JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем эффективный и воспроизводимый метод для изоляции и культуры клетки-предшественники нейронных от эмбриональных и послеродовой мозговой ткани для chromatin иммунопреципитации (чип) гистона 3 лизина 79 dimethylation (H3K79me2) - гистона знак, расположенный в пределах шаровидные домен гистона 3.

Аннотация

Развитие мозга является сложным процессом, который находится под контролем образом височно пространственные градиенты morphogens и различных транскрипционный анализ программ. Кроме того изменения эпигеномные хроматина, как метилирование гистонов, имеют важную роль для установления и поддержания судьбы конкретных ячеек в рамках этого процесса. Подавляющее большинство метилирование гистонов происходит на гибкой гистона хвост, который доступен для гистона модификаторы, ластики и читатель гистоны. В противоположность этому H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3 и вовлечены в различные области развития функций. H3K79 метилирование эволюционно сохраняется и можно найти в широком диапазоне видов от Homo sapiens в Saccharomyces cerevisiae. Изменение происходит в разных клеточных популяций в пределах организмов, включая нейронные прародителями. Расположение H3K79 метилирование в шаровых области гистона 3 делает его трудно оценить. Здесь мы представляем методы для изоляции и корковые прародитель культуры клеток (CPC) от эмбриональных корковых мозговой ткани (E11.5-E14.5) или мозжечковая гранулированных нейрон прародителями (CGNPs) от послеродового ткани (P5-P7), а также эффективно immunoprecipitate H3K79me2 для количественного PCR (ПЦР) и секвенирования генома широкий.

Введение

Чувств, мотор и когнитивных функций мозга являются весьма сложными и подвержены физическим и экологических изменений. Мозг состоит из трех основных частей Хинд-, средне-и переднего мозга, которые глубоко связаны. В рамках переднего конечного мозга можно разделить на спинной конечного мозга (DT) и брюшной конечного мозга (VT). DT мышей состоит из шести корковых слоев, которые формируются между E11.5 и E18.5 в форме «наизнанку»1. ЖТЛ включает Ганглиозный Высокопреосвященства в развитии, которые впоследствии образуют базальных ганглиев2,3. Несколько типов клеток могут быть классифицированы в млекопитающих центральной нервной системы, таких как нейроны, астроциты или4олигодендроциты, которые развиваются в височно пространственной способом5. Во-первых нейронные прогениторных клеток (НПС) порождают различные виды нейронов, интернейронов и VT, проекции нейронов в DT, а позднее на глиальных клеток (например, астроциты6). Во время разработки коры головного мозга, наиболее поверхностный слой (уровень I), который содержит клетки Кахаля-Ретциуса, формируется сначала. Затем между E12.5 и E14.5, НПС генерировать глубже нейрональных слоёв (VI, V) во время между 14,5 и 16,5, прародители порождают верхний слой (IV-II) нейронов7,8. Нейрональных личность задается путем различных morphogen индуцированной височно пространственной транскрипционный анализ программ и дополнительно эпигеномные программы2.

Мозжечка, который подразумевается в двигательной координации, расположен в задний мозг и развивается между E10 и около P20 в мышей9. Он содержит коры мозжечка и мозжечковая ядер10. Взрослый коры мозжечка состоит из трех слоев, внешний молекулярный слой, слоя клеток Пуркинье и внутренний зернистый слой, содержащий гранулированных нейронов10. Мозжечковая гранул клетки наименьшее нейронов и составляют около 80% всех нейронов мозга позвоночных11. Они развиваются из прекурсоров, расположенных в зоне внешней зародышевого и мигрируют через слой клеток Пуркинье, чтобы их назначения12. Как в конечного мозга, развитие мозжечка регулируется несколько важных morphogens, которые имеют конкретные и пространства зависящие от времени функций и инициировать определенные транскрипционный анализ программы10.

Разработка слои коры и верхней мозжечковой контролируется transcriptional выражением конкретных morphogens и, таким образом, состояние хроматина ДНК. В упрощенном режиме хроматина государства можно разделить на euchromatin как транскрипционно активная и гетерохроматин как транскрипционно немого регионов. Нуклеосома как основной ячейкой хроматина содержит две копии каждого ядра гистона H2A, H2B, H3 и H4, окруженный 147 пар оснований ДНК13. Высоко post-translationally гистонами изменяются путем метилирования, ацетилирования, фосфорилирование, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, дезаминирование и пролина изомеризации14,15. Лизин метилирование гистонов считается наиболее стабильных гистона модификация, которая контролирует транскрипции, репликации, рекомбинация16, повреждение ДНК ответ17и геномный импринтинг18. Lysines может быть моно-, ди-или tri метилированную19 и появляются не только на доступные гистона хвосты, но и внутри шаровидных домена гистонами20. Конкретные methylations H3K4 и H3K36 в основном связаны с euchromatin, конкретных methylations в H3K9, H3K27 или H4K20 главным образом найдены в гетерохроматиновых, хотя все остатки расположены в пределах гистона хвост14, 19,21. H3K79 метилирование расположен в пределах домена шаровидных гистона и был связан с транскрипционный анализ активности, но и с транскрипционно инертных регионах геномной22. Модификация эволюционно сохраняется так, как было отмечено в дрожжи, вилочковой железы теленка, курица и человека23. H3K79 моно, ди и trimethylation (H3K79me1, me2, me3) катализируемые гистона methyltransferases DOT1L24,25 и ядерных SET домен-содержащих белков 2 (Nsd2)26. DOT1L причастен к распространению, репарации ДНК и сотовых перепрограммирования27. Потеря Dot1l в мышах приводит к пренатальной смерти вокруг28,E10.5 стадии развития29. Во время разработки сердца и myocardiocyte дифференциации DOT1L имеет важное значение для ген выражение правила30. В центральной нервной системе, DOT1L функция может быть причастны развития нервной трубки31, он участвует в подавлении Tbr1-выражение во время развития переднего32и может функционировать в регулировании ER-стресс ответ генов33. Контекстно зависимые активации или подавления действий H3K79me, особенно с в естественных условиях ситуаций, как развитие центральной нервной системы, является на сегодняшний день только частично понял32. Так как H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3, он доступен труднодоступных меньше по сравнению с изменения на гибкой гистона хвосты23. Чтобы понять функцию H3K79 метилирование, необходимы методы анализа надежных и воспроизводимых для определения его местоположения и геномная окружающей среды. В этом документе методы мы представляем методы изоляции различных нейронных прародителями (CPC для коры) и CGNPs для мозжечка, эффективное лечение ингибитором DOT1L, и чип метода для анализа метилирования H3K79 через ПЦР или последовательности в разное время очков во время разработки корковых и мозжечка. Обзор протокола и его возможности смотрите Рисунок 1.

протокол

Благосостояние животных комитетов университета Фрайбурга и местные органы власти одобрил все эксперименты на животных (G12/13, G16/11) упоминается в следующий протокол.

