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摘要

我们提出一种有效和可重复的方法, 分离和培养胚胎和产后脑组织中的神经祖细胞染色质沉淀 (芯片) 的组蛋白3赖氨酸 79 dimethylation (H3K79me2)-一个组蛋白标记位于组蛋白3的球状域。

摘要

大脑发育是一个复杂的过程, 它是由来说的梯度和不同的转录程序控制在颞空间的方式。此外, 后生染色质修饰, 如组蛋白甲基化, 有一个重要的作用, 建立和维护特定的细胞命运在这个过程中。大多数组蛋白甲基化发生在灵活的组蛋白尾部, 这是组蛋白修饰剂、橡皮擦和组蛋白的阅读蛋白。相比之下, H3K79 甲基化位于组蛋白3的球状领域, 并与不同的发育功能有牵连。H3K79 甲基化是进化保守的, 可以从智人到酿酒酵母的种类繁多的物种中发现。改变发生在不同的细胞数量的生物体内, 包括神经祖。H3K79 甲基化在组蛋白3的球状域中的位置使得难以评估。在这里, 我们提出的方法分离和培养皮层祖细胞 (党) 从胚胎皮质脑组织 (E11.5-E14.5) 或小脑颗粒神经元祖 (CGNPs) 从产后组织 (P5-P7), 并有效 immunoprecipitateH3K79me2 定量 PCR (qPCR) 和全基因组测序。

引言

大脑的感官、运动和认知功能非常复杂, 容易受到物理和环境变化的影响。大脑由后、中、前脑的三一般部分组成, 它们是紧密相连的。前脑内, 端可分为背部端 (DT) 和腹端 (VT)。小鼠的 DT 由六皮质层组成, 它们是在 E11.5 和 E18.5 之间形成的, 以 "内而外" 的方式1。VT 包括节主教在发育中, 后来形成基底节2,3。几种细胞类型可以归类在哺乳动物中枢神经系统, 如神经元, 星形胶质细胞, 或突4, 在颞空间的方式5发展。首先, 神经祖细胞 (npc) 产生不同类型的神经元, 神经元在 VT, 和投射神经元在 DT, 后来到神经胶质细胞 (例如, 星形细胞6)。在皮质发育过程中, 首先形成了含有卡哈尔 Retzius 细胞的最浅层 (I 层)。然后, 在 E12.5 和 E14.5 之间, npc 产生更深的神经元层 (VI, V), 而在14.5 和16.5 之间, 祖细胞引起上层 (IV-II) 神经元7,8。神经元的身份是由不同的形态诱导的颞空间转录程序和另外的后生程序2指定的。

小脑, 这是牵连在运动协调, 位于后脑和发展之间的 E10 和粗略 P20 在小鼠9。它包含小脑皮质和小脑核10。成人小脑皮质包括三层, 最外层的分子层, 浦肯野细胞层, 和包含颗粒状神经元的最里层的颗粒层10。小脑颗粒细胞是最小的神经元, 代表了脊椎动物大脑中大约80% 的神经元11。它们从位于外部生发区的前驱体发展而来, 并通过浦肯野细胞层迁移到它们的目标12。象在端, 小脑的发展由几个重要来说调控, 有具体时间和空间相关的作用和创始被定义的转录节目10。

皮质和小脑层的发育由特定来说的转录表达控制, 因此, 由 DNA 的染色质状态。在一个简化的观点, 染色质状态可以被划分成染色质作为转录活跃和异作为转录沈默区域。核作为染色质的基本单位, 包含了每个核心组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 的两个拷贝, 周围有147碱基对 DNA13。组蛋白是高度后翻译修饰的甲基化, 乙酰化, 磷酸, 泛, sumo, ADP adp-, 脱, 和脯氨酸异构化反应14,15。组蛋白赖氨酸甲基化被认为是最稳定的蛋白修饰, 控制转录, 复制, 重组16, DNA 损伤的反应,17, 和基因印记18。Lysines 可以是单、di 或三甲基化的19 , 并且不仅出现在可访问的组蛋白尾部, 而且还显示在组组的球状域中20。具体的 h3k4 在 H3K4 和 H3K36 主要与染色质, 具体 h3k4 在 H3K9, H3K27, 或 H4K20 主要在异地区发现, 虽然所有残留物位于组蛋白尾部14, 19,21。H3K79 甲基化位于组蛋白球状域内, 并与转录活性有关, 但也与转录惰性基因的区域22有关。由于在酵母、小牛胸腺、鸡肉和人类23中观察到了这种改变, 因此在进化上是保守的。H3K79 单, di, 和 trimethylation (H3K79me1, me2, me3) 是由组蛋白甲基 DOT1L24,25和核集合域含蛋白质 2 (Nsd2)26。DOT1L 与增殖、DNA 修复和细胞 reprograming27有牵连。Dot1l在小鼠中的丢失导致在发育阶段 E10.528,29周围的产前死亡。在心脏发育和 myocardiocyte 分化期间, DOT1L 是基因表达调控的关键30。在中枢神经系统中, DOT1L 功能可能牵连神经管发育31, 它涉及在前脑发育32期间抑制Tbr1表达, 并可在 ER 应力调节中起作用响应基因33。H3K79me 的上下文相关激活或镇压行动, 特别是与在体内情况象中央神经系统的发展, 是到目前为止仅部份地被了解的32。由于 H3K79 甲基化位于组蛋白3的球状域中, 因此与灵活的组蛋白尾23的修饰相比, 阻的可访问性较差。为了了解 H3K79 甲基化的作用, 需要可靠和可重复的分析方法来确定其位置和基因组环境。在本方法中, 我们提出了不同的神经祖细胞的分离方法 (党用于小脑的皮质和 CGNPs), 有效的 DOT1L 抑制剂治疗, 以及在不同时间通过 qPCR 或测序来分析 H3K79 甲基化的芯片方法在皮质和小脑发育过程中的点。有关协议及其可能性的概述, 请参见图 1。

研究方案

弗莱堡大学的动物福利委员会和地方当局批准了以下协议中提到的所有动物实验 (G12/13, G16/11)。

1. 准备工作

  1. 党分离制剂
    1. 建立定时交配, 以获得胚胎在不同阶段的皮层发育 (E11.5 和 E14.5)。使用小鼠的应变 NMRI (海军医学研究所), 这是至少8周的老。交配后, 考虑一个积极的阴道堵塞在 E0.5。
    2. 要有足够的材料, 在 E12.5 或 E14.5 的皮质上用一小块 NMRI 鼠 H3K79me2 芯片。对于以后的胚胎阶段, 用一小块做更多的芯片分析 (平均 NMRI:10 胚胎)。
    3. 冷 Hank´s 平衡盐溶液 (HBSS) 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 到4° c (长期存贮在 RT)。
    4. 平衡4° c 储存的胰蛋白酶-EDTA (0.05% w/v) 到37° c。
    5. 准备皮质细胞培养基 (CCM):补充培养基的神经元 (见材料表) 的最终浓度为 2% (v/v) B-27 补充, 5 µg/毫升的脂蛋白-转铁蛋白, 1 µg/毫升谷胱甘肽, 0.5 毫米 l-谷氨酰胺, 0.8 µg/毫升超氧化物歧化酶, 1% (v/v)青霉素-链霉素-霉素抗生素混合物。储存在4° c。为实验, 平衡介质到37° c。
    6. 解冻胎儿小牛血清 (FCS), 分它 (50 毫升每) 和平衡一分到37° c (长期存贮在-20 ° c)。
    7. 在 H2O 中为单元格区域性准备 dnasei 1 (10 毫克/毫升) 的库存。商店等分在-20 ° c。
    8. 如果需要, 溶解特定的 DOT1L 抑制剂 EPZ-5676 或 SGC0946 在亚甲基亚砜的股票浓度为100毫米。将1-5 µM 的末端浓度应用于0天的细胞, 每两天重新涂抹一次抑制剂。
    9. 为 CPC 培养, 涂层细胞培养板材 (6 井或12井) 与聚 l-鸟氨酸氢溴酸盐 (1 毫克/毫升在150毫米硼酸酸碱度 8.4) 为至少 1 h 在 RT 和之后与层粘连蛋白 (1 毫克/毫升) 在 CCM 媒介在37° c 隔夜。
  2. CGNP 分离制剂
    1. 组织适当的小鼠交配, 以产生 P5-P7 的动物来隔离小脑 (每个芯片和条件3-5 动物)。
    2. 在 HBSS 缓冲液中加入6毫克/毫升葡萄糖, 准备 HBSS/葡萄糖。
    3. 制备 CGNP 细胞培养基 (CGM), 加入 1% (v/v) N2 补充剂, 1% (v/v) 青霉素-链霉素-霉素, 25 毫米氯化钾和 10% FCS 到 DMEM-F12。为 CGNP 耕种准备 CGM 媒介, 不用 FCS, 但包括0.6 µg/毫升声波刺猬 (嘘) (cgm-嘘) 和平衡它到37° c, 当需要时。
    4. 6层细胞培养板, 100 µg/毫升的聚-d-赖氨酸1-2 小时用于胶质细胞去除。事后冲洗两次, 无菌 ddH2O, 让盘子晾干。在4° c 的最大一周贮存板材。
    5. 为培养 CGNPs 外套 6-好细胞培养板材与聚 l-鸟氨酸 (0.1 毫克/毫升) 在4° c 隔夜。之后洗涤两次与 H2O 为细胞文化并且让板材烘干。
      注: 板材可在4° c 下贮存最多一周。
    6. 准备0.025% 胰蛋白酶 (w/v) 在 HBSS/葡萄糖和平衡它到37° c, 当需要时。
  3. H3K79me2 片的制备
    1. 在交联染色质前, 准备好粉煤灰 (PBS 1%, pH 8)。在微波中制备50毫升 PBS, 最大65° c。在不断搅拌期间添加0.5 毫克粉煤灰到 PBS。然后加入50µL 10 M 氢氧化钠, 等到粉煤灰溶解。之后, 添加42.5 µL HCl (37% v/v) 以获得 pH 值8。再次验证 pH 值, 然后让1% 的粉煤灰溶液到达 RT。
    2. 在无菌 ddH 中分别制备核糖核酸 (1 毫克/毫升) 和蛋白酶 K (20 µg/µL), 在-20 ° c 下储存等分.
    3. 准备以下缓冲器和试剂: PBS 含有0.02% 吐温, 裂解缓冲, 甘氨酸, 稀释缓冲, 芯片缓冲器 1, 芯片缓冲器 2, 芯片缓冲器 3, 和 TE 缓冲器, 并存储在4° c。每次准备洗脱缓冲器。
      1. 准备包含0.02% 补间的 PBS。最多一周在4° c 存储。
      2. 在 pH 8.0、10毫米 EDTA、1% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和1x 蛋白酶抑制剂上制备裂解缓冲液。
      3. 准备2.5 米甘氨酸。
      4. 用20毫米的 pH 值 8.0, 150 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) 海卫 X-100, 0.25% (w/v) SDS, 和1x 蛋白酶抑制剂准备稀释缓冲液。
      5. 在 pH 8.0、150毫米氯化钠、2毫米 EDTA、1% (v/v) 海卫 X-100 和 0.2% (w/v) SDS 上使用 20 mm 的三毫米制备芯片缓冲器1。
      6. 准备芯片缓冲器2使用20毫米的 pH 8.0, 500 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) 海卫 X-100 和 0.2% (w/v) SDS。
      7. 准备芯片缓冲器3使用20毫米的 pH 8.0, 250 毫米氯化, 2 毫米 EDTA, 1% (v/v) NP-40 和 1% (w/v) SDS。
      8. 使用20毫米的三 pH 8.0 和2毫米 EDTA 制备 TE 缓冲器。
      9. 准备新的洗脱缓冲液, 含 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3。

2. 神经祖脑组织的分离

  1. 党的分离与可选栽培
    1. 通过宫颈脱位安乐妊娠动物, 将胚胎移植到冰冷的 HBSS。
    2. 用剪刀将颅骨取出, 然后将大脑隔离, 然后用小镊子将所有其他脑部部分移除, 如果适用, 用小镊子将皮质 (整个、DT 或 VT) 移除, 如果必要的小剪刀在4° c 的15毫升管中, 将孤立的皮层储存在5毫升的 HBSS 缓冲液中。
    3. 离心分离的脑材料为5分钟在 1000 x g 和4° c。
    4. 用5毫升冰冷的 HBSS 和质用1毫升的吸管尖移向上和向下清洗皮质。如有必要, 切下吸管尖端。
    5. 离心均匀的样品为5分钟在 1000 x g 和4° c。删除 HBSS。
    6. 添加3毫升胰蛋白酶和孵化样品5分钟在37° c。
    7. 添加1毫升 FCS, 5 毫升 CCM, 30 µL dnasei 1 的样品和质的样品与5毫升玻璃吸管移小心上下。
    8. 离心分离的细胞5分钟在 1000 x g 和4° c。丢弃上清, 添加5毫升 CCM, 并再次质样品。
    9. 稀释样品的分, 并与 Neubauer 计数室计数。每个胚胎的平均数量为 4.5 x 106细胞。为被隔绝的党的耕种继续步2.1.10。对于芯片, 立即进行步骤3。
    10. 为耕种, 党在聚 l-鸟氨酸 (0.1 毫克/毫升) 和层粘连蛋白 (1 毫克/毫升) 涂覆的盘子在密度在 8 x 104和 2.5 x 105细胞/cm2在 CCM 培养基和孵育他们在37° c, 5% CO2, 和100% 相对湿度。
    11. 由于党开始分化成神经细胞在细胞培养 (在大约4天以后), 考虑解剖日期作为天在体外0 (天 0)。为了更长的耕种期限, 每第四天改变一半媒介以新鲜的 CCM 媒介。
    12. 应用1-5 µM SGC0946 或 EPZ5676 溶解在二甲基亚砜在0天 (4-5 小时后细胞隔离) 和刷新它每第二天。使用亚甲基亚砜作为对照治疗。如果需要, 通过标准免疫方法测试抑制剂处理的效率。
  2. CGNPs 的分离与可选栽培
    1. 用剪刀安乐 P5-7 动物。取出头皮皮肤, 打开头骨, 用小剪刀和镊子把大脑移走。分离小脑并将其转移到冰冷的 HBSS/葡萄糖。取出所有的脑膜和血管, 并将小脑转化为15毫升的 HBSS/葡萄糖的管子。
    2. 洗涤小脑三次与10毫升冰冷 HBSS/葡萄糖 (收集他们的离心在 650 x g 为5分钟, 在4° c) 和质小脑随后轻轻移向上和向下与1毫升吸管 (最大2-3 倍) 得到 0.5-1 mm3碎片.
    3. 在 HBSS/葡萄糖中加入5毫升的0.025% 胰蛋白酶, 并在37° c 水浴下恒温孵育15分钟. 通过加入5毫升 CGM 来停止消化, 并在650° c 以下5分钟的离心法中收集组织。
    4. 去除上清和研制的组织与1毫升吸管尖端在1毫升 CGM 和转移到一个新的15毫升管。
      注意: 避免气泡是很重要的。
      1. 加入5毫升 CGM 和孵化混合物2分钟的冰, 以解决组织残余物。将上清液转化为新的15毫升管。添加2毫升 CGM 到剩余的组织和重复研磨程序。
    5. 池清 (没有组织残余, 大约10毫升) 和离心机在 650 x g 5 分钟在4° c 收集小脑细胞。重10毫升 CGM 中的颗粒。
    6. 由于星形胶质细胞坚持更快, 更强的多聚-d-赖氨酸比 CGNPs, 板在100µg/毫升的聚-d-赖氨酸涂层 6-井板 (高达4毫升每井) 和孵化20分钟在37° c, 以消除星形胶质。
    7. 摇动盘子, 收集上清液。然后离心在 650 x g 为5分钟在4° c 在15毫升管。重10毫升 CGM 中的颗粒, 计数的细胞与 Neubauer 计数室。
      注: CGNPs 是圆形, 小, 并显示一个光晕时, 使用相衬显微镜成像。
    8. 如果需要, 种子的细胞在37° c 前预热 CGM 上的聚 l-鸟氨酸涂层板 (3 x 106细胞每 6-井) 和孵化他们在37° c, 5% CO2和100% 相对湿度。
      注意: 如果未执行播种, 请继续步骤3.1。
      1. 6-12 小时后, 将介质转换为 CGM-嘘。治疗隔离 CGNPs 6 小时 (或当改变为 CGM 嘘) 后, 与 DOT1L-inhibitor 和二甲基亚砜控制和更新它每第二天 (比较 2.1.12)。如果需要, 通过标准免疫方法测试抑制剂处理的效率。对于芯片, 继续步骤3.3。
        注意: 在盘子上留下 CGM (与 FBS) 将导致 CGNPs 分化为小脑颗粒神经元 (CGNs)。

3. 细胞固定和染色质剪切

注意: 如果单元格未被培养, 则执行步骤3.1 和 3.2, 如果它们正在进入步骤3.3。

  1. 通过离心收集细胞4分钟 1000 x g, 并添加1.3 毫升 PBS。将样品转移到1.5 毫升的管子。离心机为4分钟在 1000 x g 在4° c。用1.3 毫升 PBS 清洗样品两次。
  2. 关键步骤:添加350µL 1% 粉煤灰的样品和孵化5分钟, 在22° c。为了停止反应, 添加18.4 µL 甘氨酸和1毫升 PBS。离心样品5分钟在 1000 x g 在4° c。
    1. 用冰冷 PBS 洗两次样品。用离心法收集固定细胞5分钟, 在 1000 x g 和4° c。从现在起把样品放在冰上。
      注意: 固定时间必须精确5分钟才能获得最佳效果。不同的细胞数可能需要时间适应。
  3. 关键步骤:对培养的 CGNPs (或党), 添加多达1毫升1% 的粉煤灰直接到细胞培养板井。在22° c 的5分钟孵育后, 加入适量的甘氨酸和 PBS, 用刮板机收割细胞。
    1. 将细胞转化为1.5 毫升的管子, 并将样品离心5分钟, 在 1000 x g 和4° c。用冰冷 PBS 洗两次样品。在4° c 的 5 minat 1000 x g 的离心收集固定细胞。从现在起把样品放在冰上。
  4. 关键步骤:加入700µL 的裂解缓冲液 (+ 蛋白酶抑制剂), 在4° c 下孵育样品15分钟。涡流样品每5分钟切变裂解细胞的染色质 3 x 10 min 在 sonicator (三十年代脉冲, 三十年代暂停) 在最大力量。
    1. 确保每根管子的体积不超过350µL。每10分钟将样品涡旋, 用相衬显微镜检查残余核的裂解液。
      注意: 获得最佳剪切效果 (与图 1B比较) 以便以后进行分析是很重要的。在使用其他方法来剪切染色质的情况下, 优化剪切到染色质碎片大小之间的 200-500 bp。
  5. 颗粒细胞残余物为 10 min, 1.3万 x g, 4 ° c。使用上清 preclearing 步骤5.2。如有需要, 在-20 ° c 冻结样品以备日后使用。

4. 珠子和 Preclearing 的制备

  1. 洗涤45µL 蛋白质磁珠/芯片和20µL 磁珠/样品与1毫升冰冷 PBS 含有0.02% 吐温三次使用磁性立场。然后, 加入1毫升的冰冷 PBS 的珠子。
  2. 1毫升冰冷 PBS 和45µL 珠/芯片, 添加3µg 抗体/芯片 (H3K79me2 或兔 IgG)。在4° c 的转子上孵育样品以将抗体与念珠结合。根据抗体, 使用〜3µg 抗体/芯片。
  3. 用1毫升冰冷 PBS (含0.02% 吐温) 清洗抗体结合珠三次。添加适当的珠体积 (开始体积的磁珠使用) 冰冷 PBS 的洗涤抗体耦合珠。
  4. 添加600µL 稀释缓冲器和20µL 的洗涤磁珠的样品 preclearing (总体积1320µL) 和孵化2小时在4° c 的转子。使用磁性支架取出珠子。采取 5% (33 µL) 的裂解作为输入样本, 并冻结他们在-20 ° c。

5. 染色质沉淀

  1. 将 precleared 提取物分成两个管子 (大约643.5 µL), 加入相同体积的稀释缓冲液和抗体结合珠 (45 µL/样品;H3K79me2 或兔 IgG)。将样品在4° c 的一夜之间孵化。
  2. 用冰冷的芯片缓冲1、芯片缓冲器2和芯片缓冲器 3, 在一个旋转器的4° c 上分别洗涤10分钟的珠子。之后, 用 TE 缓冲器洗涤三次, 在4° c 的旋转器上5分钟。
  3. 洗在室温下, 用洗脱缓冲液在1小时内以 1400 rpm 在振动筛上。
  4. 添加10µg 核糖核酸 (1 毫克/毫升) 每片样品和5µg 到输入样品和孵化样品为30分钟在37° c (1400 rpm)。
  5. 添加100µg 蛋白酶 K (20 µg/µL) 每片样品和50µg 每输入和孵化过夜在65° c 在 1400 rpm。

6. 芯片样品的提纯

  1. 用 DNA 纯化试剂盒净化芯片和输入样品 (参见材料表)。当超过5µg 的 DNA 被期望时, 使用更多的纯化柱。洗样品与 2 x 15 µL 的 DNA 洗脱缓冲器提供的试剂盒。
  2. 通过使用可视化的荧光和 fluorospectrometer (请参见材料表) 对样本进行量化 (使用1µL)。

7. 通过 qPCR 分析芯片样品

  1. 对于 qPCR 分析的入门设计, 从集成基因组查看器 (IGV) 浏览器34中检索感兴趣的基因组序列。在一个基因的转录起始点周围设计底漆, 因为 H3K79me2 很可能位于那里。作为一个控制, 考虑非编码的基因组区域或区域大约 10 kb 上游的技术支助或 10 kb 下游的转录终端网站 (附加费)。
    1. 使用 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/70 和 200 bp 的产品尺寸和60° c 的最佳温度预设生成底漆。为试验目的, 使用在表 1中列出的基因组区域Aft4、Ddit3、 Scd1、 Aft3、和Npm1的引物。
  2. 测试新设计的底漆与以下 qPCR 程序, 主混合, 和退火温度梯度在58° c 和63° c 之间, 并且选择退火温度以最高的产品数量和质量。
    1. 应用 DNA 凝胶电泳控制预期的产品尺寸。对于 qPCR 分析, 请使用实时 PCR 检测系统 (请参阅材料表)。
    2. 准备主混合使用10µL dna 聚合酶主混合, 0.5 µL 底漆向前 (10 µM), 0.5 µL 底漆反向 (10 µM), 4 µL 核酸无水, 和5µL dna (1 ng/µL)。
    3. 使用2步 qPCR 程序如下: 5 分钟在95° c, 50x (三十年代在95° c, 三十年代在58° c-63 ° c) 和变性梯度经常在4° c。
  3. 创建一个稀释系列的基因组, 剪切, 纯化 DNA 样本 (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0.5 ng/µL, 0.25 ng/µL, 和 0.125 ng/µL) 和使用5µL 的效率测试使用 qPCR。确定标准曲线的斜率, 并通过以下公式计算底漆的效率:
    效率 (%) = (10^ (-1/倾斜)-1) * 100。
    1. 使用底漆与效率在90% 和105% 之间在一个理想的事例, 或者至少以效率在85% 和115% 之间。
  4. 为了分析芯片和输入样品, 应用 0.1-1 ng 芯片 dna 混合与分别向前和反向底漆, 核酸无水, 和 DNA 聚合酶主混合在20µL 的最终体积为每 qPCR 反应。
  5. 确定芯片和输入样本的阈值周期 (ct), 并将样本 c 的t规范化为 ct输入的值以计算浓缩量 (% 输入), 并使用以下公式。使用从 IgG 控制中获得的 Ct值来确定背景级别。
    % 输入 = 100-2^(范数. 输入−范数。芯片)
    规范.输入 = Ct (输入) −日志2(稀释因子)
    规范.芯片 = Ct (芯片) −日志2(稀释因子)
    注意: 规范。= 规范化

8. 通过测序分析芯片样品

  1. 将芯片样本 (输入和 immunoprecipitated DNA 样本) 转移到测序设施。
  2. 要预先准备库, 请使用适当的库准备工具包 (请参阅材料表), 并将输入 dna 的 2 ng 和所有的 immunoprecipitated dna 转换为索引库, 用于下一代复合序列指定的平台 (请参见材料表)。
  3. 关键步骤:按照试剂盒的指示, 结扎测序适配器 (工作浓度为15µM), 以结束修复和 dA 尾 DNA 片段。对于测序适配器和 PCR 引物使用适当的寡 (参见材料表)。对于这一数量的输入 dna, 使用 6-9 PCR 周期来丰富适配器结扎的 dna 片段。
    注: 通常情况下, 不需要对适配器的 DNA 进行大小选择。最好使用尽可能少的 pcr 周期, 因为许多 pcr 扩增周期导致 pcr 重复和高 GC 偏倚。
  4. 对于一个最终的库检查, 采取0.5 µL 的总反应分析, 以可视化大小分布在一个适当的设备 (请参见材料表)。对于量化, 使用可视化染料结合 fluorospectrometer 或其他方法 (请参见材料表)。
  5. 因为 H3K79me2 似乎是一个组蛋白修饰, 这是广泛分布在更大的染色体区域, 序列样品配对结束以读的长度 50 bp 并且以测序深度75宇达读。
  6. 分析与 galaxy/单向弗赖堡服务器 (galaxy..。
  7. 执行质量控制与获得的 ChIPseq 与 FastQC, 如果合适, 直接映射他们与 Bowtie2 版本 2.2.035有或不修剪。作为参考基因组组装使用 mm9 或最新版本的 mm10;作为参考注释 Ensembl FTP 版本79。
  8. 可选: 在峰值呼叫前使用皮卡德 MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) 删除读取重复项。
  9. 用 MACS2 版本 2.1.036调用峰值, 使用 H3K79me2 的 "宽" 选项。
  10. 若要获取芯片和输入示例之间的日志2比率, 则两个示例的读取比率读取次数的日志2都使用 BamCoverage 和 BamCompare。
  11. 对于所有其他深入的芯片-seq 特定分析, 应用 deepTools2 版本2.3.5 或 2.4.137,即生成覆盖跟踪文件 (仅用于芯片的 bamCoverage, bamCompare 用于芯片的比较), 估计芯片性能使用 plotFingerprint 和生成一般概述使用 computeMatrix, plotHeatmap。根据 H3K79me2 分布, 在 computeMatrix 过程中选择 k-均值聚类来聚类基因组区域。
  12. 使用已发布的芯片 seq 数据作为 H3K79me2 的 E14.5 DT, 用于试验目的 (加入号码: SRP057733) NCBI。

结果

神经祖分离、培养、H3K79me2 芯片和芯片分析方法的一般方案:图 1显示了一个流程图, 用于在胚胎发育期或产后阶段的小脑颗粒神经元祖细胞的不同时间点执行 H3K79me2 芯片。作为第一步, 大脑必须被孤立, 端 (在 E11.5 和 E14.5 之间) 或小脑 (P5-P7) 必须被检索。通过将端划分为 DT 和 VT, 可以分析不同区域。随后组织将匀浆和神经祖细胞分离。现?...

讨论

有两种主要的方法来执行染色质沉淀, 以检测组蛋白的修饰, 转录因子的染色体的占有率, 蛋白的读者, 作家, 或橡皮擦。一种是用核酸消化的原生芯片法, 沉淀的原染色质, 另一种是采用粉煤灰固定的, 被剪切的染色质, 其中核和其他 dna 附着的蛋白质与 dna 共价键结合的方法。39. 本机芯片具有较高的抗体检测率, 应适用于组蛋白甲基化, 因为染色质和组蛋白 h3k4 在整个芯片中相对稳?...

披露声明

作者宣布, 他们没有竞争的金融利益

致谢

我们感谢亨利埃特 Bertemes 在实验室中帮助建立 CGN 种植协议。本方法通过对电视的资助, 由 DFG 资助的 CRC992 医学遗传学研究支持。作者承认弗莱堡星系小组的支持: Pavankumar Videm, bj Grüning 和 Prof., 生物信息学, 德国弗赖堡大学, 由合作研究中心资助的992医学遗传学 (Backofen 补助金 DFG 992/1 2012)并且德国联邦教育和研究部 (BMBF 授予 031 A538A RBC (de。NBI))。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

参考文献

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