Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

요약

이 프로토콜에서 우리 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 기법을 설명 합니다. 이 프로토콜 readly 다른 신흥 감염 증에 대 한 적응 될 수 있다.

초록

고밀도 펩타이드 microarrays 단일 표준 현미경 슬라이드에서 6 천 이상의 펩 티 드의 심사를 허용합니다. 이 방법은 약물 발견, 치료 대상 식별 및 개발에 적용할 수 있습니다 진단의. 여기, 선물이 특정 Zika 바이러스 (ZIKV) 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 프로토콜. 인간의 혈 청 샘플 ZIKV 감염 14-aa 잔류물 중복 3,423 독특한 15 선형 아미노산 (aa) 잔류물으로 번역 전체 ZIKV 단백질을 포함 하는 고밀도 펩 티 드 microarray와 알을 품는 대 한 유효성 검사 중복에서 인쇄. 동일한 배열 내에서 다른 이차 항 체와 얼룩, 우리 면역 글로불린 M (IgM) 및 혈 청에 있는 항 체는 면역 글로불린 G (IgG)에 바인딩되는 펩 티 드를 발견 했습니다. 이러한 펩 티이 드 추가 검증 실험에 대 한 선정 됐다. 이 프로토콜에서 우리는 디자인, 처리, 그리고 고밀도 펩타이드 microarray 분석 전략을 설명 합니다.

서문

Zika 바이러스 (ZIKV) 진단에 따라 임상 증상은 뎅 그 열과 Chikungunya 바이러스 감염¹벡터, 지리적 분포와 증상을 공유 하기 때문에 도전 이다. 여자 임신 중 ZIKV 감염에 불리 한 임신 결과 대 한 위험을 감안할 때, 그것은 3 바이러스 사이 구별 하는 것이 중요. 현재 분자 진단 테스트 특정 있지만, 그들은 단지 혈액 이나 타 액에 유용 급성 감염^2,3의 상대적으로 짧은 기간 동안. 혈 청 학적인 분석 실험 진단 감염⁴의이 초기 기간이 필수적입니다.

ZIKV 특정 혈 청 학적인 분석 결과의 개발은 두 가지 이유로 도전: 첫째, 인간의 면역 체계에 응답 Zika 항 현재 알려져 있지 않습니다; 그리고 두 번째, 보존 flaviviruses 아미노산 시퀀스 유도 항 체 분. 우리의 목표는 독특한 ZIKV 특정 펩 티 드 진단에 사용할 수 발견 했다. 다른 방법을 개발 되었으며, 살 균 소, 세균를 포함 하 여 전체 단백질을 다루는 화면 펩타이드 라이브러리 및 효 모 표면 표시^{5,6,7,,89, 10}. 우리의 전략은 신속 하 고 저렴 한 높은 처리량 serological 검사^11,12 를 허용 하는 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 고 이후에 확인 된 펩 티 드 serological 전류를 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. ZIKV 감염의 탐지를 위한 분석 실험입니다.

이 프로토콜 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드의 고밀도 펩타이드 microarray (그림 1)를 사용 하 여 검색을 수 있습니다. 고밀도 펩 티 드 microarray 펩 티 드 레이저 인쇄 기술을 사용 하 여 제작 되었다. 프랑스 폴리네시아 스트레인 기반 3,423 아미노산 잔류물의 구성 된 전체 ZIKV 단백질 시퀀스 (은행: KJ776791.2), 표준 유리 슬라이드에 대 한 중복 14 아미노산 잔류물의 중복 15 선형 잔류물의 블록에서에 인쇄 되었다는 총 6,846 펩 티 드 명소입니다. 전체 Zika 단백질 시퀀스 펩 티 드, 이외는 microarray 인플루엔자 조류 활용 (HA) 펩 티 드 내부 통제에 대 한.

Zika 검증 긍정적인 워즈워스 센터 (알바 니, 뉴욕)에서 얻은 혈 청 샘플 특정 면역 글로불린 M (IgM) 및 면역 글로불린 G (IgG) 반응 펩 티 드 식별 하는 데 사용 되었다. 밤새 샘플 잠복기 후에 microarray는 보조 형광 색소 활용 된 항 체 (반대로 인간 IgM 또는 반대로 인간 IgG), 물 고 microarray 스캐너에 분석. 자리 농도 및 펩 티 드 주석의 정량화는 microarray 제조 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어와 함께 수행 되었다.

프로토콜

이러한 데이터 치과의 뉴욕 대학 대학에서 실시 하는 지속적인 연구의 일부 이며는 뉴욕 대학의과 대학, IRB의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 # H10 01894. 이 연구에 사용 된 임상 샘플 드 식별된 샘플 진단 및 허가 워 즈 워드 센터의 뉴욕 국무부 건강, 알바 니, 뉴욕의 이전에 사용 했다.

1. 설치 ZIKV 고밀도 펩 티 드 Microarray 슬라이드 특정 보육 용지함에

1. 파우더 프리 글러브를 사용 하 여 가장자리에 의해 유리 슬라이드를 처리 합니다. 유리 슬라이드 크기는 25.0 m m와 1 m m 두께의 75.4 m m입니다. Microarray 표면 위로 향하도록 슬라이드 인큐베이션 트레이에 넣습니다.
2. Microarray 인쇄 표면에 아래쪽으로 직면 하는 인감의 광택 면을 놓습니다. 좋은 위치를 보장 하기 위해, 인감 및 베이스 플레이트의 나사 구멍을 겹칩니다.
3. Microarray 챔버를 만드는 장소 인감에 용지함의 위쪽 부분.
4. 강화 하 여 동일 하 게 고정 하는 손잡이 하나 다른 손을 번갈아 패턴 뒤에 오른쪽 아래 왼쪽 위에서 시작 하 여 트레이에 있는 슬라이드를 보안 합니다. 인큐베이션 트레이 뚜껑을 놓습니다.

2. 배경 상호 작용 탐지: 이차 항 체와 Microarray 얼룩

참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 및 차단 버퍼, 희석된 이차 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.

1. 표준 버퍼 (1 x 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 0.05% 트윈 20, pH 7.4, 0.45 μ m 필터 필터링) microarray를 품 어 (총 2000 µ L/microarray의 볼륨) 140 rpm에서 궤도 통에 상 온 (RT)에서 15 분.
2. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다. Microarray 슬라이드의 침입을 방지 하기 위해 빈 슬라이드에 빈 슬라이드 홀더 채우십시오.
3. Microarray 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 60 분에 대 한 블로킹 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)를 차단 합니다.
4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음에 의해 블로킹 버퍼를 제거 합니다.
5. 반대로 인간의 IgM 형광 색소 활용 된 항 체 보조와 microarray를 품 어, 희석된 1: 5000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)는 얼룩에 140 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에서 30 분 (10% 차단 하는 표준 버퍼에서 버퍼) 버퍼 rpm을.
6. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 이차 항 체를 제거 합니다.
7. 씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (2000 µ L/140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에 microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.
8. 슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4)에 x, (200 mL의 총 볼륨).
9. 건조는 microarray 신중 하 게, 약 1 분 동안 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 초과 하는 액체를 발음으로. Microarray 스캐너 리더에서 슬라이드 분석.

3. 혈 청 호스트 Microarray의 노출

주의: Biosafety 수준 2 (BSL-2) 혈 청 표본의 잠재적인 감염 특성 실험실 안전 조건 하에서이 단계를 수행 합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (BSC) 내에서 작동 합니다.

1. 30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플 및 4 ° C¹³에서 5 분 동안 16000 rcf에 원심 분리기를 비활성화.
   참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (얼룩, 표준 버퍼 및 희석된 혈 청)을 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.
2. 1:1,000 (총 양의 2000 μ/microarray) 희석 시작 얼룩 버퍼에 혈 청 샘플을 희석. 사용 될 때까지 그것은 4 ° C 유지.
3. 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 15 분 동안 얼룩 버퍼 (전체 양의 2000 μ/microarray) microarray를 품 어.
4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 얼룩 버퍼를 제거 합니다.
5. 140 rpm에서 궤도 통에 4 ° C에서 하룻밤 희석된 혈 청 샘플 microarray를 품 어.
6. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석된 혈 청 샘플을 제거 합니다.
7. 씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 2000 μ/microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.

4. 2 차 항 체와 레이블된 컨트롤 항 체 얼룩이 지기

참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 버퍼, 희석 및 레이블 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.

1. 얼룩 버퍼에서 이차 항 체 희석.
   참고: 사용 방지 인간 IgM 형광 색소 활용 항 체 또는 얼룩 버퍼에 1:5,000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)의 희석에 안티 인간 IgG 형광 색소 활용 된 항 체.
2. 혼합 컨트롤 레이블 항 체 (단일 클로 널 안티-하 형광 색소 활용 된) 1:1,000 (전체 양의 2 000 µ L/microarray) 이전 버퍼 얼룩에 희석 이차 항 체와 버퍼를 얼룩에 한 희석에.
3. RT에서 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 30 분 동안 microarray와 품 어.
4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석 및 레이블 항 체의 혼합을 제거.
5. 워시 표준 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨) 3 배. 각 세척 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 1 분입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.

5입니다. Microarray 검사

1. 슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4) (200 mL의 총 볼륨)에 x.
2. 건조는 microarray 신중 하 게, 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 발음 하 여 약 1 분.
3. Microarray 스캐너의 지침에 따라 스캔. 인쇄 된 표면 위로 향하도록 스캐너에 슬라이드를 놓습니다.
4. 새 프로젝트를 만들고 검색 영역을 선택 합니다. 스캐너 매개 변수 설정: 해상도: 21 µ m, 700와 800 nm 채널에 대 한 강도: 7.0, 스캔 품질: 매체 및 오프셋: 0.8.
5. 취득 하 고 16 비트 회색조 TIFF 파일 형식으로 스캔 raw 이미지를 저장 합니다.

6. Microarray 분석 특정 소프트웨어를 사용 하 여

1. Raw 이미지 (TIFF 이미지)를 엽니다. 배열 그리드 파일을 엽니다.
2. 컴퓨터의 마우스 또는 키보드 화살표 키 스캔 이미지를 배열 눈금에 맞춥니다.
3. 각 자리에 대 한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩 티 드 순서를 포함 하는 판독 파일을 만들어 특정 소프트웨어에서 "계량 선택"을 선택 합니다.
   참고:이 출력 파일 또한 추가 분석 및 그래프를 스프레드시트 프로그램으로 가져올 수 있습니다.

7. Microarray 스토리지

1. 산소 무료 질소 또는 아르곤 가스에서 4 ° C에서 어둠 속에 봉인 microarray를 저장 합니다.

결과

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 그림 2 에 표시 된 및 그림 3. 아니 배경 상호 작용 미리 보조 안티 인간 IgM (데이터 표시 되지 않음) microarray 얼룩 때 지적 했다. 공액 배경 녹색 형광 강렬, 이러한 펩 티이 드에 IgM와 호스트 혈 청 샘플 (그림 2)에서 바인딩을 나타내는 위의 여러 분야에...

토론

우리는 프로토콜을 포함 하는 전체 Zika 바이러스 단백질 시퀀스 (프랑스어 폴 리 네 시안 스트레인) 고밀도 펩 티 드 microarray를 이용 하 여 설계 되었습니다. microarray 인쇄 3,423 다른 겹치는 선형 펩 티 드에 의해 제조 되었다. 각 펩 티 드 아미노산 15 이었고 시퀀스 (즉, 14 잔류물 오버랩)에 가까운 이웃에서 한 잔류물에 의해 다양 한. 비록 짧은 겹침 인쇄 될 수 있다, epitope 매핑은 더 이상 중?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray	PEPperPRINT	PPC.001.001	Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1	PEPperPRINT	PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)	PEPperPRINT	PPC.037.002
PepSLide Analyzer	PEPperPRINT	PSA.004.001	14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer	Rockland	MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800	Rockland	609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680	Thermo Scientific	SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System	LI-COR
Orbital shaker device	IKA	MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator	Adobe
Deltagraph	Redrocks