1. Подготовка

  1. Подготовка к изоляции CPC
    1. Настройка времени спаривания для получения эмбрионов на разных стадиях развития коры (между E11.5 и E14.5). Используйте мышей штамма ВММНИИ (военно-морской институт медицинских исследований), которые являются по крайней мере 8 недель. После спаривания, рассмотреть позитивный Вагинальные вилка на E0.5.
    2. Чтобы иметь достаточно материала, используйте один помет мышей ВММНИИ для одной микросхемы H3K79me2 коре E12.5 или E14.5. Для позднее эмбриональных стадий, используйте один помет для более чип анализы (средний размер помета ВММНИИ: 10 эмбрионов).
    3. Precool Hank´s сбалансированный соли раствора (HBSS) и фосфат амортизированное saline (PBS) до 4 ° C (длительного хранения на RT).
    4. Сбалансировать 4 ° C хранится трипсина-ЭДТА (0,05% w/v) до 37 ° C.
    5. Подготовка корковых клеток среднего (СКК): Дополнить окончательный концентрации 2% (v/v) B-27 дополнение, 5 мкг/мл АПО-трансферрин, 1 мкг/мл глутатиона, 0.5 мм L-глютамин, супероксиддисмутаза 0,8 мкг/мл и 1% (v/v) средство для нейронов (см. Таблицу материалы) Антибиотик пенициллин-стрептомицином-неомицин смесь. Хранить при 4 ° C. Для эксперимента сбалансировать средне-37 ° C.
    6. Оттепель плода телячьей сыворотки (FCS), аликвота его (50 мл) и сбалансировать один Алиготе до 37 ° C (длительного хранения при температуре-20 ° C).
    7. Подготовка запасов DNAse 1 (10 мг/мл) в H2O для клеточной культуры. Хранить аликвоты при-20 ° C.
    8. При необходимости, Растворите специфичные ингибиторы DOT1L ЗОЭ-5676 или SGC0946 в ДМСО на складе концентрации 100 мм. Применить к ячейкам конец концентрации 1-5 мкм в день 0 и повторное применение ингибитора каждые два дня.
    9. Для выращивания КПК пальто культуры пластин ячейки (6 хорошо или 12 хорошо) с поли L-орнитин гидробромида (1 мг/мл в 150 мм борной кислоты рН 8,4) для по крайней мере 1 час на RT и потом с Ламинин (1 мг/мл) в среде СКК при 37 ° C на ночь.
  2. Подготовка к CGNP изоляции
    1. Организуйте соответствующие спаривания мышей, чтобы генерировать P5-P7 животных для изоляции мозжечка (3-5 животных каждого чипа и состояние).
    2. Подготовьте HBSS/глюкозы, добавив 6 мг/мл глюкозы HBSS буфер.
    3. Подготовьте CGNP клеток питательной среды (CGM), добавив 1% (v/v) N2 дополнение, 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином-неомицин, 25 мм KCl и 10% FCS в среде DMEM-F12. Для выращивания CGNP подготовить CGM среднего без FCS, включая Еж Соник 0,6 мкг/мл (ТСС) (CGM-ТСС), но и сбалансировать его до 37 ° C при необходимости.
    4. Покройте 6-ну клетки культуры пластин с 100 мкг/мл поли D-Лизин для 1-2 ч на RT для удаления клеток глии. Потом дважды промыть стерильной ddH2O и пусть сухой плиты. Хранить пластины для максимум одну неделю на 4 ° C.
    5. Для выращивания CGNPs пальто 6-ну клетки культуры пластин с поли L-орнитин (0,1 мг/мл) при 4 ° C на ночь. Потом дважды промыть H2O для культуры клеток и пусть сухой плиты.
      Примечание: Пластины может храниться максимум одну неделю на 4 ° C.
    6. Подготовить трипсина (w/v) 0,025% в HBSS/глюкозы и сбалансировать его до 37 ° C при необходимости.
  3. Подготовка к чип H3K79me2
    1. Подготовьте PFA (1% в PBS, рН 8) свеже до сшивки хроматина. Подготовить PFA тепла 50 мл PBS в микроволновой печи до максимум 65 ° C. При постоянном помешивании добавьте 0,5 мг ПФА в PBS. Затем добавьте 50 мкл 10 M NaOH и ждать пока растворится PFA. Впоследствии, 42,5 мкл HCl (37% v/v), чтобы получить рН 8. Снова проверить рН и затем дайте 1% раствор PFA достичь RT.
    2. Подготовка запасов РНКазы (1 мг/мл) и протеиназы K (20 мкг/мкл) отдельно в стерильных ddH2O. хранить аликвоты при-20 ° C.
    3. Подготовить следующие буферы и реагенты: PBS, содержащий 0,02% анимации, буфера Lysis, глицин, буфером для разбавления проб, чип буфер 1, буфер 2 чип, чип буфер 3 и TE буфера и хранить их на 4 ° C. Подготовьте Элюирующий буфер свежий каждый раз.
      1. Подготовить PBS, содержащий 0,02% анимации. Магазин для в большинстве одну неделю на 4 ° C.
      2. Подготовьте литического буфера с использованием 50 мм трис рН 8,0, 10 мм ЭДТА, лаурилсульфат натрия 1% (w/v) (СДП) и 1 x ингибитор протеазы.
      3. Подготовьте 2,5 метров глицина.
      4. Подготовьте буфером для разбавления проб с использованием 20 мм трис при pH 8.0, 150 мм NaCl, 2 мм ЭДТА, 1% (v/v) Тритон X-100, SDS 0,25% (w/v) и 1 x ингибитор протеазы.
      5. Подготовьте чип буфер 1 с использованием 20 мм трис при pH 8.0, 150 мм NaCl, 2 мм ЭДТА, 1% (v/v) X-100 Тритон и 0,2% (w/v) SDS.
      6. Подготовьте чип буфера 2 с использованием 20 мм трис рН 8,0, 500 мм NaCl, 2 мм ЭДТА, 1% (v/v) X-100 Тритон и 0,2% (w/v) SDS.
      7. Подготовьте чип буфер 3 с помощью 20 мм трис рН 8,0, 250 мм LiCl, 2 мм ЭДТА, 1% (v/v) NP-40 и 1% (w/v) SDS.
      8. Подготовьте TE буфера с использованием 20 мм трис рН 8,0 и 2 мм ЭДТА.
      9. Подготовьте свежие Элюирующий буфер, содержащий 1% (w/v) SDS, 100 мм NaHCO3.

2. нейронные прародитель изоляции ткани головного мозга

  1. Изоляция и Факультативного выращивания CPC
    1. Усыпить беременных животных, вывих шейного и переноса эмбрионов в ледяной HBSS.
    2. Удаление черепа с ножницами и изолировать мозга, а затем удалите мозговых оболочек, если применимо, с небольшой щипцы и изолировать коре (целое, DT, или VT) обоих полушарий, удалив все остальные части мозга под бинокль с использованием малых щипцами и, если необходимости, небольшие ножницы. Храните изолированных коре в 5 мл HBSS буфера на 4 ° C в 15 мл.
    3. Центрифуга для изолированных мозга материал для 5 мин 1000 x g и 4 ° C.
    4. Вымойте коре с 5 мл ледяной HBSS и гомогенизации их с кончиком пипетки 1 мл, закупорить вверх и вниз. При необходимости, Отрежьте кончик кончика пипетки.
    5. Центрифуга для гомогенизированных образцов за 5 мин 1000 x g и 4 ° C. Удаление HBSS.
    6. Добавить 3 мл трипсина и Проинкубируйте образцы для 5 минут при 37 ° C.
    7. Добавьте 1 mL FCS, 5 мл СКК и 30 мкл DNase 1 образец и гомогенизации образца с 5 мл стеклянной пипетки, тщательно закупорить вверх и вниз.
    8. Центрифуга изолированных клеток для 5 мин 1000 x g и 4 ° C. Отменить супернатанта, добавить 5 мл СКК и гомогенизации образца снова.
    9. Разбавить Алиготе образца и считать с Нойбауэр подсчета камере. Ожидается, что среднее количество 4.5 x 106 клеток / эмбриона. Для выращивания изолированных CPC, перейдите к шагу 2.1.10. Для чипа сразу, перейдите к шагу 3.
    10. Для выращивания пластина CPC на поли L-орнитин (0,1 мг/мл) и Ламинин (1 мг/мл) с покрытием Посуда на плотности между 8 х 104 и 2,5 x 105 клеток/см2 в среде СКК и инкубировать их в 5% CO2, 37 ° C и относительной влажности 100%.
    11. Так как СКПК начинают дифференцироваться в нейроны в культуре клеток (после примерно 4 дней), рассмотрим рассечение дату как день в vitro 0 (0 в день). На более длительные сроки выращивания измените половина среды каждый четвертый день с свежими CCM среднего.
    12. Применять 1-5 мкм SGC0946 или EPZ5676 растворяется в ДМСО в день 0 (4-5 ч после изоляции клеток) и обновить каждый второй день. Использование ДМСО для контроля лечения. Проверьте эффективность ингибитора лечения через стандартный immunoblot методов, если требуется.
  2. Изоляция и Факультативного выращивание CGNPs
    1. Усыпить P5-7 животных путем обезглавливания, используя ножницы. Удалите кожи головы, откройте черепа и мозга, используя маленькие ножницы и пинцет. Изолировать мозжечка и передача его в ледяной HBSS/глюкозы. Удалите все мозговые оболочки и кровеносных сосудов и переноса cerebella в 15 мл пробирок, наполненный холодной HBSS/глюкозы.
    2. Мыть cerebella три раза с 10 мл ледяной HBSS/глюкозы (собирать их центрифугированием при 650 g x 5 минут при температуре 4 ° C) и cerebella впоследствии, нежно закупорить вверх и вниз с Пипетка 1 мл (максимум 2 - 3 раза) чтобы получить 0,5-1 мм3 фрагменты.
    3. Добавьте 5 мл 0,025% трипсина в HBSS/глюкозы и инкубировать ткани при постоянном помешивании в ванну воды 37 ° C на 15 мин остановка пищеварение, добавив 5 мл CGM и собирать ткани центрифугированием при 650 g x 5 мин при 4 ° C.
    4. Удалить супернатант и нарезанных ткани с кончиком пипетки 1 мл в 1 мл CGM и перенести его на новой трубки 15 мл.
      Примечание: Важно избежать воздушных пузырей.
      1. Добавьте 5 мл CGM и инкубировать смесь для 2 мин на льду урегулировать остатки ткани. Перенесите супернатант в новой трубки 15 мл. Добавить 2 мл CGM остаточной ткани и повторите процедуру Тритурация.
    5. Бассейн supernatants (без ткани остатки, около 10 мл в общей сложности) и центрифуги на 650 g x 5 мин при 4 ° C для сбора клеток мозжечка. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл CGM.
    6. Так как астроциты придерживаться поли D-лизин чем CGNPs быстрее и сильнее, плиты клетки на 100 мкг/мл поли D-лизин 6-хорошо пластины с покрытием (до 4 мл на хорошо) и проинкубируйте втечение 20 мин при 37 ° C для удаления астроциты.
    7. Shake пластину и собирать супернатант. Затем, центрифуги на 650 g x 5 минут при температуре 4 ° C в 15 мл. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл CGM и подсчитать количество ячеек с Нойбауэр, считая камеры.
      Примечание: CGNPs круглые, маленькие и показать ореол при записи образа с помощью фазово-контрастной микроскопии.
    8. Если требуется, семенных клетки в 37 ° C предварительно разогретую CGM на поли L-орнитин покрытием пластин (3 х 106 клеток за 6-а) и инкубировать их при 37 ° C, 5% CO2 и 100% относительной влажности.
      Примечание: Если заполнение не выполняется, продолжите с шага 3.1.
      1. После 6-12 ч обмен средне-CGM-ТСС. Лечить изолированных CGNPs 6 h (или при изменении CGM-ТСС) после изоляции с DOT1L-ингибитор и ДМСО управления и продлевать его каждый второй день (Сравните с 2.1.12). Проверьте эффективность ингибитора лечения через стандартный immunoblot методы, если требуется. Для чипа перейдите к шагу 3.3.
        Примечание: Оставляя CGM на тарелках (и с что FBS) приведет к дифференциации CGNPs в нейроны мозжечка гранулированный (КСГН).

3. Фиксация клеток и стрижка Chromatin

Примечание: Выполните 3.1 и 3.2 Если клетки не культивировали, если они, переходите к шагу 3.3.

  1. Собирать клетки центрифугированием на 4 мин на 1000 x g и добавьте 1,3 мл PBS. Передать образец 1,5 мл. Центрифуги для 4 мин на 1000 x g при 4° C. Помойте образец дважды с 1,3 мл PBS.
  2. Критически важный шаг: 350 мкл 1% PFA для образца и проинкубируйте 5 мин при температуре 22 ° C. Чтобы остановить реакции, добавьте 18.4 мкл глицин и 1 мл PBS. Центрифугуйте образцы для 5 мин на 1000 x g при 4 ° C.
    1. Помойте образец дважды с ледяной PBS. Собирать фиксированных клетки центрифугированием 5 мин на 1000 x g и 4 ° C. Теперь Храните пробы на льду.
      Примечание: Время фиксации должны быть точно 5 минут, чтобы получить оптимальные результаты. Число различных клеток может потребоваться время адаптации.
  3. Критически важный шаг: Искусственный CGNPs (или CPC), добавить до 1 мл 1% PFA непосредственно в лунках культуры клеток. После 5 минут инкубации при 22 ° C добавьте соответствующее количество глицин и PBS и урожай клетки с скребок ячейки.
    1. Передача клетки в 1,5 мл пробирок и центрифуги образца для 5 мин 1000 x g и 4 ° C. Помойте образец дважды с ледяной PBS. Собирать фиксированных клетки центрифугированием для 5 minat 1000 x g при 4 ° C. Теперь Храните пробы на льду.
  4. Критически важный шаг: 700 мкл буфера lysis (+ ингибитор протеазы) и Проинкубируйте образцы для 15 мин при 4 ° C. Вихревой образец каждые 5 минут наклонить хроматина лизированных клетках 3 x 10 мин в sonicator (30 с-пульс, 30 s пауза) на максимальной мощности.
    1. Убедитесь, что громкость не превышает 350 мкл в трубку. Вихревой образцов каждые 10 минут проверить lysate для оставшихся ядер с микроскопом фазово контрастной.
      Примечание: Важно получить оптимальные результаты стрижка (Сравните с Рисунок 1B) для последующего анализа. В случае использования других методов для сдвига хроматина, оптимизируйте стрижка для chromatin фрагментов размером от 200-500 bp.
  5. Пелле клеток остатки за 10 мин, 13 000 x g, 4 ° C. Для preclearing шаг 5.2 Используйте супернатант. Заморозить образца при-20 ° C для использования в дальнейшем, в случае необходимости.

4. Подготовка бусы и Preclearing

  1. Промойте 1 мл ледяной PBS, содержащий 0,02% 45 мкл белок магнитные бусы/ChIP и 20 мкл магнитные бусы/образец анимации, три раза с использованием магнитного стенд. Затем добавьте 1 mL ледяной PBS в бисер.
  2. 1 мл ледяной PBS и 45 мкл бусы/чип добавьте 3 мкг антитела/ChIP (H3K79me2 или кролик IgG). Проинкубируйте образцы для 2 ч при 4 ° C на вращателе для связывания антител к бисеру. В зависимости от антител используйте ~ 3 мкг антитела/ChIP.
  3. Вымойте антитела прыгните бусы три раза с 1 мл ледяной PBS, содержащий 0,02% анимации. Добавьте соответствующий шарик тома (начиная объема магнитной бусины используется) ледяной PBS промывают антитела сочетании бисер.
  4. Добавление образца для preclearing (общий объем 1320 мкл) 600 мкл буфера для разведения и 20 мкл промывают магнитные бусы и проинкубируйте втечение 2 ч при температуре 4 ° C на вращателе. Удаление бусы, с помощью магнитного стенд. Возьмите 5% (33 мкл) лизатов как входной образцы и заморозить их при-20 ° C.

5. chromatin иммунопреципитации

  1. Precleared экстракт разделить две трубы (примерно 643,5 мкл), добавьте такой же объем буфера для разведения и антител прыгните бусы (45 мкл/образца; H3K79me2 или кролик IgG). Проинкубируйте образцы на 4 ° C ночь на ротатора.
  2. Вымойте бусины с ледяной чип буфер 1, чип буфера 2 и буфер 3 чип для 10 мин при температуре 4 ° C на вращателе. После этого вымойте три раза с буфером TE 5 минут при температуре 4 ° C на вращателе.
  3. Элюировать бусины с Элюирующий буфер для 1 h при 1400 об/мин в шейкере при комнатной температуре.
  4. Добавить 10 мкг РНКазы (1 мг/мл) на чипе сэмпл и 5 мкг ввода образцов и Проинкубируйте образцы для 30 минут при 37 ° C (1400 об/мин).
  5. Добавить 100 мкг протеиназы K (20 мкг/мкл) за чип образца и 50 мкг на вход и инкубировать на ночь при 65 ° C при 1400 об/мин.

6. Очистка чип образцов

  1. Очищают чипа и ввода образцы с ДНК очистки комплект (см. Таблицу материалы) в соответствии с руководством. Используйте более очистки столбцы, когда ожидается более чем 5 мкг ДНК. Элюировать образца с 2 x 15 мкл ДНК Элюирующий буфер, предоставленный в комплекте.
  2. Выполните количественная оценка образцов (используйте 1 мкл) с помощью визуализации Флюорофор и fluorospectrometer (см. Таблицу материалы).

7. Анализ образцов чип через ПЦР

  1. Для конструкции праймера для ПЦР-анализа извлечения genomic последовательностей интерес из браузера просмотра интегративной геномики (IGV)34. Дизайн грунтовки вокруг transcriptional стартовый сайт (TSS) гена, поскольку H3K79me2 может находиться там. Элемент управления, рассмотрим некодирующих геномной районах или регионах около 10 КБ вверх по течению ТП 10 КБ или вниз по течению конца транскрипционный анализ сайта (TES).
    1. Генерировать грунты с https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, используя заданный размер продукта между 70 и 200 bp и оптимальной температуры 60 ° c. Для ознакомительных целей используйте Праймеры для геномной регионов, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 и Npm1 перечисленных в таблице 1.
  2. Проверьте недавно разработан грунты с в следующей программе ПЦР, Мастер микс и отжига градиента температуры между 58 ° C и 63 ° C и выберите отжига температура с высоким количество продукта и качество.
    1. Примените гель-электрофорез ДНК для управления размером ожидаемого продукта. Для ПЦР-анализа, используйте систему обнаружения PCR реального времени (см. Таблицу материалы).
    2. Подготовка мастер смесь, используя 10 мкл ДНК полимеразы Мастер микс, 0.5 мкл грунтовка вперед (10 мкм), 0.5 мкл грунтовка обратный (10 мкм), 4 мкл нуклеиназы свободной воды и 5 мкл ДНК (1 нг/мкл).
    3. Использовать программу 2-шаг ПЦР следующим: 5 мин при 95 ° C, 50 x (30 сек при 95 ° C, 30 s на 58 ° C - 63 ° C) и денатурации градиент постоянно при 4 ° C.
  3. Создать серию разбавления пробы ДНК генома, стриженый, очищенный (2 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,5 нг/мкл, 0.25 нг/мкл и 0,125 нг/мкл) и использовать 5 мкл для теста эффективности с помощью ПЦР. Определить наклон кривой стандартного и рассчитать эффективность грунтовка по следующей формуле:
    КПД (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Используйте грунты с КПД 90% и 105% в идеальном случае, или по крайней мере с КПД 85%-115%.
  4. Для анализа чипа и ввода образцы, применяют 0,1-1 нг чип ДНК смешивается с соответствующими вперед и обратного грунт, нуклеиназы свободной воды и ДНК-полимеразы мастер смесь в окончательном объеме 20 мкл для каждой реакции ПЦР.
  5. Определить пороговые значения цикла (tC) чип и ввода образцов и нормализовать образца Ct Ct значения ввода для вычисления обогащения (% ввод) с использованием следующей формулы. Использование Ct значения, полученные из IgG управления для определения фонового уровня.
    % Ввод = 100-2^(подземное ввода − нормой. Чип)
    норма. ввода = Ct (вход) − журнал2(коэффициент разрежения)
    норма. Чип = Ct (чип) − журнал2(коэффициент разрежения)
    Примечание: норма. = нормализованных

8. Анализ образцов чип через последовательность

  1. Передача образцов чип (образец ДНК ввода и immunoprecipitated) для объекта последовательности.
  2. Подготовить библиотека заранее, используйте соответствующие библиотеки подготовка комплекта (см. Таблицу материалы) и преобразовать 2 мультиплекс секвенирования на нг ввода ДНК и все immunoprecipitated ДНК в индексированные библиотеки для следующего поколения указал платформы (см. Таблицу материалы).
  3. Критически важный шаг: Следуя инструкциям комплекта перевязать последовательности адаптеров (с рабочей концентрации 15 мкм) до конца отремонтировано и dA белохвост фрагментов ДНК. Для секвенирования адаптеров и ПЦР праймеры используют соответствующие oligos (см. Таблицу материалы). Для этого количество входных данных ДНК используйте 6-9 циклов PCR обогатить адаптер лигируют фрагментов ДНК.
    Примечание: Как правило, нет необходимости выполнять выбор размера адаптер лигируют ДНК. Это лучше всего использовать как несколько циклов PCR как можно скорее, поскольку многие PCR амплификация циклов результат в PCR дубликаты и высоким GC уклоном.
  4. Для проверки окончательного Библиотека, возьмите 0.5 мкл общей реакции для анализа для визуализации распределения размеров на соответствующее устройство (см. Таблицу материалы). Для количественной оценки использование визуализации красителя в сочетании с fluorospectrometer или другие методы (см. Таблицу материалы).
  5. Так как H3K79me2, как представляется, изменения гистона, который широко распространяется на крупных регионах геномной, последовательность парных образцов конце чтения длиной 50 bp и с глубиной последовательности 75 млн читает.
  6. Анализировать чип seq данных с сервером Фрайбург Галактика/Uni (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Выполнять контроль качества с полученной ChIPseq с FastQC и, при необходимости, сопоставьте их непосредственно с Bowtie2 версии 2.2.035 с или без обрезки. Базовая сборка генома используйте mm9 или новейшая версия мм10; и как ссылку аннотации Ensembl FTP выпуск 79.
  8. Дополнительно: Удаление читать дубликатов с помощью MarkDuplicates Пикар (http://broadinstitute.github.io/picard) перед вызовом пик.
  9. Вызовите пики с MACS2 версии 2.1.036 с помощью параметра «широкий» для H3K79me2.
  10. Для получения журнала2 соотношение между чипа и входной выборки, журнала2 количество считываний гласит соотношение обоих образцов использовать BamCoverage и BamCompare.
  11. Для всех других чип seq конкретного анализа применить deepTools2 версия 2.3.5 или 2.4.137, т.е. для создания покрытия трека файлов (bamCoverage для обломока только, bamCompare для сравнения микросхемы ввода), чтобы оценить чип производительности используйте plotFingerprint и сформировать общий обзор использования computeMatrix, plotHeatmap. Выберите K-среднее кластеров в ходе процесса computeMatrix кластера геномной регионов согласно распределения H3K79me2.
  12. Использование опубликованных данных чип seq как H3K79me2 E14.5 DT на хранение в NCBI для ознакомительных целей (присоединения число: SRP057733).

Результаты

Общая схема нейронных прародитель изоляции, выращивание, H3K79me2 чип и чип методы анализа: На рисунке 1 показана блок-схема для выполнения H3K79me2 чип корковых прогениторных клеток в разное время точках во время развития эмбриональной мозга или пра?...

Обсуждение

Существует два основных способа для выполнения иммунопреципитации chromatin для выявления геномной размещение изменения гистона, факторов транскрипции, гистонов код читателей, писателей или ластиков. Один метод чип с помощью нуклеиназы переваривается, родной chromatin для иммунопреципитаци?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов

Благодарности

Мы благодарим Генриетта Bertemes за помощь в создании протокола CGN культивирования в лаборатории. Эпигенетики финансируемых DFG медицинской CRC992 этот метод бумага была поддержана финансирование для ТВ. Авторы признают поддержку команды Галактика Фрайбург: Pavankumar Videm, Бьорн Grüning и профессор Рольф Backofen, Биоинформатика, Университет Фрайбурга, Германия финансируется совместных исследований центр 992 медицинской эпигенетики (DFG Грант SFB 2012 992/1) и немецкого федерального министерства образования и научных исследований (BMBF Грант 031 A538A РБК (de. NBI)).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

Ссылки

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131H3K79DOT1LDOT1L

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены