重组原型泡沫病毒整合纯化过程中核酸污染的检测与去除

摘要

重组原型泡沫病毒整合蛋白经常被细菌核酸在纯化过程中污染。这种方法识别核酸污染, 并将其从酶的最终制备中除去。

摘要

逆转录病毒原型 (PFV) 中的整合蛋白是研究反转录酶的机制。与其他病毒相比, PFV 在更易于溶解, 更适于实验操作。此外, 它是敏感的临床相关的人体免疫缺陷病毒 (HIV-1) 的抑制剂, 表明 PFV 的催化机制类似于 HIV-1 在. 在催化病毒互补 DNA (cDNA) 共价加入靶DNA 在一个称为链转移的过程中。这股转移反应引入了缺口的目标 DNA。综合反应产品的分析可以被混淆由核酸的存在相似地尼克脱氧核糖核酸。在大肠杆菌(大肠杆菌) 中, 一种细菌核酸已被证明与重组 PFV 联合纯化.在这里, 我们描述了一种方法, 以隔离 PFV 从污染核酸的肝素亲和层析。通过超质粒和琼脂糖凝胶电泳, 可以很容易地筛选出分数核酸污染。PFV 在和污染的核酸显示替代亲和力的肝素琼脂允许核酸自由制备重组 PFV 适合散装生物化学或单分子分析一体化。

引言

蛋白质与 DNA 相互作用的生物化学和单分子研究需要格外纯的重组蛋白。污染核酸的细菌可以掩盖这些化验结果。从大肠杆菌(大肠杆菌) 中分离出的重组蛋白氧清除 protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) 和原型泡沫病毒 (PFV) 整合 (in) 的制备中发现了污染核酸^1,2,3。

逆转录病毒集成检测依赖于超 DNA 到有缺口或线性产品的转换, 作为活动的⁴。在细胞感染期间, 将病毒 cDNA 的两端连接到宿主染色质⁵。每个端接反应称为链转移。重组活性的测定可以加入两个 dna 齐聚物, 模仿病毒 cDNA 结束到目标 dna 在一致的集成反应中^4,5,6,7,8。二者择一地重组在5月加入仅一个脱氧核糖核酸末端在一个非生理相关的半站点综合反应^9,10。当超质粒 dna 是整合的目标时, 协同集成产品是线性化 dna 和半站点集成产品的放松圈。这些反应产物通过其相对流动性在琼脂糖凝胶电泳¹。如果重组中有一个污染的核酸, 将有假放松圈或可能线性化的质粒混淆了实验结果。病毒 DNA 寡聚物可能被荧光标记, 以最终确定集成产品, 而不是核酸产品。然而, 在很大程度上有利于超的 DNA 靶点;任何超质粒通过污染核酸而导致的松弛圆或线性 DNA 的损失都可能扭曲数据¹¹的结果和解释。因此, 在制剂中清除逆转录病毒的细菌核酸是势在必行的。

PFV 对肝素琼脂有不同的亲和力, 与细菌核酸¹比较。PFV 和核酸可由肝素琼脂的线性梯度洗脱分离。核酸在 280 nm 峰值或通过分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 的紫外线 (UV) 吸收后不易检测到。相反, 核酸是通过核酸活性测定检测的, 采用超质粒转化为松弛的圆或线性产品。肝素琼脂色谱法测定核酸活性。PFV 和核酸污染物对单 Q 阴离子树脂亲和性无影响。单 S 阳离子树脂亲和性有很小的差异。然而, 细菌核酸和 PFV 的单 S 分辨率不会允许有效分离蛋白质。最终, 肝素琼脂亲和纯化提供了最好的分离细菌核酸从 PFV 在和具有无限的优势的负荷量。

对污染核酸活性的检测可以适应其他蛋白质。兴趣的蛋白质可能有其他的亲和力特征比 PFV 在;有兴趣的蛋白质和核酸污染物的结合特征的区别必须是经验主义地确定的。这种识别核酸污染的方法可适用于其他树脂, 包括单 S 阳离子或单 Q 阴离子交换树脂。亲和性和离子交换树脂可以提供一种可靠的方法来分离核酸污染的重组蛋白, 而不限制色谱中蛋白质的体积。

研究方案

1. 诱发 PFV 在大肠杆菌中的表达式

1. 添加1μ l 的 PFV 在表达质粒 (10 ng/μ l) 到20μ l 的大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS (20 μ l 分的商业可用细胞有 > 2 x 10⁶ CFU/微克质粒) 在1.5 毫升管。用手指轻轻敲击或轻拂管子。在冰上孵育5分钟。
   1. 热休克整整三十年代在42˚C 水浴, 然后立即返回到冰2分钟。
   2. 添加80μ l 室温超优化汤与物抑制 (SOC) 媒体。孵育为1小时在37˚C 以225转每分钟 (rpm) 震动。
   3. 25μ l 的混合物在100毫米 x 15 毫米培养皿中, 含有25毫升的 Luria 肉汤 (lb) 琼脂 (1 L 磅琼脂:10 克 bacto-胰, 10 克氯化钠, 5 克酵母提取物, 15 克琼脂) 和100微克/毫升氨苄西林 (100 毫克/毫升的库存溶液)。
   4. 在第二个相同的板上将剩余的75μ l 转化后的细胞板。在37° c 的夜间, 用盖子将盘子孵育。
2. 检索已转换的大肠杆菌的板.使用一个单一的殖民地接种3毫升磅 (1 升磅:10 克 bacto-胰, 10 克氯化钠, 5 克酵母提取物) 补充100微克/毫升氨苄西林在14毫升圆底聚丙烯培养管。孵育为〜8小时在37˚C 与 225 rpm 晃动。
   1. 在34毫升锥形瓶中加入100微克/毫升氨苄西林和34微克/毫升氯霉素 (250 毫克/毫升的库存溶液), 添加3毫升的养殖50毫升磅。在37° c 的夜间孵育培养, 225 rpm 晃动。
   2. 将53毫升的养殖转移到1升磅、100微克/毫升氨苄青霉素和34微克/毫升氯霉素在4升锥形瓶中。孵育在37° c 与225转每分钟摇晃。
   3. 定期测量区域性的 600 nm (OD₆₀₀) 的光学密度。最初, 检查每个 h 的区域性 OD₆₀₀ 。当区域性达到所需的 OD₆₀₀时, 请检查每15分钟不满。将区域性扩展到0.9 和1.0 之间的 OD₆₀₀ 。将烧瓶转到冰浴和旋流中, 以降低养殖温度。
3. 将1毫升的培养基转移到1.5 毫升的试管中, 然后进行变性 SDS-page 分析。
   1. 将1.5 毫升管中的细胞在室温下离心1分钟, 在离心 1.4万 x g。丢弃上清液。重150μ l 磷酸缓冲盐 (PBS) 中的颗粒移。PBS 可以是有或没有 CaCl₂和氯化镁₂。
   2. 添加150μ l 2x sds-页样品缓冲液 (150 毫米三盐酸, pH 6.8, 1.2% sds, 30% 甘油, 15% β-基 (βME), 0.0018% 溴蓝色), 并通过吸管或涡流彻底混合。在-20 ° c 下煮沸3分钟。
4. 添加到细菌培养: 最后浓度0.25 毫米异丙基β-d-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 米的股票溶液) 和50μ m ZnCl₂ (50 mM 股票解决方案)。IPTG 诱导表达的 PFV在基因从 T7 启动子和 ZnCl₂是补充为正确折叠的一个氨基终端锌指域在 PFV. 孵育文化在25° c 以震动在 225 rpm 为 4 h. 立刻把烧瓶转到冰浴。保存1毫升的文化为 SDS-页分析遵循相同的议定书, 如以上1.3。
5. 将细菌培养转化为适当大小的离心瓶。例如, 1 L 文化可以转移到四无菌一次性250毫升锥形底聚丙烯瓶。旋转的瓶子在一个冷藏桌面离心机在 3000 x g 20 分钟在4˚C。通过浇注丢弃清。
   1. 重所有的颗粒从 1 L 细菌培养在总容量25毫升 (6.25 毫升每瓶) 冷 PBS (有或没有 CaCl₂和氯化镁₂) 由移。将细菌悬浮液与一个50毫升的锥形管结合并转移。旋转在一个冷冻离心机在 3000 x g 为20分钟在4° c。通过浇注或移丢弃上清液。
6. 重在10毫升悬浮缓冲 (50 毫米三盐酸, pH 7.5, 500 毫米氯化钠, 和500μ m phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 蛋白酶抑制剂) 移的细菌颗粒。通过将试管放入带有液态氮气的杜瓦瓶中, 使其凝固, 足以淹没50毫升管。小心地将管子从液氮中取出, 贮存在-80 ° c。
   注: 细菌颗粒可在-80 ° c 贮存数月。在-80 ° c 贮藏两年后, 我们没有发现活性蛋白的损失。
7. 用8.3 厘米宽, 7.3 厘米高, 0.75 毫米厚的 SDS-页状凝胶, 1.5 毫升6% 聚丙烯酰胺堆叠层 (125 mm 三盐酸, pH 6.8, 6% 丙烯酰胺, 0.1% SDS, 过硫酸铵, 0.1% TEMED) 和 0.001% ml 3.5 分析预感应和后诱导样品聚丙烯酰胺解决层 (375 毫米三盐酸, pH 8.8, 10% 丙烯酰胺, 0.1% SDS, 过硫酸铵, 0.1% TEMED)^0.001%。
   1. 倒入堆叠凝胶后, 插入10井梳。当凝胶有聚合, 组装页设备, 并添加足够的 SDS 页运行缓冲 (25 毫米三, 192 毫米甘氨酸, 0.1% sds)。
   2. 装载10μ l 每个样品和4μ l prestained 蛋白质标准。运行在16.5 伏/厘米, 直到染料前到达底部的凝胶, 约60分钟。
   3. 拆开凝胶板, 将凝胶转移到塑料浴缸。添加马斯亮明亮的蓝色染色液 (0.1% 马斯亮亮蓝色 R-250, 40% 甲醇, 10% 乙酸) 慷慨地覆盖在室温下20分钟的凝胶和染色。
   4. 通过浇注和更换 destain 溶液 (40% 甲醇, 10% 醋酸) 除去染色液, 直到带很容易看到。通过浇注和更换去离子水去除脱色溶液。PFV 在后诱导样品中应易于识别。PFV 与 hexahistidine 标签有一个分子量 47374 Da。
   5. 如果 PFV 不可见, 则从一个变换板中的一个不同的菌落开始重复感应。

2. 镍亲和层析

1. 在冰上解冻一个细菌颗粒。
   注意: 这将需要很大的时间 (约 2-3 小时)。当颗粒解冻到一个细胞浆, 添加一个额外的500μ m PMSF (100 毫米库存溶液)。
2. 将50毫升的细菌浆管放在冰上。几种的细菌在30% 振幅为三十年代 (1 s, 1 s 关闭) 每丸从 1 L 培养使用 sonicator 与0.5 英寸直径的生物喇叭与0.125 英寸直径锥形 mircotip, 频率20赫和最大功率 400 W。
3. 将细胞样品转移到冷 ultracentrifuge 管。使用聚碳酸酯瓶组件 (25 毫米直径, 89 毫米高度) 与 a 型60钛固定角转子兼容。如果达到相同的引力力, 可选用其它管和转子。旋转 12万 x g 为60分钟在4° c。应该有一个明显的颗粒。上清的颜色可能是黄色的。
4. 将上清液倒入或移到冷的50毫升锥形管上。注意音量;此卷应近似于在对齐冻结之前使用的悬浮缓冲区的体积。如果上清液粘稠, 可能会被细菌 DNA 污染, 从而堵塞色谱柱。在这种情况下, 重复离心, 以颗粒的细菌 DNA。
5. 准备500毫升缓冲器 A (50 毫米三盐酸, ph 7.5, 500 毫米氯化钠, 500 μ m PMSF) 和500毫升缓冲 B (50 毫米三盐酸, ph 7.5, 500 毫米氯化钠, 500 μ m PMSF, 200 毫米咪唑)。
   注意: 在本协议中, 将快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统、所有缓冲器和样品保存在4° c 的冷室中。
   1. 无菌过滤器缓冲器 A 和 B 与0.2 μ m 一次性过滤器单位。根据 FPLC 系统, 分别用缓冲器 a 和缓冲器 b 清洗泵 a 和泵 b。流90% 缓冲器 a 和10% 缓冲器 B 通过系统, 直到电导率和 UV 读数稳定。最大流速将取决于仪器;使用5毫升/分钟的流量, 最大压力限制为1.0 兆帕斯卡。
6. 准备一个110毫米长, 5 毫米直径 FPLC 柱与1.5 毫升镍充电树脂 (最大结合容量50毫克/毫升, 最大压力 1 MPa)。该列可在提纯前的前一天准备好, 贮存在4˚C。
7. 将列连接到 FPLC 仪器。平衡20毫升的90% 缓冲器 a 和10% 缓冲 B (20 mM 咪唑) 的流量为0.5 毫升/分钟, 最大压力极限为0.5 兆帕斯卡。该仪器应收集 280 nm (一个₂₈₀) 的电导率和紫外线吸收的实时数据。电导率和 UV 读数应稳定。如果这些读数没有稳定, 继续通过该列的流动缓冲区, 直到它们是稳定的。
8. 在0.15 毫升/分钟的流速下, 将蛋白质样本 (每粒10毫升) 加载到柱上, 最大压力极限为0.5 兆帕斯卡。在整个净化过程中, 流动速率和柱压力保持不变。收集在50毫升管的流量。
   1. 用20毫升90% 缓冲器 a 和10% 缓冲液冲洗柱 b. 在50毫升的管子里收集洗涤。洗蛋白质与 20 mL 线性梯度10% 到100% 缓冲 B (20 毫米到200毫米咪唑)。
   2. 最后, 用5毫升100% 缓冲 B (200 mM 咪唑) 清洗柱。在0.27 毫升分数中收集渐变和最终洗涤。
9. 结合15μ l 2x SDS-页样本缓冲区与15μ l 的流动, 洗涤, 并峰值一个₂₈₀分数。将样品煮沸3分钟。
   1. 准备两 10% SDS 页凝胶, 如前所述的步骤 1.6, 除了15井梳子。将每个样品的10μ l 载入凝胶和4μ l prestained 蛋白标准。如步骤1.6 所述, 运行、着色和分析凝胶。
   2. 在视觉检查的基础上, 将似乎包含几乎纯 PFV 的分数组合在一起。通过移测量体积, 通常为 8-10 毫升。
   3. 使用分光光度计测量组合分数的一个₂₈₀ , 并计算蛋白质中 PFV 的总量;我们的典型产量是每升10毫克的诱导培养。PFV 的消光系数与 hexahistidine 标记为 59360 cm^-1 M^-1。
10. 要删除 hexahistidine 标签, 补充 PFV 在10毫米糖 (德勤, 1 米的股票解决方案) 和0.1 毫米 EDTA, pH 8.0 (0.5 米库存解决方案)。添加15微克的人鼻 (HRV) 3C 蛋白酶每毫克 PFV 在. 孵育在4˚C 过夜。从 47374 da 到 44394 da, 裂解减少了分子量的 PFV, 并可通过 10% SDS 页分析进行验证。

3. 肝素亲和层析

1. 准备250毫升缓冲剂 C (50 毫米三盐酸, ph 7.5, 10 毫米的, 0.1 毫米 edta, 500 μ m PMSF) 和250毫升缓冲 D (50 毫米三 hcl, ph 7.5, 10 毫米的数字式, 0.1 毫米 edta, 500 μ m PMSF, 1 米氯化钠)。
   注: 在本协议中, FPLC 系统、缓冲器和样品保存在4˚C 的冷室中。
   1. 无菌过滤器缓冲 C 和 D 与0.2 μ m 一次性过滤器单位。根据 FPLC 系统, 分别清洗泵 a 和泵 B 与缓冲器 C 和缓冲器 D。流80% 缓冲器 C 和20% 缓冲器 D 通过系统, 直到电导率和 UV 读数稳定。最大流速将取决于仪器;我们经常使用的流量为5毫升/分钟, 最大压力限制为1.0 兆帕斯卡。
2. 准备一个80毫米长, 5 毫米直径 FPLC 柱与1毫升肝素琼脂树脂 (最大结合能力2.0 毫克的牛抗凝血酶 III 每毫升树脂; 最大压力 1.4 MPa)。该柱可在提纯前的前一天准备好, 贮存在4° c。将列连接到 FPLC 仪器。
   1. 平衡20毫升的80% 缓冲 C 和20% 缓冲 D (200 毫米氯化钠) 的流量为0.5 毫升/分钟, 最大压力限制为1兆帕斯卡。该仪器应收集 280 nm (一个₂₈₀) 的电导率和紫外线吸收的实时数据。电导率和 UV 读数应稳定。如果这些读数没有稳定, 继续通过该列的流动缓冲区, 直到它们是稳定的。
3. 通过增加1.5 卷缓冲 C, 将 PFV 的氯化钠浓度降低到200毫米。例如, 在中添加15毫升的缓冲 C 到10毫升 PFV。我们的总容量是典型地 ~ 25 毫升。
4. 将稀释后的 PFV 在样品中, 以0.5 毫升/分钟的流速, 以最大压力极限1.0 兆帕斯卡的速度载入肝素琼脂柱。在整个净化过程中, 流动速率和柱压力保持不变。收集在50毫升锥形管的流量。
   1. 用20毫升80% 缓冲 C 和20% 缓冲 D (200 毫米氯化钠) 冲洗柱, 在50毫升锥形管中收集洗涤液。洗 30 mL 线性梯度20% 到100% 缓冲 D (200 毫米到 1 M 氯化钠) 的专栏。
   2. 用5毫升100% 缓冲器清洗柱 d. 在0.37 毫升分数中收集梯度和最终洗涤。
5. 分析负载, 流经, 洗涤和分数 8% SDS 页, 如所述, 在2.9。PFV 在以下的 hexahistidine 标签的裂解有一个分子量的 44394 Da 和灭绝系数保持59360厘米^-1 M^-1没有 hexahistidine 标记。将所有分数存储在4˚C, 直到完成核酸检测。

4. 核酸测定

1. 确定肝素琼脂分数, 似乎含有几乎纯 PFV. 结合3μ l 肝素分数和 50 ng 3 kb 超质粒 DNA 在反应缓冲 (10 毫米 HEPES, pH 7.5, 110 毫米氯化钠, 5 mm MgSO₄, 4 μ m ZnCl₂, 10 毫米的数码化), 最后的体积为15μ l。孵育在37˚C 为90分钟, 包括一个没有 PFV 的负控制。
   1. 停止反应与1毫克/毫升蛋白酶 K (20 毫克/毫升的股票溶液) 和 0.5% SDS (10% 库存溶液)。孵育在37° c 为 1 h. 样品可贮存在-20 ° c 供以后分析。
2. 准备一个125毫升凝胶1% 重量每体积 (瓦特/v) 琼脂糖在1x 泰式缓冲器 (40 毫米三醋酸盐, 1 毫米 EDTA) 与0.1 µg/毫升溴溴化物 (10 毫克/毫升库存解决方案)¹³。融化琼脂糖溶液, 倒入15厘米 x 10 cm 凝胶铸造托盘。插入一个15井梳子与5毫米宽, 0.75 毫米厚实的井。与1.5 毫米厚井相比, 薄井具有更好的带分辨率。允许凝胶在室温下凝固。
   1. 用0.1 µg/毫升溴溴化液浸泡在1x 泰的凝胶中。加入3.5 μ l 6x 负载染料 (50% 甘油, 0.15% 橙 G 染料) 的核酸测定反应。将整个卷装入凝胶。在恒定电压下运行凝胶, 10 伏每 cm (100 V) 在环境温度为 1 h 或直到橙色 G 染料前面到达胶凝体的末端。
3. 立即图像琼脂糖凝胶与荧光扫描仪设置检测溴溴化物。线性 dna 应该以 3 kb 的大小运行, 超的 dna 应该跑得更快 (〜 2 kb), 而松弛的圆 dna 应该运行得更慢 (〜 3.5 kb)。
   1. 利用图像分析软件, 计算各车道超、线性、松弛圆质粒的像素体积。调用像素卷的总和为这三脱氧核糖核酸形成 "总脱氧核糖核酸" 价值并且使用它计算线性和宽松圈子的百分比。例如, 松弛圆的像素体积除以该车道中的总 DNA 像素值, 乘以这个数100来确定一个百分比。含有污染核酸的分数与负控制相比, 显示的线性和松弛圆的百分比更高。
4. 结合肝素琼脂分数, 不显示污染核酸活动。透析在10毫米 6-8 kDa 分子量截止 (分子) 透析管在4° c 过夜对1毫米的 50 L 的-HCl, pH 7.5, 200 毫米氯化钠, 50 μ m ZnCl 2, 10 毫米.
5. 从透析管中回收样品中的无核酸 PFV。测量一个₂₈₀并计算最终的蛋白质浓度。液氮中的分和冻结。商店等分在-80 ° c。

结果

重组 PFV 中经常被细菌核酸¹污染。生化积分测定取决于超质粒 DNA 转化为松弛圆和线性产品的定量。污染核酸的存在可能导致这些化验的虚假定量。在大肠杆菌(图 1) 中, 首先用镍亲和色谱 (图 2) 对 PFV 的表达式进行了 hexahistidine 标记。与几乎纯 PFV 的分数相结合, hexahistidine 标记由蛋白酶劈开。我们已经确定, PFV 和污染核酸有不?...

讨论

与 dna 相互作用的重组蛋白, 如 dna 修复蛋白, 单分子显微镜应用的氧清除剂, 或逆转录病毒 integrases, 应无污染细菌核酸^2,3。这些污染物可能会混淆的解释结果在散装生物化学或单一分子化验。

我们发现, 细菌核酸经常与 PFV 一起净化。然而, PFV 在显示一种亲和力的肝素琼脂, 是容易区分的细菌核酸污染物¹。制备无核...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
LB broth	EMD biosciences	1.10285.0500
Ampicillin	Amresco	0339
Chloramphenicol	Amresco	0230
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
IPTG	Denville Scientific	CI8280
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF	Amresco	0754
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
DTT	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
MgSO4	Amresco	0662
Agarose	Denville Scientific	CA3510
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glycerol	Fisher Scientific	G37-20
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01
HRV14 3C protease	EMD Chemicals	71493-3