JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе мы опишем способ обнаружить Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray. Этот протокол readly могут быть адаптированы для других возникающих инфекционных заболеваний.

Аннотация

Высокой плотности пептид microarrays позволяют скрининг более шести тысяч пептидов на слайде микроскопии единый стандарт. Этот метод может применяться для обнаружения наркотиков, идентификации терапевтической цели и развитие диагностики. Здесь мы представляем протокол для обнаружения конкретных диагностических пептиды Зика вирус (ZIKV), с использованием высокой плотности пептид microarray. Образец сыворотки крови человека, проверяется для ZIKV инфекции был инкубировали с высокой плотности пептид microarray, содержащий весь белок ZIKV, переведены на 3,423 уникальный 15 линейный (aa) выпарок с перекрытием 14-aa остатков печати в двух экземплярах. Окрашивание с различных вторичных антител в одном массиве, мы обнаружили пептидов, которые связывают иммуноглобулина М (IgM) и иммуноглобулина G (IgG) антител в сыворотке крови. Эти пептиды были отобраны для дальнейшей проверки экспериментов. В этом протоколе мы описываем стратегии для проектирования, обработки и анализа плотности пептид microarray.

Введение

Зика вирус (ZIKV) диагноз на основании клинических симптомов является сложной потому, что он разделяет векторов, географического распределения и симптомы инфекции вируса денге и чикунгунья1. Учитывая риск неблагоприятных исходов беременности у женщин, инфицированных ZIKV во время беременности, важно проводить различие между 3 вирусов. Хотя текущий молекулярных диагностических тестов являются специфическими, они являются полезными только в крови или слюны в относительно короткий период острой инфекции2,3. Серологические анализы необходимы для диагностики за пределами этого первоначального периода инфекции4.

Развитие ZIKV конкретных серологического анализа сложных по двум причинам: во-первых, Зика антигены, которые иммунная система человека реагирует на данный момент не известно; и во-вторых, сохранение flaviviruses аминокислотных последовательностей побудить антитела перекрестной реактивности. Наша цель состояла в том, чтобы обнаружить уникальный ZIKV специфических пептидов, которые будут использоваться в диагностике. Для экрана пептид библиотек, охватывающих весь белков, включая фага, бактериальный, были разработаны различные подходы и дрожжи поверхность отображения,5,6,,78,9 10. Наша стратегия заключалась в использовании с высокой плотностью пептид microarray дна, которая позволяет быстрый и недорогой высокопроизводительный серологических показы11,12 и впоследствии идентифицированных пептиды могут использоваться для улучшения тока серологическим анализы для выявления ZIKV инфекции.

Этот протокол позволяет открытие Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray (рис. 1). Высокой плотности пептид microarray дна был подготовлен с помощью технология печати лазерная пептида. Вся последовательность ZIKV белок, состоящий из 3,423 аминокислотных остатков на основе французской Полинезии штамм (GenBank: KJ776791.2), был напечатан на слайде стандартного стекла в блоках 15 линейных остатков с напуском 14 аминокислотных остатков в двух экземплярах для всего 6846 пептид пятен. В дополнение к весь Зика белка последовательности пептиды, microarray использует гриппа гемагглютинин пептидов (HA) для внутреннего контроля.

Зика проверяются позитивный образец сыворотки, полученные от центра Уодсворт (Олбани, NY), была использована для выявления конкретных иммуноглобулина М (IgM) и реактивная пептиды иммуноглобулина G (IgG). После инкубации с образцом на ночь, microarray витражи с вторичной флюрохром конъюгированных антител (IgM против человека или антигуманных IgG) и проанализированы на microarray сканера. Количественная оценка пятно света и пептида аннотации была выполнена с конкретного программного обеспечения, предоставляемого той же компанией, которая изготовлена microarray.

протокол

Эти данные являются частью текущих исследований исследования, проведенного в Нью-Йорке колледж университета стоматологии и были одобрены Советом по рассмотрению институциональных из Нью-Йорка школы медицины университета, IRB # H10-01894. Клинические образцы, используемые в данном исследовании были обезличенных образцы, ранее используемые для диагностики и разрешения от Уодсворт центр Нью-Йорка государственного департамента здравоохранения, Олбани, Нью-Йорк.

1. Установка ZIKV высокоплотного пептид Microarray слайд в конкретных Инкубационный лоток

  1. Обработка стекла слайд по краям, с помощью непудренные перчатки. Размеры стекла слайд являются 75,4 мм х 25,0 мм и 1 мм толщиной. Поместите слайд в Инкубационный лоток с microarray поверхностью, обращенной вверх.
  2. Поместите глянцевой стороной вниз на поверхность печатного microarray печати. Для обеспечения хорошей позиции, перекрываются отверстия для винтов уплотнение и опорной плитой.
  3. Место в верхней части панели на печать для создании microarray дна камеры.
  4. Закрепите слайд в лоток, затянув одинаково барашковые винты один за другим вручную в попеременного, начиная от левого верхнего угла, следуют внизу справа. Поместите крышку Инкубационный лоток.

2. фон взаимодействия обнаружения: Пятнать Microarray с вторичные антитела

Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (стандартные и блокировки буферов, разбавленных вторичных антител) в углу камеры microarray.

  1. Инкубировать microarray с стандартного буфера (1 x-фосфатный буфер (PBS), 0,05% 20 анимации, рН 7,4, отфильтрованные с помощью фильтра 0.45 мкм) (общий объем 2000 мкл/microarray) за 15 мин при комнатной температуре (RT) на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  2. Удаление стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray. Заполните пустой слайд Держатели с пустых слайдов для предотвращения взлома microarray слайда.
  3. Блокировать microarray с блокирующий буфер (общий объем 2000 мкл/microarray) для 60 мин на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  4. Удалите блокирующий буфер, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  5. Инкубировать microarray с вторичное антитело, антинародным флюрохром IgM проспряганное, разбавленных 1:5000 (общий объем 2000 мкл/microarray) в окрашивание буфера (10% блокирует буфер в стандартного буфера) за 30 мин при RT в темноте на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  6. Удалите вторичное антитело, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  7. Вымойте microarray 3 x, 1 мин на мыть с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray дна на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  8. Погрузите слайд 2 x в свежеприготовленные погружения буфер (1 мм трис, рН 7,4), (общий объем 200 мл).
  9. Насухо microarray тщательно, для примерно 1 мин, аспирационных лишнюю жидкость очень тщательно от верхней к нижней части слайда не касаясь поверхности слайда. Анализируйте слайд в microarray сканера читателя.

3. воздействие Microarray провести сыворотки

Предостережение: Выполняйте этот шаг в лабораторных условиях безопасности, биобезопасности уровня 2 (BSL-2) из-за потенциального инфекционного характера образцов сыворотки. Работа в рамках класса II биологической безопасности кабинета (BSC).

  1. Инактивирует образцов сыворотки в 56 ° C за 30 мин и центрифуги на 16000 РПРС для 5 мин при 4 ° C13.
    Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (окрашивание, стандартного буфера и разбавленных сыворотки) в углу камеры microarray.
  2. Разбавьте образца сыворотки в окрашивание buffer, начиная с 1:1,000 (общий объем 2000 мкл/microarray) разрежения. Держите его на 4 ° C до использования.
  3. Microarray с окрашивание буфера (общий объем 2000 мкл/microarray) Инкубируйте 15 мин на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  4. Удалите окрашивание буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  5. Инкубируйте microarray дна, с образец разбавленный сыворотки на ночь при 4 ° C на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  6. Удалите образец разбавленный сыворотки, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  7. Вымойте microarray 3 x, 1 мин на мыть с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray дна на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.

4. окрашивание с вторичные антитела и помечены управления антител

Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (стандартные буферы, разбавленным среднего и лейбл антител) в углу камеры microarray.

  1. Разбавьте вторичное антитело пятная буфера.
    Примечание: Использование антинародным флюрохром IgM проспряганное антитела или антигуманных IgG флюрохром конъюгированных антител при разбавлении 1:5,000 (общий объем 2000 мкл/microarray) пятная буфера.
  2. Сочетание управления Метка антитела (моноклонального анти-Ха флюрохром конъюгированных) при разбавлении 1:1,000 (общий объем 2 000 мкл/microarray) в пятнать буфер с вторичное антитело, предварительно разводят в пятнать буфера.
  3. Проинкубируйте с microarray для 30 мин на RT в темноте на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
  4. Удалите смеси разреженных среднего и лейбл антител, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
  5. Вымойте 3 x с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray). Каждый мыть — 1 мин на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.

5. Microarray сканирование

  1. Погрузите слайд 2 x в свежеприготовленные погружения буфер (1 мм трис, рН 7,4) (общий объем 200 мл).
  2. Тщательно высушить microarray около 1 мин, аспирационных очень тщательно от верхней к нижней части слайда не касаясь поверхности слайда.
  3. Сканировать microarray следуя инструкциям сканера. Поместите слайд на сканер с печатной поверхностью, обращенной вверх.
  4. Создайте новый проект и выберите область сканирования. Задать параметры сканера как: резолюция: 21 мкм, интенсивности для 700 и 800 Нм каналов: 7.0, качество сканирования: средний и смещение: 0,8.
  5. Приобрести и сохранить сканирования raw изображений в формате TIFF 16-битные оттенки серого.

6. Microarray Анализ с использованием конкретного программного обеспечения

  1. Откройте сырые изображения (TIFF). Откройте файл сетки массива.
  2. Выравнивание сетки массива для сканирования изображений с клавишами со стрелками мыши или клавиатуры компьютера.
  3. Выберите «Выделение количественно» конкретного программного обеспечения, которое создает значение индикации файл, который содержит интенсивности сигнала на каждом месте, значение фона и соответствующей последовательности пептид.
    Примечание: Этот выходной файл можно также импортировать в программу электронных таблиц для дополнительного анализа и построения графиков.

7. Microarray хранения

  1. Храните в темноте при температуре 4 ° C под свободного азота или аргона газообразного кислорода герметичный microarray.

Результаты

Результаты, полученные с помощью протокола описаны показаны на рисунке 2 и на рисунке 3. Без фона взаимодействия были отмечены когда предварительное окрашивание microarray с вторичной античеловеческие IgM (данные не показаны). Окраш?...

Обсуждение

Мы разработали протокол, используя microarray высокой плотности пептид, содержащий всю последовательность Зика вирус белка (Французской Полинезии штамм). Microarray был изготовлен печати 3,423 различных перекрывающихся линейной пептиды. Каждый пептид было 15 аминокислот и разнообразных остатками...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Текущая поддержка предоставляется Грант административные дополнение SBIR (небольшой бизнес инновационных исследований) от NIDCRR44 DE024456. NIDCR ВИЧ Грант, которая развилась из гранта U01 DE017855 NIDCR для развития подтверждающих точку ухода диагностики ВИЧ. Мы с благодарностью признаем Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) за ее техническую помощь и поддержку. Мы также благодарим NYU Langone медицинский центр для LI-COR Одиссея Imaging системы.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

Ссылки

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
  15. Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

130microarrayIgMIgG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены