистоту синтезированных DMMTAV должен рассчитываться с использованием результатов анализа от шага 1.3.5.
    6. Анализ концентрации всего мышьяка, с помощью ICP-MS после кислотного пищеварение11 и рассчитать истинную концентрацию DMMTAV в синтезированных DMMTAV Стоковый раствор с помощью разбавления факторов и чистоту, как и следующее уравнение:
      Проанализированы общей концентрации (µg· L-1) · Коэффициент разрежения · Чистоты (%) = True DMMTAV концентрация в DMMTAV Стоковый раствор (µg· L-1)
    7. Хранить DMMTAV Стоковый раствор при температуре 4 ° C в темноте для дальнейших количественных видообразования анализ18.

2. синтез DMDTAV

  1. Химическая подготовка и молярное соотношение смешивания DMAV , Na2S и H2т4
    Примечание: DMAV: Na2S:H2так4 = 1:7.5:7.5
    1. Растворите 1,38 gV DMA в 40 мл деионизированной воды в пластиковых пробирок 50 мл.
    2. Подготовка реагента2S Na, растворяя 18.01 g Na2S·9H O2в 50 мл деионизированной воды в колбу 250 мл.
    3. Подготовьте H2, так что4 реагента, добавив 4 мл концентрированной серной кислоты (96%) 40 мл деионизованной воды содержится в 50 мл пластиковых пробирок.
      Примечание: Окончательный молярное соотношение DMAV: Na2S:H2т4 = 1:7.5:7.51,3,4,8,15.
    4. Добавьте подготовленные 40 мл раствора DMAV (шаг 2.1.1) 50 мл Na2S решения, содержащиеся в 250 мл флакон (шаг 2.1.2). Промойте трубка, содержащаяV DMA с 10 мл деионизированной воды и добавить к этому также флакон 250 мл.
    5. ТАК добавить подготовленные 40 мл H24 решения (шаг 2.1.3), медленно и на основе поэтапного, в колбу.
    6. Следить за изменением цвета реакционной смеси в колбу при добавлении серной кислоты на регулярной основе. Поддерживать интервал 4-5 мл капли H2так4; смесь должна быть желто белый облачный решение.
      Примечание: Мгновенная желтых осадков может появиться из-за быстрого добавления концентрированной серной кислоты.
      Осторожностью: При добавлении серной кислоты, белый дым будет создаваться; использование хорошо проветриваемом зонта.
    7. Поддерживать реакция решение в колбу на ночь без покрытия.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  2. DMDTAV Добыча методом экстракции твердофазный (SPE)
    1. После ночи реакции, стоя фильтр, реакция решение, с помощью шприца C18 типа на основе силики SPE для того, чтобы поймать синтезированы DMDTAV на смолы.
      Осторожностью: Использование хорошо проветриваемом зонта.
    2. Подготовка 10 мм аммония ацетат (рН 6,3) путем растворения 0.77 g ацетата аммония в 1 Л деионизированной воды. Элюировать достаточного объема ацетата аммония 10 мм через шприц C18 (шаг 2.2.1) для извлечения адсорбированные DMDTAV. Соберите отфильтрованных аммония ацетат в стеклянной чашке Петри (минимальный внутренний диаметр 160 мм) и минимальная высота 50 мм.
    3. Перенесите стекла Петри в N2 атмосферы перчаточный ящик для предотвращения видов трансформации.
      Осторожностью: Убедитесь, что растворитель не вытянули в вакуумный насос через выход окна перевал.
    4. Сухой, пока Белый преципитат dimethyldithioarsinate создано стекло Петри (кристаллические DMDTAV).
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  3. Проверка хранения и синтезированных DMDTAV
    1. Возьмите Белый преципитат выкристаллизовались DMDTAVи измерить его общий вес, запись измерения.
      Осторожностью: Используйте хорошо проветриваемом Зонта или бардачок для предотвращения вдыхания газа сероводородом.
    2. Растворите выкристаллизовалисьV DMDTA в 50 мл N2-очищенные деионизированной воды в 50 мл центрифуга трубки и фильтровать любой преципитат через фильтр шприц 0,2 мкм.
    3. Предполагается, что общее число используемых DMAV преобразуется в DMDTAV, то есть≈2, 539 мг As· L-1. Разбавить DMDTAV Стоковый раствор для ≈1 mg· L-1 и ≈40 µg· L-1 для проверки анализа с помощью ESI-MS и ВЭЖХ-ICP-MS, соответственно.
    4. Анализируйте m/z DMDTAV с использованием11,еси-MS16 и фрагменты на m/z 171 в положительный ион режиме или на 169 m/z в режиме отрицательной Ион (Таблица 1).
      Примечание: См. справочные значения m/z (Таблица 1).
    5. Анализировать ХроматограммаV DMDTA в раствор с помощью ВЭЖХ-ICP-MS11,,1617 с условиями соответствующего элюента и подтвердить, что пик находится на время удерживания, описанные в литература.
      Примечание: Чистоту синтезированных DMDTAV должен рассчитываться с использованием результатов анализа от шага 2.3.5.
    6. Анализ концентрации всего мышьяка, с помощью ICP-MS после кислотного пищеварение11 и рассчитать истинную концентрацию DMDTAV в синтезированном DMDTAV Стоковый раствор с использованием факторов разрежения и чистоты как следующее уравнение:
      Проанализированы общей концентрации (µg· L-1) · Коэффициент разрежения · Чистоты (%) = концентрация True DMDTAV V DMDTA в раствор (µg· L-1)
    7. Хранить DMDTAV Стоковый раствор при температуре 4 ° C в темноте для дальнейших количественных видообразования анализ18.

Результаты

Поскольку метод синтеза DMAIII 19ошибочно подготовлен DMMTAV , проверке синтезированных DMMTAV и DMDTAV является важным шагом для синтеза и извлечения и определения идеального стандарта химические материалы. Синтезированные химические вещес?...

Обсуждение

Разработанный протокол разъяснил важнейшие шаги, что предыдущие исследования1,3,4,8,15 опущен или аббревиатура, которая может привели к трудности с или неудачи во время СинтезV V DMMTA и DMDTA. К?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано программы фундаментальных исследований науки (номер проекта: 2016R1A2B4013467) через национальные исследования фонд из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования 2016 и также поддерживается Корея фундаментальной науки Институт исследований программы (номер проекта: C36707).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cacodylic acidSigma-Aldrich20835-10G-F
Sodium sulfide nonahydrateSigma-AldrichS2006-500G
Sulfuric acid 96%J.T.Baker0000011478
Ammonium acetateSigma-AldrichA7262-500G
Formic acid 98%Wako Pure Chemical Industries, Ltd.066-00461
Diethyl ether (Extra Pure)Junsei Chemical33475-0380
Adapter cap for 60 mL Bond Elut catridgesAgilent Technologies12131004Syringe type of SPE
Bond Elut C18 cartridgeAgilent Technologies14256031Syringe type of SPE
HyPURITY C-18Thermo Scientific22105-2546305 um, 125 x 4.6 mm
GloveboxChungae-chun, Rep. of KoreaCustomized 
Agilent 1260 Infinity Bio-inert LCAgilent TechnologiesDEAB600252, DEACH00245
Agilent Technologies 7700 Series ICP-MSAgilent TechnologiesJP12031510
Finnigan LCQ Deca XP MAX Mass Spectrometer SystemThermo Electron CorporationLDM10627

Ссылки

  1. Suzuki, K. T., et al. Dimethylthioarsenicals as arsenic metabolites and their chemical preparation. Chem. Res. Toxicol. 17, 914-921 (2004).
  2. Kuroda, K., et al. Microbial metabolite of dimethylarsinic acid is highly toxic and genotoxic. Toxicol. Appl. Pharmacol. 198, 345-353 (2004).
  3. Naranmandura, H., Iwata, K., Suzuki, K. T., Ogra, Y. Distribution and metabolism of four different dimethylated arsenicals in hamsters. Toxicol. Appl. Pharmacol. 245, 67-75 (2010).
  4. Naranmandura, H., et al. Comparative toxicity of arsenic metabolites in human bladder cancer EJ-1 cells. Chem. Res. Toxicol. 24, 1586-1596 (2011).
  5. Wallschlager, D., London, J. Determination of methylated arsenic-sulfur compounds in groundwater. Environ. Sci. Technol. 42, 228-234 (2008).
  6. Zhang, J., Kim, H., Townsend, T. Methodology for assessing thioarsenic formation potential in sulfidic landfill environments. Chemosphere. 107, 311-318 (2014).
  7. Shimoda, Y., et al. Proposal for novel metabolic pathway of highly toxic dimethylated arsenics accompanied by enzymatic sulfuration, desulfuration and oxidation. Trace Elem. Med. Biol. 30, 129-136 (2015).
  8. Naranmandura, H., Suzuki, T. K. Formation of dimethylthioarsenicals in red blood cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 227, 390-399 (2008).
  9. Leffers, L., Ebert, F., Taleshi, S. M., Francesconi, A. K., Schwerdtle, T. In vitro toxicological characterization of two arsenosugars and their metabolites. Mol. Nutr. Food Res. 57, 1270-1282 (2013).
  10. Wang, Q. Q., Thomas, J. D., Naranmandura, H. Important of being thiomethylated: Formation, Fate and Effects of methylated thioarsenicals. Chem. Res. Toxicol. 25, 281-289 (2015).
  11. Kim, Y. T., Lee, H., Yoon, H. O., Woo, N. C. Kinetics of dimethylated thioarsenicals and the formation of highly toxic dimethylmonothioarsinic acid in environment. Environ. Sci. Technol. 50, 11637-11645 (2016).
  12. Cullen, W. R., et al. Methylated and thiolated arsenic species for environmental and health research - A review on synthesis and characterization. J. Environ. Sci. 49, 7-27 (2016).
  13. Fricke, M., et al. Chromatographic separation and identification of products form the reaction of dimethylarsinic acid with hydrogen sulfide. Chem. Res. Toxicol. 18, 1821-1829 (2005).
  14. Fricke, M., Zeller, M., Cullen, W., Witkowski, M., Creed, J. Dimethylthioarsinic anhydride: a standard for arsenic speciation. Anal. Chim. Acta. 583, 78-83 (2007).
  15. Suzuki, K. T., Iwata, K., Naranmandura, H., Suzuki, N. Metabolic differences between twon dimethylthioarsenicals in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 218, 166-173 (2007).
  16. Jeong, S., et al. Development of a simultaneous analytical method to determine arsenic speciation using HPLC-ICP-MS: Arsenate, arsenite, monomethylarsonic acid, dimethylarsinic acid, dimethyldithioarsinic acid, and dimethylmonothioarsinic acid. Microchem. J. 134, 295-300 (2017).
  17. Li, Y., Low, C. -. K., Scott, A. J., Amal, R. Arsenic speciation in municipal landfill leachate. Chemosphere. 79, 794-801 (2010).
  18. Conklin, D. S., Fricke, W. M., Creed, A. P., Creed, J. T. Investigation of the pH effects on the formation of methylated thio-arsenicals, and the effects of pH and temperature on their stability. J. Anal. At. Spectrom. 23, 711-716 (2008).
  19. Hansen, H. R., Raab, A., Jaspara, M., Milne, F. B., Feldmann, J. Sulfur-containing arsenical mistaken for dimethylarsinous acid [DMA(III)] and identified as a natural metabolite in urine: major implications for studies on arsenic metabolism and toxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, 1086-1091 (2004).
  20. Mandal, B. K., Suzuki, K. T., Anzai, K., Yamaguchi, K., Sei, Y. A SEC-HPLC-ICP-MS hyphenated technique for identification of sulfur-containing arsenic metabolites in biological samples. J. Chromatogr. B. 874, 64-76 (2008).
  21. Bartel, M., Ebert, F., Leffers, L., Karst, U., Schwerdtle, T. Toxicological characterization of the inorganic and organic arsenic metabolite thio-DMAV in cultured human lung cells. J. Toxicol. 2011, (2011).
  22. An, J., et al. Formation of dimethyldithioarsinic acid in a simulated landfill leachate in relation to hydrosulfide concentration. Environ. Geochem. Health. 38, 255-263 (2016).
  23. Chen, B., et al. Arsenic speciation in the blood of arsenite-treated F344 rats. Chem. Res. Toxicol. 26, 952-962 (2013).
  24. Alava, P., et al. HPLC-ICP-MS method development to monitor arsenic speciation changes by human gut microbiota. Biomed. Chromatogr. 26, 524-533 (2012).
  25. Kurosawa, H., et al. A novel metabolic activation associated with glutathione in dimethylmonoarsinic acid (DMMTAV)-induced toxicity obtained from in vitro reaction of DMMTAV with glutathione. J. trace Elem. Med. Biol. 33, 87-94 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133Dimethylated thioarsenicalsdimethylmonothioarsinicdimethyldithioarsinicICP MSESI MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены