Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

Zusammenfassung

Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Zusammenfassung

Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.

Einleitung

Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)¹ isoliert ^{, 2 , 3}.

Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA, geklaut oder lineare Produkte als Maß für die Aktivität⁴. Im zellulären Infektion tritt IN die beiden Enden der viralen DNA an die Host-Chromatin-⁵. Jedem Ende Beitritt Reaktion wird als Strang Transfer bezeichnet. Assays von rekombinanten IN Aktivität kann beitreten zwei DNA-Oligomere imitiert die virale cDNA zu einem Ziel DNA in einem abgestimmten Integration Reaktion^4,5,6,7,8endet. Alternativ kann rekombinante IN nur einem DNA-Ende nicht physiologisch relevanten halbe Seite Integration Reaktion^9,10teilnehmen. Wenn supercoiled Plasmid-DNA das Ziel der ist Integration, abgestimmte Integration sind Produkte linearisiert DNA und eine halbe Seite Integrationsprodukte sind entspannt Kreise. Diese Reaktionsprodukte sind durch ihre relative Mobilität während Agarose-Gel-Elektrophorese¹identifiziert. Wenn die rekombinante IN einen kontaminierenden Nuklease verfügt, werden falsche entspannt Kreise oder eine möglicherweise linearisierten Plasmid verwirrend die experimentellen Ergebnisse. Virale DNA-Oligomere können Eindringmittel markiert werden, um schlüssig Integrationsprodukte, im Gegensatz zu Nuklease Produkten identifizieren. Jedoch bevorzugt stark supercoiled DNA Ziele; der Verlust von supercoiled Plasmid entspannt Kreise oder lineare DNA von kontaminierenden Nuklease Labelling Ergebnisse und Interpretation von Daten¹¹. So ist es zwingend notwendig, um bakterielle Nukleasen von Retroviren IN Vorbereitungen zu entfernen.

PFV IN hat eine unterschiedliche Affinität zu Heparin-Sepharose im Vergleich zu den bakteriellen Nuklease-¹. PFV IN und der Nuklease können durch einen linearen Farbverlauf Elution von Heparin Sepharose abgetrennt werden. Die Nuklease ist nicht ohne weiteres durch eine ultraviolette (UV)-Extinktion auf 280 nm Höhepunkt oder analytische Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erkannt. Stattdessen wird der Nuklease durch eine Nuklease Aktivität Assay beschäftigt die Umwandlung von supercoiled Plasmid zu entspannt Kreise oder lineare Produkte erkannt. Jede Fraktion nach Heparin-Sepharose-Chromatographie wird für Nuklease Aktivität getestet. PFV IN und der Nuklease Verunreinigung haben keinen Unterschied in der Affinität für Mono-Q Anion Harz. Es gibt einen kleinen Unterschied in Affinität für Mono-S kation Harz. Jedoch würde die Mono-S-Auflösung der bakteriellen Nuklease und PFV IN effiziente Trennung der Proteine nicht zulassen. Letztlich bietet die beste Trennung von bakteriellen Nuklease aus PFV IN Heparin Sepharose Affinitätsreinigung und hat den Vorteil der unbegrenzten Ladevolumen.

Tests für kontaminierende Nuklease Aktivität kann an andere Proteine angepasst werden. Das Protein des Interesses haben wahrscheinlich alternative Affinität Eigenschaften als PFV IN; der Unterschied in der bindenden Eigenschaften des Proteins des Interesses und der Nuklease Verunreinigung muss empirisch ermittelt werden. Diese Methodik zur Ermittlung der Nuklease Kontamination kann an anderen Harzen einschließlich Mono-S kation oder Anion Austausch Harze Mono-Q angepasst werden. Affinität und Ionenaustausch Harze können eine zuverlässige Methode um eine rekombinante Protein des Interesses von kontaminierenden Nukleasen ohne Grenzen auf dem Datenträger des Proteins während der Chromatographie isolieren anbieten.

Protokoll

(1) induzieren PFV im Ausdruck in E. Coli

1. 20 μL der E. Coli BL21(DE3) pLysS 1 μL des PFV IN Expressionsplasmid (10 ng/μl) hinzufügen (20 μl aliquoten von kommerziell verfügbaren Zellen hat > 2 x 10⁶ KBE/µg Plasmid) in einer 1,5 mL Tube. Mit dem Finger tippen oder streichen das Rohr mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 5 min auf Eis.
   1. Hitze-Schock für genau 30 s in einem 42 ° c Wasserbad und dann sofort um zu Eis für 2 min zurück.
   2. Fügen Sie 80 μl Raumtemperatur super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien. Inkubation für 1 h bei 37 ° c mit 225 Umdrehungen pro Minute (u/min) schütteln.
   3. Platte 25 μL der Mischung auf einer 100 x 15 mm Petrischale mit 25 mL Brühe (LB) Agar Luria (1 L LB-Agar: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g Agar) und 100 μg/mL Ampicillin (100 mg/mL Stammlösung).
   4. Die verbleibenden 75 μL der transformierten Zellen auf eine zweite identische Platte-Platte. Inkubieren Sie die Platten mit Deckel über Nacht bei 37 ° c
2. Abrufen der Platten der transformierten E. Coli. Verwenden Sie eine einzige Kolonie 3 mL LB impfen (1 L LB: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefe Extrakt) mit 100 μg/mL Ampicillin in einem Rohr 14 mL Rundboden Polypropylen Kultur ergänzt. ~ 8 h bei 37 ° c mit schütteln 225 u/min inkubieren.
   1. 50 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol (34 mg/mL Stammlösung) in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben ergänzt fügen Sie die 3 mL Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln 225 u/min.
   2. Übertragen Sie 53 mL Kultur auf 1 L LB, 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol in einem 4 L-Erlenmeyer-Kolben. Inkubation bei 37 ° C mit 225 u/min schütteln.
   3. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) der Kultur in regelmäßigen Abständen. Zunächst prüfen der Kultur OD₆₀₀ alle h. Da die Kultur der gewünschten OD₆₀₀erreicht, überprüfen Sie alle 15 min nicht überwuchern. Wird die Kultur eines OD₆₀₀ zwischen 0,9 und 1,0. Übertragen Sie die Flasche auf ein Eisbad und wirbeln um die Temperatur der Kultur zu reduzieren.
3. Übertragen Sie 1 mL der Kultur auf eine 1,5 mL-Tube für eine spätere Analyse von denaturierenden SDS-PAGE-Analyse.
   1. Pellet-Zellen in der 1,5 mL Tube durch Zentrifugation für 1 min in einem Microfuge bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet in 150 μL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Pipettieren aufzuwirbeln. Die PBS kann mit oder ohne CaCl₂ und MgCl₂sein.
   2. Fügen Sie 150 μL 2 x Probenpuffer SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2 % SDS, 30 % Glycerin, 15 % β-Mercaptoethanol (βME), 0,0018 % Bromophenol blue) durch Pipettieren oder Vortex mischen. Kochen für 3 min. Store bei-20 ° C.
4. Die Bakterienkultur hinzufügen: eine Endkonzentration von 0,25 mM Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M Stammlösung) und 50 μM ZnCl₂ (50 mM Stammlösung). IPTG induziert die Expression des Gens PFV IN aus dem T7-Promotor und ZnCl₂ wird als eine Ergänzung für die korrekte Faltung einer amino terminal Zink-Finger-Domäne im PFV IN. Incubate die Kultur bei 25 ° C mit Schütteln bei 225 u/min für 4 Std. sofort hinzugefügt übertragen Sie den Kolben auf ein Eisbad. 1 mL der Kultur für die SDS-PAGE-Analyse nach dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben in 1.3 zu retten.
5. Übertragen Sie die Bakterienkultur auf entsprechend großen Zentrifuge Flaschen. Beispielsweise kann eine 1 L-Kultur auf vier sterile Einweg-250 mL konischen Boden aus Polypropylen Flaschen übertragen werden. Drehen Sie die Flaschen in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge bei 3000 X g für 20 min bei 4 ° c. Verwerfen Sie Überstände durch Gießen.
   1. Aufschwemmen Sie aller die Pellets aus einem 1 L Bakterienkultur in einem Gesamtvolumen von 25 mL (6,25 mL pro Flasche) kaltem PBS (mit oder ohne CaCl₂ und MgCl₂) durch pipettieren. Kombinieren und die bakterielle Suspensionen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Drehen Sie in einer gekühlten Zentrifuge bei 3.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand durch Eingießen oder Pipettieren zu verwerfen.
6. Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, und 500 μM Phenylmethylsulfanoxide (PMSF) Protease-Hemmer) durch pipettieren. Snap freeze das Pellet indem man das Rohr in eine Dewar-Flasche mit flüssigem Stickstoff ausreicht, um die 50 mL-Tube zu tauchen. Sorgfältig entfernen Sie das Rohr aus flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C.
   Hinweis: Bakterielle Pellets können für mehrere Monate bei-80 ° c gelagert werden Wir haben gesehen, kein Verlust des aktiven Proteins nach-80 ° C Lagerung für zwei Jahre.
7. Die Pre-Induktion und Post-Induktion Proben analysieren von 8,3 cm breit, 7,3 cm hoch, 0,75 mm dick SDS-PAGE Gelen mit 1,5 mL 6 % Polyacrylamid Stapeln Schicht (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED) und 3,5 mL 10 % Polyacrylamid-Schicht zu lösen (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED)¹².
   1. Fügen Sie nach dem Gießen des stapelnden Gels, 10 gut Kamm. Wenn das Gel polymerisiert hat, montieren Sie die Seite Apparat, und fügen Sie ausreichend SDS-PAGE laufenden Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS hinzu).
   2. Last 10 μL jeder Probe und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie mit 16,5 V/cm bis Farbstoff vorne den Boden des Gels, ca. 60 min erreicht.
   3. Zerlegen Sie die Gel-Platten und übertragen Sie das Gel auf eine Plastikwanne. Fügen Sie Coomassie Brilliant Blue Färbelösung (0,1 % Coomassie brilliant blue R-250, 40 % Methanol, 10 % Essigsäure) großzügig bedecken das Gel und Flecken für 20 min bei Raumtemperatur.
   4. Durch das Gießen der Färbelösung zu entfernen und ersetzen mit destain Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure) bis Bands gut sichtbar sind. Entfernen Sie die destaining Lösung durch Gießen und mit entionisiertem Wasser ersetzen. PFV IN sollte leicht in der Post-Induktion Probe identifiziert werden. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag hat ein Molekulargewicht von 47374 Da.
   5. Wenn PFV IN nicht angezeigt wird, wiederholen Sie die Induktion, beginnend mit einer unterschiedlichen Kolonie von einem der Transformation Platten.

(2) Nickel Affinitätschromatographie

1. Eine bakterielle Pellet auf Eis auftauen.
   Hinweis: Dies dauert viel Zeit (ca. 2-3 h). Wenn die Tablette für eine Zelle Gülle aufgetaut ist, fügen Sie eine zusätzliche 500 μM PMSF (100 mM Stammlösung).
2. Halten Sie die 50 mL-Tube von Bakterien Gülle auf Eis. Beschallen die Bakterien bei 30 % Amplitude für 30 s (1 s, 1 s aus) pro Kugel abgeleitet von 1 L Kultur mit einem Sonikator mit einem 0,5 Zoll Durchmesser Bio Horn mit 0,125 Zoll Durchmesser verjüngt, Mikrospitze, einer Frequenz von 20 kHz und maximale Leistung von 400 w.
3. Übertragen Sie die Zellprobe auf einem kalten Ultrazentrifugen Rohr. Verwenden Sie Polycarbonat Flasche Baugruppen (Durchmesser 25 mm, 89 mm Höhe) mit einem festen Winkel Rotor Typ 60 Ti kompatibel. Alternative Röhren und Rotoren können verwendet werden, wenn die gleiche Kraft der Gravitation erreicht wird. Spin-120.000 x g für 60 min bei 4 ° C. Es sollte eine offensichtliche Pellet. Der Überstand haben eine gelbe Farbe.
4. Den Überstand durch Eingießen oder eine kalt 50 mL konische Röhrchen pipettieren zu übertragen. Beachten Sie die Lautstärke; Dieses Volumen sollte etwa das Volumen der Wiederfreisetzung Puffer vor dem Snap Einfrieren verwendet werden. Wenn der Überstand zähflüssig ist, kann es durch bakterielle DNA kontaminiert sein die die Chromatographiesäule verstopfen könnte. Wiederholen Sie in diesem Fall die Ultrazentrifugation um die bakterielle DNA pellet.
5. Bereiten Sie 500 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) und 500 mL Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol).
   Hinweis: In diesem Protokoll halten Sie das schnelle Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System, alle Puffer und die Probe bei 4 ° C in einem kalten Raum.
   1. Sterilfilter Puffer A und B mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer A und Puffer B bzw.. Durchfluss 90 % Puffer A und 10 % Puffer B durch das System bis zur Stabilisierung der Leitfähigkeit und UV-Lesungen. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Verwenden Sie einen Durchfluss von 5 mL/min mit maximalem Druck maximal 1,0 MPa.
6. Bereiten Sie eine 110 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1,5 mL Nickel-geladene Harz (maximale Bindungskapazität 50 mg/mL, max. Druck 1 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert.
7. Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B (20 mM Imidazol) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein₂₈₀). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.
8. Laden Sie die Protein-Probe (~ 10 mL pro Kugel) in die Spalte mit einer Durchflussrate von 0,15 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Sammeln der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
   1. Waschen Sie die Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B. sammeln die Wäsche in einer 50 mL-Tube. Die Proteine mit einer 20 mL lineare Steigung von 10 % bis 100 % Puffer B (20 mM bis 200 mM Imidazol) eluieren.
   2. Schließlich waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer B (200 mM Imidazol). Sammeln die gradient und letzte Wäsche in 0,27 mL Fraktionen.
9. Kombinieren Sie 15 μl Probenpuffer 2 X SDS-PAGE mit 15 μl der Strömung durch Waschen und Peak A₂₈₀ Brüche. Kochen Sie die Proben 3 min.
   1. Bereiten Sie zwei 10 %, die SDS-PAGE Gelen bereits in Schritt 1.6 außer mit 15 gut kämmen beschrieben. Last 10 μL jeder Probe, die Gele und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie, färben Sie, und analysieren Sie die Gele zu, wie unter Punkt 1.6 beschrieben.
   2. Kombinieren Sie Brüche, die scheinbar fast reine PFV IN basierend auf visuelle Inspektion enthalten. Messen Sie das Volumen durch pipettieren, in der Regel 8 bis 10 mL.
   3. Mit einem Spektralphotometer, Messen Sie A₂₈₀ der kombinierten Fraktionen und berechnen Sie die Gesamtmenge des PFV IN Protein; unsere typische Ausbeute ist ~ 10 mg / L der induzierten Kultur. Der vom Aussterben bedroht-Koeffizient der PFV IN mit dem Hexahistidine-Tag ist 59360 cm^-1 M^-1.
10. Um den Hexahistidine-Tag entfernen, ergänzen Sie die PFV IN mit 10 mM Dithiothreitol (DTT, Stammlösung 1 M) und 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M-Stammlösung). Fügen Sie 15 μg des menschlichen Rhinovirus (HRV) 3C Protease pro mg PFV IN. Incubate bei 4 ° c über Nacht. Spaltung verringert das PFV IN Molekulargewicht von 47374 Da 44394 da und durch 10 % SDS-PAGE-Analyse überprüft werden kann.

(3) Heparin Affinitätschromatographie

1. Bereiten Sie 250 mL Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF) und 250 mL Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
   Hinweis: In diesem Protokoll werden die FPLC System, Puffer und Probe in einem Kühlraum bei 4 ° c gehalten.
   1. Sterilfilter Puffer C und D mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer C und Puffer D bzw.. Fließen Sie 80 % Puffer C und 20 % Puffer D durch das System, bis die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Wir verwenden routinemäßig einen Durchfluss von 5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 1,0 MPa.
2. Bereiten Sie eine 80 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1 mL Heparin-Sepharose-Harz (maximale Bindungskapazität 2,0 mg Rinder antithrombin III pro mL Harz; max. Druck 1,4 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument.
   1. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck-Limit von 1 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein₂₈₀). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.
3. Reduzieren Sie die NaCl-Konzentration der Probe PFV IN bis zu 200 mM durch Zugabe von 1,5 Volumen Puffer C. Fügen Sie beispielsweise 15 mL Puffer C bis 10 mL PFV Zoll Die Gesamtmenge ist in der Regel ~ 25 mL.
4. Belastung der verdünnten Probe der PFV IN der Heparin-Sepharose-Spalte bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit einem maximalen Druck 1,0 MPa zu begrenzen. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Der Durchfluss in einem 50 mL konische Röhrchen zu sammeln.
   1. Waschen der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl), sammeln die Wäsche in einem 50 mL konische Röhrchen. Die Spalte mit einer 30 mL lineare Steigung von 20 % bis 100 % Puffer D (200 mM bis 1 M NaCl) eluieren.
   2. Waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer D. sammeln die Steigung und endgültige Wash in 0,37 mL Fraktionen.
5. Last, Durchströmung, waschen und Brüche zu analysieren, um 8 % SDS-PAGE wie in 2,9 beschrieben. PFV IN nach Spaltung des Hexahistidine Tags hat ein Molekulargewicht von 44394 Da und die vom Aussterben bedroht-Koeffizient bleibt 59360 cm^-1 M^-1 ohne den Hexahistidine Tag. Speichern Sie alle Fraktionen bei 4 ° c bis zur Fertigstellung eines Nuklease-Assays.

4. Nuklease-assay

1. Identifizieren von Heparin-Sepharose-Fraktionen, die scheinbar fast reine PFV Zoll kombinieren 3 μl Heparin Bruchteil und 50 enthalten ng 3 kb supercoiled Plasmid-DNA in Reaktion Puffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO₄, 4 μM ZnCl₂ 10 mM DTT) mit einem Endvolumen von 15 μl. Inkubation bei 37 ° c für 90 min. Include eine Negativkontrolle mit keine PFV IN.
   1. Stoppen Sie die Reaktion mit 1 mg/mL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,5 % SDS (10 % Stammlösung). Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde Proben bei-20 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden können.
2. Bereiten Sie eine Gel 125 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose in 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid (10 mg/mL Stammlösung)¹³. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung und gießen Sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15 gut Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Wells. Dünne Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen.
   1. Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid. Die Nuklease Assay Reaktionen fügen Sie 3,5 μl 6 x laden Farbstoff (50 % Glycerin, 0,15 % Orange G Farbstoff hinzu). Laden Sie das gesamte Volumen, das Gel. Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 Volt pro cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.
3. Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner Interkalation Bromid überschreitet. Lineare DNA sollte maßhaltig bei 3 kb laufen, supercoiled DNA laufen schneller (~ 2 kb) und entspannten Kreis DNA läuft langsamer (~3.5 kb).
   1. Berechnen Sie Bildanalyse-Software verwenden, die Pixel Volumen des Plasmids in jeder Bahn supercoiled, lineare und entspannten Kreis. Rufen Sie die Summe des Pixels Bände für diese drei DNA-Formen der "Gesamt-DNA" schätzen und es verwenden, um den Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise berechnen. Z. B. gliedert sich die Pixel-Lautstärke entspannt Kreise durch DNA-Pixel den Gesamtwert in dieser Spur, multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um einen Prozentsatz zu ermitteln. Brüche, die kontaminierenden Nuklease enthalten zeigen einen höheren Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise im Vergleich zu der negativen Kontrolle.
4. Kombinieren Sie Heparin-Sepharose-Fraktionen, die nicht kontaminierenden Nuklease Aktivität angezeigt werden. Dialyse in 10 mm 6-8 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) Dialyse Schläuche bei 4 ° C über Nacht gegen 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl₂, 10 mM DTT, 20 % Glycerin.
5. Der Nuklease-freie PFV IN Sample von Dialyse Schläuche zu erholen. Messen Sie die A₂₈₀ und berechnen Sie die endgültigen Proteinkonzentration. Aliquoten und Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.

Ergebnisse

Rekombinante PFV IN ist oft mit einer bakteriellen Nuklease¹kontaminiert. Biochemische Integration Tests hängen die Quantifizierung der Umwandlung von supercoiled Plasmid DNA zu entspannten Kreisen und lineare Produkte. Das Vorhandensein von kontaminierenden Nuklease könnten falsche Quantifizierung dieser Assays. Ausdruck von PFV IN mit einem Hexahistidine Tag in E. Coli (Abbildung 1) induziert und zuerst gereinigt durch Nickel-Affinitätschromatographie (<...

Diskussion

Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen^2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.

Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
LB broth	EMD biosciences	1.10285.0500
Ampicillin	Amresco	0339
Chloramphenicol	Amresco	0230
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
IPTG	Denville Scientific	CI8280
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF	Amresco	0754
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
DTT	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
MgSO4	Amresco	0662
Agarose	Denville Scientific	CA3510
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glycerol	Fisher Scientific	G37-20
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01
HRV14 3C protease	EMD Chemicals	71493-3