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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Zusammenfassung

Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer Prozess, der in gewissem Sinne Temporo-räumliche von Steigungen von Morphogens und verschiedene transkriptionelle Programme gesteuert wird. Darüber hinaus haben die epigenetische Chromatin Modifikationen, wie Histon-Methylierung, für Aufbau und Pflege von bestimmten Zelle Schicksale in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Die überwiegende Mehrheit der Histon-Methylierung tritt auf die flexible Histon-Schweif, die Histon-Modifikatoren, Radiergummis und Histonproteine Leser zugänglich ist. Im Gegensatz dazu H3K79 Methylierung befindet sich in der globulären Domäne von Histon 3 und ist in verschiedenen Entwicklungsstörungen Funktionen beteiligt. H3K79-Methylierung ist evolutionär konserviert und finden in den unterschiedlichsten Arten von Homo Sapiens zu Saccharomyces Cerevisiae. Die Änderung tritt in unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb von Organismen, einschließlich des neuronalen Vorläuferzellen. Die Lage der H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 macht es schwierig zu beurteilen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, zu isolieren und Kultur kortikalen Progenitor Zellen (CPCs) aus embryonalen kortikalen Hirngewebe (E11.5-E14.5) oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter (CGNPs) vom postnatalen Gewebe (P5-P7) und effizient immunoprecipitate H3K79me2 für quantitative PCR (qPCR) und genomweite Sequenzierung.

Einleitung

Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der "Inside-Out"1gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien2,3bilden. Verschiedene Zelltypen lassen sich einteilen in den Säugetier-Zentralnervensystem wie Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten4, die in einem Temporo-räumliche Weise5zu entwickeln. Zunächst entstehen die neurale Vorläuferzellen (NPCs) verschiedene Arten von Neuronen, Interneuronen in der VT und Projektion Neuronen in der DT und später nach Gliazellen (z.B. Astrozyten6). Während der kortikalen Entwicklung, die oberflächlichste Schicht (Schicht I), Cajal-Retzius-Zellen enthält zuerst gebildet ist. Anschließend generieren NPCs zwischen E12.5 und E14.5, neuronale Tiefenschichten (VI, V) beim zwischen 14,5 und 16,5, Stammväter Anlass zu Oberschicht (IV-II) Neuronen7,8. Neuronale Identität wird von verschiedenen Morphogen-induzierte Temporo-räumliche transkriptionelle Programmen und zusätzlich durch epigenetische Programme2angegeben.

Das Kleinhirn, die motorische Koordination beteiligt ist, befindet sich in dem Hinterhirn und zwischen E10 und grob P20 in Mäusen9entwickelt. Es enthält die zerebelläre Kortex und zerebelläre Kerne10. Die Erwachsenen zerebelläre Kortex besteht aus drei Schichten, die äußerste molekulare Schicht, die Purkinje-Zellschicht und der innersten Körnerschicht enthält körnige Neuronen10. Die zerebelläre Granulat-Zellen sind die kleinsten Neuronen und repräsentieren rund 80 % aller Neuronen in der vertebrate Gehirn-11. Sie entwickeln aus Vorstufen in der externen germinal Zone gelegen und durchwandern der Purkinje Zelle Schicht auf ihre Ziel-12. Wie die Entwicklung des Kleinhirns im Telencephalon, durch mehrere wichtige Morphogens reguliert wird, definiert die bestimmte Zeit und Raum-abhängige Funktionen und initiieren transkriptionelle Programme10.

Die Entwicklung der kortikalen und zerebelläre Schichten wird durch transkriptionelle Ausdruck der spezifischen Morphogens und damit der Chromatin-Staat der DNA gesteuert. In einer vereinfachten Ansicht können Euchromatin als transcriptionally aktiv und Heterochromatin als transcriptionally leisen Regionen Chromatin Staaten aufgeteilt werden. Das Nukleosom als die grundlegende Maßeinheit des Chromatins enthält zwei Kopien von jedem Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, umgeben von 147 Basenpaare der DNA-13. Histone werden durch Methylierung, Acetylierung Phosphorylierung, Ubiquitination, Sumoylierung, ADP-Ribosylation, Deamination und Prolin Isomerisierung14,15hoch posttranslational modifiziert. Histon-Lysin-Methylierung gilt als die stabilste Histon-Modifikation, die Transkription, Replikation, Rekombination16, DNA-Schäden Antwort17und genomische Prägung18steuert. Lysines können Mono-, di- oder Tri-methylierte19 und erscheinen nicht nur auf den zugänglichen Histon-Schwänzen, sondern auch innerhalb der globulären Domäne der Histone20. Spezifische Methylations H3K4 und H3K36 vor allem mit Euchromatin verbunden sind, spezifische Methylations bei H3K9, H3K27 oder H4K20 sind vor allem in heterochromatischen Regionen gefunden, obwohl alle Rückstände der Histon Schweif14, liegen 19,21. H3K79-Methylierung befindet sich innerhalb der Histon globulären Domäne und transkriptionelle Aktivität, sondern auch mit transcriptionally inert genomische Regionen22zugeordnet wurde. Die Änderung ist evolutionär konserviert, da es in Hefe, Thymus Kalb, Huhn und menschlichen23beobachtet hat. H3K79 Mono, di und Trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sind durch die Histon-Methyltransferasen DOT1L24,25 und die nukleare SET Domain-haltige Protein 2 (Nsd2)26katalysiert. DOT1L ist in Proliferation, DNA-Reparatur und Mobilfunk umprogrammieren27verwickelt. Verlust von Dot1l bei Mäusen führt zu einer pränatalen Tod um die Entwicklungsphase E10.528,29. Während der Entwicklung von Herz und Myocardiocyte Differenzierung unbedingt DOT1L gen Ausdruck Verordnung30. In das zentrale Nervensystem, DOT1L Funktion im Neuralrohr Entwicklung31einbezogen werden könnte, sie engagiert sich bei der Unterdrückung der Tbr1-Ausdruck im Vorderhirn Entwicklung32, und funktionieren in der Verordnung von ER-Stress Antwort Gene33. Die Kontext-abhängige Aktivierung oder unterdrücken Einwirkung von H3K79me, vor allem mit in Vivo Situationen wie die Entwicklung des zentralen Nervensystems, ist bis heute nur teilweise verstanden32. Da H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 befindet, ist es im Vergleich zu Änderungen auf die flexible Histone Tails23sterisch weniger zugänglich. Um die Funktion der H3K79-Methylierung zu verstehen, brauchen wir zuverlässige und reproduzierbare Analyse-Methoden, seine Lage und genomische Umwelt bestimmen. In diesem Methoden-Papier präsentieren wir Ihnen Isolationsmethoden von verschiedenen neuronalen Vorläuferzellen (CPC-Gebote für den Kortex) und CGNPs für das Kleinhirn, wirksame DOT1L Inhibitor Behandlung und eine ChIP-Methode H3K79 Methylierung mittels qPCR oder Sequenzierung zu verschiedener Zeit analysieren Punkte während der kortikalen und zerebelläre Entwicklung. Für einen Überblick über das Protokoll und seine Möglichkeiten siehe Abbildung 1.

Protokoll

Tierschutz Ausschüsse der Universität Freiburg und lokalen Behörden genehmigt alle Tierversuche (G12/13, G16/11) in das folgende Protokoll erwähnt.

1. Vorbereitungen

  1. Vorbereitungen für die CPCs Isolierung
    1. Richten Sie zeitgesteuerte Paarung um Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien Kortex (zwischen E11.5 und E14.5) zu erhalten. Verwenden Sie Mäuse des Stammes NMRI (Naval Medical Research Institute), die mindestens 8 Wochen alt sind. Betrachten Sie nach der Paarung einen positiven vaginalen Stecker am E0.5.
    2. Um genügend Material haben, verwenden Sie einen Wurf NMRI Mäuse für ein H3K79me2 ChIP von Cortex von E12.5 oder E14.5. Verwenden Sie für später embryonalen Phase einen Wurf für weitere ChIP-Analysen (durchschnittliche Wurfgröße NMRI: 10 Embryonen).
    3. PreCool Hank´s ausgewogen Salz-Lösung (HBSS) und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 4 ° C (langfristige Lagerung bei RT).
    4. Equilibrate 4 ° C gelagert Trypsin-EDTA (0,05 % w/V) auf 37 ° C.
    5. Vorbereiten kortikalen Zelle Medium (CCM): Ergänzen Sie das Medium für Neuronen (siehe Tabelle der Materialien) mit Endkonzentrationen Zuschlag von 2 % (V/V) B-27, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL Glutathion, 0,5 mM L-Glutamin, Superoxid-Dismutase 0,8 µg/mL und 1 % (V/V) Antibiotikum Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mischung. Bei 4 ° c lagern Für das Experiment equilibrate Mittel-bis 37 ° C.
    6. Auftauen von fetalen Kälberserum (FCS), aliquoten es (50 mL), und equilibrate eine aliquote auf 37 ° C (langfristige Lagerung bei-20 ° C).
    7. Zellkultur Bestände der DNAse-1 (10 mg/mL) in H2O vorbereiten. Speichern Sie Aliquote bei-20 ° C.
    8. Bei Bedarf lösen sich die spezifischen DOT1L Inhibitoren Fez-5676 oder SGC0946 in DMSO Lager Konzentration von 100 mM. Anwenden einer Ende-Konzentration von 1 bis 5 µM auf die Zellen am Tag 0 und erneut der Inhibitors alle zwei Tage.
    9. Für den CPC Anbau Mantel Kultur Zellplatten (6 Brunnen oder 12 gut) mit Poly-L-Ornithin Hydrobromide (1 mg/mL 150 mM Borsäure pH 8,4) für mindestens 1 h bei RT und danach mit Laminin (1 mg/mL) in CCM-Medium bei 37 ° C über Nacht.
  2. Vorbereitungen für CGNP Isolierung
    1. Organisieren Sie eine geeignete Paarung von Mäusen, P5-P7 Tiere für die Isolierung des Kleinhirns (3-5 Tiere pro ChIP und Zustand) zu generieren.
    2. Bereiten Sie HBSS/Glucose durch Zugabe von 6 mg/mL Glukose in HBSS Puffer.
    3. Vorbereiten der CGNP Zellkulturmedium (CGM) durch Zugabe von N2 Zuschlag von 1 % (V/V), 1 % (V/V) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl und 10 % FCS, DMEM-F12. Für den CGNP Anbau bereiten CGM Medium ohne FCS inklusive 0,6 µg/mL sonic Hedgehog (SHH) (CGM-SHH) und auf 37 ° C bei Bedarf equilibrate.
    4. 6-Well Zellplatten Kultur mit 100 µg/mL Poly-D-Lysin für 1-2 h bei RT Glia-Zellen entfernen zu beschichten. Danach waschen Sie zweimal mit sterilen DdH2O und lassen Sie die Platten trocknen. Speichern Sie die Platten für maximal eine Woche bei 4 ° C.
    5. Für den Anbau von CGNPs Mantel 6-Well Kultur Zellplatten mit Poly-L-Ornithin (0,1 mg/mL) bei 4 ° C über Nacht. Danach waschen Sie zweimal mit H2O für die Zellkultur und lassen Sie die Platten trocken.
      Hinweis: Die Platten können für maximal eine Woche bei 4 ° c gelagert werden
    6. 0,025 % Trypsin (w/V) in HBSS/Glukose vorbereiten und auf 37 ° C bei Bedarf equilibrate.
  3. Vorbereitungen für ChIP von H3K79me2
    1. Bereiten Sie PFA (1 % mit PBS-Puffer, pH 8) frisch vor Vernetzung Chromatin. Zur Vorbereitung PFA 50 mL PBS in der Mikrowelle bis max. 65 ° c erhitzen Fügen Sie bei ständigem Rühren 0,5 mg PFA PBS hinzu. Fügen Sie dann 50 µL 10 M NaOH und warten Sie, bis PFA aufgelöst wird. Danach fügen Sie 42,5 µL HCl (37 % V/V) zu einem pH-Wert von 8. Überprüfen Sie den pH-Wert wieder und lassen Sie dann die 1 % PFA Lösung erreichen RT
    2. Bereiten Sie Bestände der RNase (1 mg/mL) und Proteinase K (20 µg/µL) separat in sterilen DdH2O. speichern die Aliquote bei-20 ° C.
    3. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Reagenzien: PBS mit 0,02 % Tween, Lysis Puffer, Glycin, Verdünnungspuffer, ChIP-TE-Puffer, Puffer 1, ChIP Puffer 2 und ChIP Puffer 3 und bei 4 ° c lagern Vorbereiten der Elution Buffer frisch jedes Mal.
      1. Bereiten Sie PBS mit 0,02 % Tween. Bei den meisten eine Woche bei 4 ° C.
      2. Bereiten Sie Lyse-Puffer mit 50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 1 x Protease-Inhibitor vor.
      3. 2,5 M Glycin vorzubereiten.
      4. Bereiten Sie Verdünnungspuffer mit 20 mM Tris bei pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100, 0,25 % (w/V) SDS und 1 x Protease-Inhibitor.
      5. ChIP-Puffer 1 mit 20 mM Tris bei pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100 und 0,2 % (w/V) SDS vorbereiten.
      6. ChIP-Puffer 2 mit 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) Triton x-100 und 0,2 % (w/V) SDS vorbereiten.
      7. ChIP-Puffer 3 mit 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCI, 2 mM EDTA, 1 % (V/V) NP-40 und 1 % (w/V) SDS vorbereiten.
      8. Bereiten Sie TE-Puffer mit 20 mM Tris pH 8.0 und 2 mM EDTA vor.
      9. Bereiten Sie frische Elution Puffer mit 1 % (w/V) SDS, 100 mM Nahco33.

(2) neurale Vorläuferzellen Isolation von Hirngewebe

  1. Isolation und optionalen Anbau des CPCs
    1. Einschläfern trächtige Tiere durch zervikale Dislokation und transfer der Embryonen zum eiskalten HBSS.
    2. Den Schädel mit einer Schere und isolieren Sie das Gehirn zu, dann entfernen Sie der Hirnhäute, ggf. mit kleinen Zangen und isolieren Cortex (ganz, DT oder VT) beider Gehirnhälften durch alle anderen Gehirn-Teile im binokularen Rahmen mit kleinen Pinzette entfernen und, wenn notwendig, kleine Schere. Speichern Sie die isolierten Cortex in 5 mL HBSS Puffer bei 4 ° C in einer 15 mL Tube.
    3. Zentrifugieren Sie das isolierte Gehirn Material für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C.
    4. Waschen Sie die Rinde mit 5 mL eiskaltes HBSS und homogenisieren sie mit einer Pipettenspitze 1 mL durch Pipettieren rauf und runter. Falls nötig, schneiden Sie die Spitze der Pipettenspitze.
    5. Zentrifugieren der homogenisierten Probe für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie die HBSS.
    6. 3 mL Trypsin und inkubieren die Probe für 5 min bei 37 ° c
    7. Fügen Sie 1 mL FCS, 5 mL CCM und 30 µL DNase 1 zur Probe und homogenisieren der Probe mit einer 5-mL-Glas-Pipette durch Pipettieren vorsichtig rauf und runter.
    8. Zentrifugieren Sie die isolierten Zellen für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Verwerfen Sie überstand, geben Sie 5 mL CCM und homogenisieren Sie die Probe wieder zu.
    9. Ein Aliquot der Probe verdünnen und mit einem Neubauer zählen-Kammer zählen. Eine durchschnittliche Höhe von 4.5 x 106 Zellen pro Embryo wird erwartet. Anbau von isolierten CPCs fahren Sie fort mit Schritt 2.1.10. Für ChIP sofort mit Schritt 3 fortfahren.
    10. Für den Anbau Platte die CPCs auf Poly-L-Ornithin (0,1 mg/mL) und Laminin (1 mg/mL) beschichtet Gerichte bei einer Dichte von 8 x 104 und 2,5 x 105 Zellen/cm2 CCM Mittel- und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO2und 100 % Relative Luftfeuchtigkeit.
    11. Da die CPCs beginnen, in Neuronen in der Zellkultur (nach ca. 4 Tagen) zu unterscheiden, betrachten Sie die Dissektion Datum als Tag in-vitro- 0 (Tag 0). Für längere Laufzeiten des Anbaus ändern Sie die Hälfte des Mediums jeden vierten Tag mit frischen CCM Medium.
    12. Anwenden von 1-5 µM SGC0946 oder EPZ5676 am Tag 0 (4-5 h nach Zelle isoliert) in DMSO gelöst und aktualisieren es jeden zweiten Tag. Verwenden Sie DMSO als eine Kontrolle der Behandlung. Testen Sie die Effizienz der Inhibitor Behandlung per standard Immunoblot Methoden, falls erforderlich.
  2. Isolation und optionalen Anbau von CGNPs
    1. Einschläfern Sie P5-7 Tiere durch Enthauptung mit einer Schere. Die Kopfhaut, öffnen Sie den Schädel zu und entfernen Sie das Gehirn mit kleiner Schere und Zange. Das Kleinhirn zu isolieren und überträgt es auf eiskalte HBSS/Glukose. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Blutgefäße und übertragen Sie die Cerebella in 15 mL Röhrchen gefüllt mit kaltem HBSS/Glucose zu.
    2. Waschen der Cerebella dreimal mit 10 mL eiskalte HBSS/Glucose (sammeln sie durch Zentrifugation bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C) und homogenisieren Cerebella anschließend durch sanft nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette Pipettieren (maximal 2-3 Mal) zu 0,5-1 mm3 Fragmente.
    3. Fügen Sie 5 mL von 0,025 % Trypsin in HBSS/Glucose und inkubieren Sie das Gewebe unter ständigem Rühren im Wasserbad 37 ° C für 15 min. Stop die Verdauung durch Zugabe von 5 mL CGM und sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C.
    4. Den Überstand zu entfernen und das Gewebe mit einer 1 mL Pipettieren Spitze in 1 mL CGM genannte und überträgt es auf eine neue 15 mL Tube.
      Hinweis: Es ist wichtig, um Luftblasen zu vermeiden.
      1. Geben Sie 5 mL CGM und inkubieren Sie die Mischung für 2 min auf Eis Gewebe Reste zu begleichen. Übertragen Sie den Überstand in eine neue 15 mL Tube. Das verbleibende Gewebe 2 mL CGM hinzu, und wiederholen Sie den Vorgang der Verreibung.
    5. Die Überstände (ohne Gewebe Reste, insgesamt ca. 10 mL) zu bündeln und Zentrifugieren bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C, die zerebelläre Zellen zu sammeln. Das Pellet in 10 mL CGM aufzuwirbeln.
    6. Da Astrozyten schneller und stärker Poly-D-Lysin als CGNPs anhaften, Platte die Zellen auf 100 µg/mL Poly-D-Lysin beschichteten 6-Well-Platten (bis zu 4 mL pro Well) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 ° C, die Astrozyten zu entfernen.
    7. Schütteln Sie die Platte und sammeln Sie den Überstand zu. Dann bei 650 X g für 5 min bei 4 ° C in einem 15 mL Röhrchen zentrifugieren. Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL CGM und zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer zählen.
      Hinweis: CGNPs sind rund, klein und zeigen einen Heiligenschein wenn mit Phasenkontrastmikroskopie.
    8. Wenn erforderlich, Samen der Zellen bei 37 ° C vorgewärmt CGM auf Poly-L-Ornithin-beschichtete Platten (3 x 106 Zellen pro 6-Well) und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO2 und 100 % relativer Luftfeuchte.
      Hinweis: Erfolgt die Aussaat nicht, weiter Schritt 3.1.
      1. Tauschen Sie nach 6 bis 12 h Mittel-und CGM-SHH. Die isolierte CGNPs 6 h zu behandeln (oder beim Wechsel auf CGM-SHH) nach Isolierung mit DOT1L-Inhibitor und DMSO kontrollieren und erneuern sie jeden zweiten Tag (Vergleiche mit 2.1.12). Die Effizienz der Inhibitor Behandlung per standard Immunoblot Methoden zu testen, falls erforderlich. ChIP fahren Sie fort mit Schritt 3.3.
        Hinweis: CGM verlassen, auf den Platten (und mit diesem FBS) Differenzierung von der CGNPs in zerebelläre granulare Neuronen (CGNs) führt.

(3) Fixierung der Zellen und Scheren von Chromatin

Hinweis: Führen Sie Schritte 3.1 und 3.2, wenn Zellen nicht kultiviert werden, wenn sie sind, fahren Sie mit Schritt 3.3.

  1. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation für 4 min bei 1.000 x g und 1,3 mL PBS. Übertragen Sie die Probe auf eine 1,5 mL-Tube. Zentrifuge für 4 min bei 1.000 x g bei 4° C. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit 1,3 mL PBS.
  2. Entscheidender Schritt: Fügen Sie 350 µL 1 % PFA zur Probe und 5 min bei 22 ° c inkubieren Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 18,4 µL Glycin und 1 mL PBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 1000 X g bei 4 ° C.
    1. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit eiskaltem PBS. Sammeln Sie die festen Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000 X g und 4 ° C. Von nun an halten Sie die Proben auf Eis.
      Hinweis: Die Fixierzeit muss genau 5 min optimale Ergebnisse zu erzielen. Andere Zelle Zahlen können Zeit Anpassungen erfordern.
  3. Entscheidender Schritt: Kultivierten CGNPs (oder CPCs), fügen Sie bis zu 1 mL 1 % PFA direkt in die Zelle Kultur Platte Vertiefungen. Fügen Sie nach einer 5 min Inkubation bei 22 ° C einen entsprechenden Betrag von Glycin und PBS und ernten Sie die Zellen mit einer Zelle-Spachtel.
    1. Übertragen Sie die Zellen in 1,5 mL Tuben und Zentrifugieren der Probe für 5 min bei 1000 x g und 4 ° C. Waschen Sie die Stichprobe zweimal mit eiskaltem PBS. Sammeln Sie die festen Zellen durch Zentrifugation für 5 Minat 1.000 x g bei 4 ° c Von nun an halten Sie die Proben auf Eis.
  4. Entscheidender Schritt: Fügen Sie 700 µL Lyse Puffer (+ Protease-Hemmer) und inkubieren die Probe für 15 min bei 4 ° c Wirbel der Probe alle 5 min. Scheren das Chromatin der lysierten Zellen 3 x 10 min in der Sonikator (30 s-Pulse, 30 s Pause) bei maximaler Leistung.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke nicht mehr 350 µL pro Röhre als. Wirbel die Proben alle 10 min. überprüfen lysate verbleibenden Kerne mit dem Phasenkontrast-Mikroskop.
      Hinweis: Es ist wichtig, um optimale Schur Ergebnisse (Vergleiche Abbildung 1 b) für die spätere Analyse. Optimieren Sie bei der Verwendung von anderen Methods für das Chromatin Scheren die Scheren, Chromatin Fragmente Größen zwischen 200-500 bp.
  5. Pellet-Zelle Reste für 13.000 x g, 10 min, 4 ° C. Den Überstand für den preclearing Schritt 5.2 zu verwenden. Eingefroren Sie die Probe bei-20 ° C für eine spätere Verwendung.

4. Vorbereitung der Perlen und Preclearing

  1. Waschen Sie 45 µL Protein A magnetische Beads/ChIP und 20 µL magnetischen Perlen/Probe mit 1 mL eiskaltem PBS mit 0,02 % Tween dreimal mit einem Magnetstativ. Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS zu den Perlen.
  2. Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS 45 µL Perlen/ChIP hinzu, und 3 µg Antikörper/ChIP (H3K79me2 oder Kaninchen IgG). Inkubieren Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C auf ein Rotator die Antikörper binden an die Perlen. Verwenden Sie abhängig von der Antikörper ~ 3 µg Antikörper/ChIP.
  3. Die Antikörper-Bindung-Perlen dreimal waschen, mit 1 mL eiskaltem PBS mit 0,02 % Tween. Die gewaschenen Antikörper-gekoppelt-Perlen fügen Sie der entsprechenden Perle Band (ab Volumen der magnetischen Beads verwendet hinzu) von eiskaltem PBS.
  4. Die Probe für die preclearing (Gesamtvolumen 1.320 µL) 600 µL Verdünnungspuffer und 20 µL der gewaschenen magnetische Beads hinzu und 2 h bei 4 ° C auf ein Rotator inkubieren. Entfernen Sie die Perlen mit einem Magnetstativ. Nehmen Sie 5 % (33 µL) von Lysaten als Eingabe Proben und frieren sie bei-20 ° C.

(5) Chromatin Immunopräzipitation

  1. Teilen Sie den precleared Extrakt in zwei Röhren (ca. 643.5 µL), fügen Sie die gleiche Menge an Verdünnungspuffer und Antikörper-Bindung-Perlen (45 µL/Probe; H3K79me2 oder Kaninchen IgG). Inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht auf ein Rotator.
  2. Waschen Sie die Perlen mit eiskalten ChIP Puffer 1 ChIP Puffer 2 und ChIP Puffer 3 für 10 min bei 4 ° C auf ein Rotator. Waschen Sie danach dreimal mit TE-Puffer für 5 min bei 4 ° C auf ein Rotator.
  3. Eluieren Sie die Perlen mit Elution Puffer für 1 h bei 1.400 u/min in einem Shaker bei Raumtemperatur.
  4. Den Eingang Proben 10 µg RNase (1 mg/mL) pro ChIP Probe und 5 µg hinzugefügt und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 37 ° C (1.400 u/min).
  5. Hinzufügen von 100 µg Proteinase K (20 µg/µL) pro ChIP Probe und 50 µg pro Eingang und über Nacht bei 65 ° C bei 1.400 u/min inkubieren.

6. Reinigung der ChIP Proben

  1. Der ChIP und Eingabesamples mit einem DNA-Reinigung reinigen kit (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend der Bedienungsanleitung. Mehr Reinigung Spalten zu verwenden, wenn mehr als 5 µg DNA erwartet wird. Eluieren Sie Probe mit 2 x 15 µL des Puffers DNA Elution im Kit enthalten.
  2. Quantifizierung der Proben (mit 1 µL) mithilfe einer Visualisierung Fluorophor und eine Fluorospectrometer ausführen (siehe Tabelle der Materialien).

7. Analyse der ChIP Proben über qPCR

  1. Rufen Sie für besser gekleideteres Design für qPCR Analyse Genomsequenzen von Interesse aus der Integrative Genomics Viewer (IGV) Browser34 ab. Primer auf die transkriptionelle Startsite (TSS) eines Gens zu entwerfen, da H3K79me2 angesiedelt werden dürfte. Als Kontrolle, betrachten nicht-kodierenden genomische Regionen oder Regionen etwa 10 Kb stromaufwärts der TSS oder 10 Kb flussabwärts vom transkriptionelle Ende Website (TES).
    1. Die Primer mit https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ mit einer Größe zwischen 70 und 200 bp zu generieren und eine optimale Temperatur von 60 ° c voreingestellt Verwenden Sie für Testzwecke Primer für die genomischen Regionen Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, und Npm1 in Tabelle 1aufgeführten.
  2. Testen Sie neu gestaltete Primer mit dem folgenden qPCR-Programm, master-Mix und ein Glühen Temperaturgefälle zwischen 58 ° C und 63 ° C zu, und wählen Sie die Anlasstemperatur mit dem höchsten Produkt Quantität und Qualität.
    1. Gelten Sie DNA-Gelelektrophorese die erwartete Produkt Größe. Für qPCR Analyse verwenden ein System zur Erkennung von Real-Time PCR (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Bereiten Sie den master-Mix mit 10 µL DNA-Polymerase-master-Mix, 0,5 µL Grundierung nach vorne (10 µM), 0,5 µL Grundierung reverse (10 µM), 4 µL Nuklease-freies Wasser und 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Verwenden Sie eine 2-stufige qPCR-Programm wie folgt: 5 min bei 95 ° C, 50 X (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 58 ° C - 63 ° C), und Denaturierung Gefälle ständig bei 4 ° C.
  3. Erstellen Sie einer Verdünnungsreihe von genomischen, geschoren, gereinigte DNA-Proben (2 ng/µL, 1 ng/µL 0,5 ng/µL, 0.25 ng/µL und 0,125 ng/µL) und 5 µL für eine Effizienz-Test mit qPCR. Die Neigung der Standardkurve bestimmen und die Grundierung Effizienz nach folgender Formel zu berechnen:
    Wirkungsgrad (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Primer mit Wirkungsgraden zwischen 90 % und 105 % im Idealfall oder verwenden zumindest mit einem Wirkungsgrad von 85 bis 115 %.
  4. Um den ChIP und Eingabesamples zu analysieren, gelten 0,1-1 ng DNA-ChIP-gemischt mit jeweiligen vorwärts- und rückwärts-Primer, Nuklease-freies Wasser und DNA-Polymerase Master mix in einem Endvolumen von 20 µL für jede qPCR-Reaktion.
  5. Bestimmen Sie die Schwellenwerte Zyklus (C-t) von ChIP und Eingabesamples und normalisieren Sie die Probe Ct Ct -Werte der Eingabe an Enrichment (% Eingang) mit folgender Formel berechnen. Verwendung Ct Werte aus IgG-Steuerelements, um die Hintergrund-Ebene zu bestimmen.
    % Eingabe = 100-2^(Norm. Eingabe − Norm. -ChIP)
    Norm. Eingabe = Ct (Eingang) − Log2(Verdünnungsfaktor)
    Norm. ChIP = Ct (ChIP) − Log2(Verdünnungsfaktor)
    Hinweis: Norm. = normalisierte

8. Analyse der ChIP Proben durch Sequenzierung

  1. Übertragen Sie die ChIP-Proben (ein- und Immunoprecipitated DNA-Probe) auf eine Sequenzierung-Anlage.
  2. Zur Vorbereitung einer Bibliothek im Voraus Nutzung eine entsprechende Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien) und konvertieren 2 ng der Eingabe DNA und alles, was der Immunoprecipitated DNA in indizierten Bibliotheken für nächste Generation multiplex-Sequenzierung auf der angegebenen Plattform (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Entscheidender Schritt: Folgen Sie den Anweisungen Kit verbinden Sie Sequenzierung Adapter (mit einer Arbeit Konzentration von 15 µM) repariert und dA-angebundene DNA-Fragmente zu beenden. Für Sequenzierung Adapter und PCR verwenden Primer geeignete Oligos (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie für diese Menge an Eingaben DNA 6-9 PCR-Zyklen, um Adapter ligiert DNA-Fragmente zu bereichern.
    Hinweis: Normalerweise ist es nicht notwendig, eine Größenauswahl der Adapter ligiert DNA durchzuführen. Es empfiehlt sich, möglichst wenige PCR-Zyklen wie möglich, da viele PCR Duplikate PCR Verstärkung Zyklen führen und einen hohen GC-Bias zu verwenden.
  4. Für eine endgültige Bibliothek überprüfen, nehmen Sie 0,5 µL der gesamten Reaktion für Analyse, Größenverteilung auf ein entsprechendes Gerät zu visualisieren (siehe Tabelle der Materialien). Zur Quantifizierung verwenden Sie einen Visualisierung Farbstoff in Kombination mit einem Fluorospectrometer oder anderen Methoden (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Da H3K79me2 eine Histon-Modifikation, die im großen und ganzen über größere genomische Regionen verteilt ist scheint, Reihenfolge der Proben gepaart-Ende mit einer lesen Sie Länge von 50 bp und Sequenzierung Bautiefe 75 Mio mal gelesen.
  6. Die ChIP-Seq-Daten mit dem Galaxy/Uni Freiburg Server (galaxy.uni-freiburg.de) analysieren.
  7. Durchführen Sie Qualitätskontrolle mit erhaltenen ChIPseq mit FastQC und gegebenenfalls ordnen Sie diese direkt mit Bowtie2 Version 2.2.035 mit oder ohne trimmen. Als Referenz Genom Assembly verwenden mm9 oder die neueste Version mm10; und als Referenz Annotation Ensembl FTP veröffentlichen 79.
  8. Optional: Entfernen Sie lesen Duplikaten mit Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) vor dem Gipfel-Aufruf.
  9. Rufen Sie Gipfeln mit MACS2 Version 2.1.036 mit der 'Breite' Option für H3K79me2.
  10. Verhältnis der beiden Proben verwenden um ein Log2 Verhältnis zwischen ChIP und Eingabesample, Log2 die Anzahl der Lesevorgänge des lautet zu erhalten BamCoverage und BamCompare.
  11. Gelten Sie für alle anderen ChIP-Seq spezifische Tiefenanalyse deepTools2 Version 2.3.5 oder 2.4.137, d. h. , Abdeckung Trackdateien (BamCoverage für den ChIP nur, BamCompare für den Vergleich des Chips an den Eingang) zu generieren, um den ChIP zu schätzen Leistung verwenden PlotFingerprint und erzeugen ein allgemeiner Überblick über ComputeMatrix, PlotHeatmap. Wählen Sie K-Mittelwert Clusterbildung während des ComputeMatrix-Prozesses zur cluster-genomischer Regionen entsprechend der H3K79me2 Verteilung.
  12. Nutzung veröffentlichten ChIP-Seq-Daten als H3K79me2 der E14.5 DT hinterlegt bei NCBI für Testzwecke (Accession Number: SRP057733).

Ergebnisse

Allgemeine Systematik der neuronalen Vorläuferzellen Isolation, Anbau, H3K79me2 ChIP und ChIP-Analyse-Methoden: Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm H3K79me2 ChIP der kortikalen Vorläuferzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung des embryonalen Gehirns oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter in postnatale Phasen durchführen. Als ersten Schritt das Gehirn isoliert werden und das Telencephalon (zwischen E11.5 und E14...

Diskussion

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um führen Sie Chromatin Immunopräzipitation um die genomische Belegung der Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren, Histon-Code-Leser, Autoren oder Radiergummis zu erkennen. Eine ist die native ChIP-Methode mit Nuklease verdaut, native Chromatin für Immunopräzipitation, und die andere ist die vorgestellte Methode mit PFA-repariert, abscherend Chromatin, in dem die Nukleosomen und andere DNA-attached Proteine kovalent an die DNA gebunden sind 39. native...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte

Danksagungen

Wir danken für die Unterstützung der CGN-Anbau-Protokoll im Labor herstellen Henriette Bertemes. Dieser Methode Papier wurde von der DFG-geförderten CRC992 medizinische Epigenetik unterstützt, durch die Finanzierung zu TV. Die Autoren erkennen die Unterstützung von Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning und Prof. Rolf Backofen, Bioinformatik, Universität Freiburg, Deutschland finanziert Collaborative Research Center 992 medizinische Epigenetik (DFG Stipendium SFB 992/1 2012) Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF Grant 031 A538A RBC (de.) NBI)).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

Referenzen

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