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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在本协议中, 我们描述了一种利用高密度肽芯片来发现 Zika 病毒特异性诊断肽的技术。该议定书可 readly 其他新出现的传染性疾病。

摘要

高密度肽微阵列允许在一张标准显微镜幻灯片上筛选超过6000多肽。该方法可应用于药物的发现、治疗目标的识别和诊断的发展。在这里, 我们提出了一个协议, 以发现特定的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断肽使用高密度肽芯片。用一种高密度肽微阵列对 ZIKV 感染进行了验证, 该芯片含有将整个 ZIKV 蛋白转化为3423个独特的15线性氨基酸 (aa) 残留物, 并重复打印 14 aa 的残留重叠。在同一阵列内染色不同的二次抗体, 我们检测到与血清中存在的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 抗体结合的肽。选择这些肽进行进一步的验证实验。在本协议中, 我们描述了在设计、处理和分析高密度肽芯片时所采用的策略。

引言

基于临床症状的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断具有挑战性, 因为它与登革热和基孔肯亚病毒感染的传播媒介、地理分布和症状有关1。鉴于怀孕期间感染 ZIKV 的妇女面临不良妊娠结局的风险, 区分3病毒是很重要的。虽然目前的分子诊断测试是特定的, 但它们只在血液或唾液中有用, 在相对较短的急性感染期间2,3。血清学检测是诊断这一初始感染期以外的重要4。

ZIKV 特异性血清学检测的发展具有挑战性的两个原因: 一是人类免疫系统反应的 Zika 抗原目前尚不为人所知;第二, 保守的 flaviviruses 氨基酸序列诱导抗体的交叉反应性。我们的目的是发现独特的 ZIKV 特定肽用于诊断。已经开发出不同的方法来筛选包括噬菌体、细菌和酵母表面在内的整个蛋白质的肽库, 显示5,6,7,8,9, 10。我们的战略是使用高密度肽芯片, 允许快速和廉价的高通量血清学筛查11,12 , 随后确定的肽可用于改善目前的血清学检测 ZIKV 感染的方法。

此协议允许使用高密度肽芯片 (图 1) 发现 Zika 病毒特定诊断肽。采用多肽激光印花技术制备高密度肽微阵列。整个 ZIKV 蛋白序列由3423种基于法国玻利尼西亚应变 (基因库: KJ776791.2) 的氨基酸残留物印在标准玻璃上, 在15条线性残留物块中, 重叠14个氨基酸残留物, 以复制共6846个肽斑。除了整个 Zika 蛋白序列多肽, 微阵列利用流感血凝素 (HA) 肽进行内部控制.

Zika 证实的阳性血清样本 (纽约州奥尔巴尼) 获得, 用于鉴定特定的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 活性肽。在一夜之间用样本孵化后, 微阵列被染成二级 fluorochrome 共轭抗体 (抗人 IgM 或抗人 IgG), 并在微阵列扫描仪上进行分析。用制造芯片的同一公司提供的特定软件对光斑强度和肽标注进行量化。

研究方案

这些数据是纽约大学牙科学院正在进行的研究研究的一部分, 由纽约大学医学院的机构审查委员会批准, H10-01894。本研究中使用的临床样本是以前用于诊断的不确定样本, 并得到纽约州奥尔巴尼的美国卫生部的沃斯德中心的许可。

1. 在特定的孵化盘中安装 ZIKV 高密度肽微阵列幻灯片

  1. 使用无粉手套处理玻璃滑边。玻璃滑动尺寸是75.4 毫米25.0 毫米和1毫米厚。将幻灯片放在孵化盘中, 微阵列表面朝上。
  2. 将密封面的光泽面向下放置在微阵列打印表面上。为了保证良好的位置, 请将密封件和底板的螺钉孔重叠。
  3. 将托盘上部放在密封上, 以创建微阵列腔。
  4. 固定在托盘中的幻灯片, 通过在一个交替的模式, 从左上角开始, 然后右下角, 同样地拧紧螺钉。放置孵化盘的盖子。

2. 背景相互作用检测: 用二次抗体染色微阵列

注: 使用吸管将溶液 (标准和阻塞缓冲器, 稀释后的二级抗体) 存入芯片室的拐角处。

  1. 用标准缓冲器 (1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 0.05% 吐温 20, pH 值 7.4, 用0.45 µm 过滤器 (总容积2000µL/微阵列) 孵化芯片, 在 rpm 的轨道振动筛室温下 (RT) 进行15分钟的检测。
  2. 通过从微阵列腔的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。用空白幻灯片填充空幻灯片持有者, 以防止微阵列幻灯片的中断。
  3. 在 140 rpm 的轨道振动筛上, 用阻塞缓冲器 (总容积2000µL/微阵列) 拦截60分钟的微阵列。
  4. 在微阵列腔的拐角处用吸管抽吸, 以去除堵塞缓冲器。
  5. 用二级抗体孵化微阵列, 抗人 IgM fluorochrome 共轭, 稀释 1: 5000 (总容积2000µL/微阵列) 在染色缓冲器 (10% 阻塞缓冲器在标准缓冲器) 为30分钟在黑暗中 RT 在一个轨道振动筛在140rpm.
  6. 在微阵列腔的拐角处用吸管吸除二次抗体。
  7. 用标准缓冲器清洗微阵列 3x, 每洗1分钟 (总容积为2000µL/微阵列, 在 140 rpm 的轨道振动筛上。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。
  8. 将幻灯片2x 浸入新鲜准备的浸渍缓冲 (1 毫米, pH 值 7.4), (总体积为200毫升)。
  9. 仔细地干燥微阵列, 大约1分钟, 通过从顶部到幻灯片底部非常仔细地吸出多余的液体而不触及滑动面。分析微阵列扫描仪读取器中的幻灯片。

3. 微阵列暴露于宿主血清中

注意: 在实验室安全条件下执行这一步骤, 生物安全等级 2 (BSL-2), 因为血清标本的潜在感染性。在第二类生物安全柜 (BSC) 内工作。

  1. 在4°c13的5分钟内, 在1.6万个区域合作框架内对30分钟和离心机进行56摄氏度灭活血清样品。
    注: 使用吸管将溶液 (染色, 标准缓冲液和稀释后的血清) 存入芯片室的角落。
  2. 稀释血清样品在染色缓冲从 1:1, 000 (总容量 2000 ul/微阵列) 稀释。保持在4摄氏度, 直到使用。
  3. 用染色缓冲器 (2000 ul/微阵列的总容积) 孵化微阵列, 在 140 rpm 的轨道振动筛上进行15分钟的 RT。
  4. 在微阵列腔的拐角处用吸管吸出, 去除染色缓冲器。
  5. 用稀释后的血清样本在 140 rpm 的轨道振动筛上过夜, 将微阵列孵化为4摄氏度。
  6. 在微阵列的拐角处用吸管吸出稀释后的血清样品。
  7. 用标准缓冲器清洗微阵列 3x, 每洗1分钟 (总容积 2000 ul/微阵列在轨道振动筛 140 rpm。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。

4. 用二次抗体染色和标记控制抗体

注: 使用吸管将溶液 (标准缓冲器, 稀释的二次和标签抗体) 存入芯片室的拐角处。

  1. 稀释染色缓冲器中的二次抗体。
    注: 使用抗人 IgM fluorochrome 共轭抗体或抗人 IgG fluorochrome 共轭抗体稀释 1:5, 000 (总容积2000µL/微阵列) 染色缓冲器。
  2. 混合控制标签抗体 (单克隆抗 HA fluorochrome 共轭) 在稀释 1:1, 000 (总容量 2 000 µL/微阵列) 在染色缓冲器与二次抗体以前稀释在染色缓冲。
  3. 用微阵列孵育30分钟, 在黑暗的轨道振动筛在 140 rpm。
  4. 在微阵列的拐角处用吸管抽吸, 去除稀释后的二级和标签抗体的混合。
  5. 用标准缓冲器清洗 3x (总容积为2000µL/微阵列)。每个洗涤是1分钟在一个轨道振动筛在140转每分钟。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。

5. 微阵列扫描

  1. 将幻灯片2x 浸入新鲜准备的浸渍缓冲液 (1 毫米, pH 值 7.4) (总体积为200毫升)。
  2. 仔细地干燥芯片, 大约1分钟, 通过非常小心地从顶部到幻灯片底部, 而不触及幻灯片表面。
  3. 按照扫描仪的说明扫描微阵列。将幻灯片置于扫描仪上, 打印面朝上。
  4. 创建一个新项目并选择扫描区域。将扫描仪参数设置为: 分辨率:21 µm, 强度为700和 800 nm 通道: 7.0, 扫描质量: 中和偏移: 0.8。
  5. 获取并保存扫描原始图像作为16位灰度 TIFF 文件格式。

6. 使用特定软件的微阵列分析

  1. 打开原始图像 (TIFF 图像)。打开阵列网格文件。
  2. 使用计算机的鼠标或键盘箭头键将阵列网格与扫描图像对齐。
  3. 在特定软件中选择 "量化选择", 它创建一个读数文件, 其中包含每个点的信号强度、背景值和相应的肽序列。
    注意: 此输出文件还可以导入到电子表格程序中, 以进行其他分析和绘图。

7. 微阵列存储

  1. 储存在黑暗中密封的微阵列在4°c 下无氧氮气或氩气。

结果

由制造芯片的同一公司提供的特定软件对扫描后的微阵列进行了分析。所创建的读出文件包含每个点的信号强度、背景值和相应的肽序列。通过绘制在从原始值中减去背景后获得的绿色前景中值 (图 3), 可以直观地描绘出每个肽对 IgM 有强烈反应的斑点荧光强度。

讨论

我们设计了一个协议, 利用高密度肽芯片包含整个 Zika 病毒蛋白序列 (法国玻利尼西亚人菌株)。该芯片是通过打印3423不同的重叠线性多肽制造的。每一个肽是15氨基酸并且由它的最近的邻居仅一个残余在序列 (例如, 14 残余重叠) 变化。虽然可以打印较短的重叠, 但表位映射更精确, 重叠时间更长。每一个肽都以重复打印, 以提高可靠性。

重要的是开始的过程中, 预先染色?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

目前的支持由 NIDCRR44 DE024456 的 SBIR (小型企业创新研究) 行政补充补助金提供。NIDCR 艾滋病毒补助金的发展 NIDCR 赠款 U01 DE017855, 以制定一个验证性的护理点诊断艾滋病毒。我们感谢 Silke Weisenburger (德国海德堡 PEPperPRINT) 的技术援助和亲切支持。我们还感谢纽约大学朗格尼医学中心的李-林奥德赛成像系统。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

参考文献

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