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摘要

本文介绍了大鼠双侧髌腱缺损模型球体脐基质干细胞的制备及评价。该模型与可接受的发病率相关, 并发现检测到未治疗和治疗肌腱之间的差异, 以及两种治疗方法之间的区别。

摘要

再生医学提供了新的替代条件, 挑战传统治疗。肌腱的发病率和发病率, 加上该组织的愈合特性有限, 促使寻找细胞治疗, 推动实验模型的发展, 以研究其功效。脐带基质源性干细胞 (UCM MSC) 是吸引候选者, 因为它们丰富, 易于收集, 规避了对畸胎瘤形成的伦理关注和风险, 但与原始胚胎干细胞相比, 更接近于成人组织衍生的骨髓间充质干细胞. 对壳聚糖作为一种通过球形形成增强 MSCs 性能的策略, 具有重要的研究价值。本文详细介绍了 UCM-MSCs 的分离技术, 制备了壳聚糖膜球体, 并分析了球形形成对表面标记表达的影响。因此, 本文介绍了在壳聚糖膜上形成的 UCM-MSC 球体的体内植入的大鼠双侧髌腱损伤模型的建立。在研究中没有发现并发症的发病率, 压力上升的影响, 或组织感染。7天大鼠的总功能评分低于正常大鼠, 术后28天内恢复正常。组织愈合的组织学评分证实在治疗缺陷中存在血栓, 7 天, 没有异物反应, 并在28天的进展愈合。这种双侧髌骨肌腱缺损模型通过在每只老鼠体内建立内部控制来控制个体间的变异, 与可接受的发病率相关, 并允许检测未治疗肌腱与治疗之间的差异。

引言

肌腱损伤是一个最常见的原因, 严重疼痛和肌肉萎缩跨物种1。在兽医中, 肌腱和韧带损伤对马匹有特殊的兴趣, 因为赛马中82% 的受伤都涉及肌肉骨骼系统, 46% 的人会影响肌腱和韧带2,3。瘢痕组织形成影响愈合肌腱的生物力学特性, 解释屈肌腱损伤后恢复运动的保护预后;再伤害发生在2年之内在67% 匹马保守地对待了4。再生医学提供了新的替代条件, 挑战传统治疗。自体干细胞治疗产生了一些令人鼓舞的结果5,6 , 但受发病率与组织收集, 延迟管理, 由于处理/重新编程的细胞, 和影响患者的健康状况 (如年龄) 对干细胞的属性7,8。这些限制为研究同种异体干细胞作为一种现成的替代方法提供了理论依据。胎儿附件细胞是吸引候选者, 因为他们规避的伦理关注和风险的畸胎瘤形成与胚胎干细胞。在胎儿附件, 脐带基质 (UCM), 也命名沃顿的果冻, 是丰富和容易收集。

无论细胞来源如何, 加强 stemness 是建立同种异体再生医学细胞库的必要条件。从功能的角度来看, stemness 可以定义为自我更新和多谱系分化的可能性9。stemness 的证据依赖于增殖和分化化验, 以及基因标记Oct4、 Sox2、和北美9的表达。增强 stemness 的一个策略是依靠使用生物材料作为空隙填料和载体, 从而增强 UCM-MSCs 的增殖和分化。这种方法消除了对转录因子的操纵, 将成熟细胞重新编程为诱导的多潜能细胞的担忧。在被认为是干细胞潜在载体的生物材料中, 壳聚糖对其生物相容性和降解能力有吸引力10。这种天然 aminopolysaccharide 是由碱性脱乙酰甲壳素, 第二种最丰富的天然多糖, 主要获得作为 subproduct 的贝类10。我们以前研究过 MSCs 和壳聚糖支架之间的相互作用, 观察到球体的形成11,12,13,14,15,16. 我们还报告了软骨在壳聚糖矩阵的优越性12,13,14,15,16,17, 18。最近, 两项独立研究描述了在壳聚糖薄膜上培养的脂肪组织和胎盘组织衍生 MSCs 的球体形成19,20。这种球体的形成不仅增强了 stemness, 而且还改善了体内植入20后干细胞的保留。

肌腱的患病率和发病率促使实验模型的发展, 以研究 tendinopathies 的病理生理学和试验新的治疗方法, 如干细胞注射。在马匹中, 胶原酶诱导的炎是一种常用的模型, 用于证明在肌腱修复中使用 MSCs 的有效性21。这种方法的相关性是有限的, 因为注射引起急性炎症变化, 而临床 tendinopathies 通常是由慢性致使22,23造成的。此外, 化学诱导肌腱疾病诱发愈合反应, 并没有复制受损愈合过程中存在的临床病例22,23。切除的表面数字屈肌腱部分已被描述为一个外科模型炎在马24。最近, 一种微创的方法被用来限制外伤损伤的中心核心的表面数字屈肌腱25。手术模型不模拟可能导致自然肌腱疾病的疲劳机制, 而且在造成的损害程度上往往缺乏重现性25。无论模型, 与马模型肌腱疾病的发病率和成本是额外的限制, 这证明了一个兴趣的啮齿动物模型作为在体内评估新的疗法的第一步。

啮齿类动物实验模型的主要优点之一是控制个体间变异的成本和能力。啮齿类动物可以标准化的各种生理因素, 由于其快速生长速度和相对较短的寿命, 限制变异的来源, 因此减少了检测差异所需的动物数量。在啮齿动物中诱导肌腱疾病的策略依赖于化学诱导, 同时也用于部分肌腱缺损的外科创建21。手术模型可以模拟自然 tendinopathies 比化学模型更好, 但可能导致更高的发病率和灾难性破坏肌腱。在这方面, 老鼠似乎比老鼠更适合这些模型, 因为它们的大小允许产生更大的缺陷, 从而有助于评价组织愈合。大大鼠已被用于四主要肌腱组的 tendinopathies 实验研究: 肩袖、屈肌、阿基里斯和髌腱26。其中, 涉及髌骨肌腱的模型特别吸引人, 因为这种肌腱的体积较大, 并且易于访问27。髌腱将股四头肌与胫骨股骨。在这个伸肌机制中, 髌骨是一种籽骨, 它引导四头肌的作用, 并勾勒出髌腱的近端程度。髌腱近端和远端骨锚的存在有利于生物力学试验。涉及髌骨肌腱的模型通常依赖于单边外科缺损, 而对侧完整肌腱作为控制28,29。最常见的髌骨肌腱缺损模型包括切除髌骨远端的髌腱中央部分 (1 毫米) 至胫骨股骨的插入, 而对侧髌腱保持完好。结果的措施包括组织学, 无损生物力学测试或对失败的生物力学测试, 超声成像,活体荧光成像, 总观察和功能测试28,30 ,31。单边模型不允许比较建议的治疗与保守的管理类似的伤害在同一动物。同样, 几种治疗方法之间的比较需要单独的动物。双边模式将消除个体间的变异, 减少研究所需的动物数量32。然而, 双边伤害可能增加发病率, 双侧跛行可能阻碍治疗评估。几项研究简要报告了双侧髌腱缺损在大鼠中的应用, 但侧重于治疗的效果而非围手术期管理和模型3334的发病率。

这项研究的长期目标是制定一个战略, 以改善 stemness 和在体内生存的 UCM-MSCs, 注定到同种异体移植。为了实现这一目标, 我们最近报告了在缺氧环境下, 球体在壳聚糖膜上的形成和孵化的 stemness 改善了 UCM-MSCs 的结构35。这些体外属性与改善的髌骨肌腱缺损的生物力学性能相关. 基于这些结果, 大鼠双侧髌腱缺损模型似乎适合于考生肌腱损伤的治疗方法36。本研究报告的目的是为 UCM-MSCs 的分离和鉴定提供详细的协议, 为干细胞制备生物递质系统, 建立和治疗双侧髌骨肌腱缺损, 以及术后缺损内组织愈合的恢复和评估。

研究方案

这里描述的所有方法都已被西方健康大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。

1. 马脐基质中 MSCs 的分离和扩增

  1. 从成年母马 (怀孕) 中获得胎盘, 观察 foaling, 灌装从胎盘中分离脐带。将脐在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与1% 青霉素-链霉素 (P/秒) 在4°c 在转移, 直到处理。
  2. 用室温 PBS 在50毫升管中清洗脐带两次, 1% P/秒。将脐带分为2英寸长的碎片在150毫米板和洗涤室温 PBS 与 1% P/秒在50毫升管两个或三次, 直到大部分的血液被冲洗出来。
  3. 纵向切断脐带以暴露血管。用镊子和剪刀从脐带上取出血管, 包括2动脉、静脉和尿囊茎。收集脐带基质 (沃顿的果冻), 这是类似果冻的基质围绕容器, 用手术刀刮上150毫米的盘子, 将果冻切成细块。
  4. 将沃顿的果冻从2–3脐带片段 (大约 12–15 g) 放置在50毫升管中, 15 毫升 0.1% (瓦特/v) 胶原酶 IA 溶液在 PBS。孵育在37°c 与柔和的震动为3-4 小时直到溶化。
  5. 离心机消化组织在 300 x g 15 分钟和吸入上清。并用重悬消化组织15毫升室温 PBS 与 1% P/秒, 混合吹打, 离心机在 150 x g 5 分钟, 并吸入上清 (洗涤)。重复洗两次。
  6. 并用重悬洗涤细胞15毫升室温 PBS 与 1% P/秒, 混合吹打, 应变100µm 细胞过滤器, 离心机在 150 x g 为5分钟, 并吸入上清。
  7. 将低葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰培养基 (LG-DMEM) 与胎牛血清 () 和 1% P/s 混合, 通过过滤来制备培养基 (CM)。
  8. 并用重悬紧张的细胞在10毫升 CM 前预热到37°c, 混合吹打, 转移到 25CM 2 组织培养瓶, 并且孵化在 5%CO 2 在90% 湿气和37.0 °c。改变 CM 每3天, 直到文化达到70–80% 汇合, 当文化将传代。
  9. 通过培养, 从烧瓶中抽出厘米, 用5毫升室温 PBS 冲洗两次, 并与3毫升0.25% 胰蛋白酶/乙二胺 (EDTA) 分离, 37 摄氏度, 5 分钟。
  10. 中和胰蛋白酶/EDTA 与6毫升 CM 预热到37.0 °c, 混合吹打, 转移到15毫升管, 离心机在 150 x g 为5分钟, 并吸入上清。并用重悬分离细胞在1毫升厘米, 混合吹打。用台盼蓝和 hemocytometer 计数活细胞。重新种子成25厘米2组织培养瓶在5000细胞/cm2, 并孵化在 5% CO2 90% 湿度和37.0 °c。

2. 用壳聚糖膜培养 UCM-MSCs 制备球体

  1. 要准备100毫升 1% (w/v) 壳聚糖溶液, 添加1克壳聚糖在99毫升蒸馏水 (dH2O), 并与磁性搅拌器混合良好。
  2. 加入670µL 的冰乙酸, 继续搅拌直到壳聚糖溶解并变得粘性。这通常需要 3–4 h。
  3. 在12井组织培养板的每个井中加入500µL 壳聚糖溶液, 并将其旋转, 均匀分布壳聚糖溶液, 覆盖所有的底面。
  4. 将壳聚糖溶液涂覆板置于层流柜下, 无盖过夜24小时。一旦干燥, 薄膜就会形成并粘附在板材上。
  5. 将壳聚糖膜加入1毫升0.5 氮氢氧化钠 (氢氧化钠) 溶液, 在室温下孵育2小时。从各井中抽出氢氧化钠, 用1毫升 dH2O 清洗每一个井三次。一次用1毫升70% 乙醇 (乙醇) 冲洗每一个井。
  6. 为壳聚糖膜消毒, 每井加1毫升70% 乙醇, 并在层流柜内一夜间孵化。第二天从每个井中抽吸剩余的乙醇。用1毫升的无菌 PBS 冲洗每一个井三次。在层流柜内无遮盖的情况下, 用紫外光消毒壳聚糖膜。
  7. 要形成球体的 UCM-MSCs, 种子扩展和传代细胞到每个井在5000细胞/cm2, 并孵化 5% CO2在90% 湿度和37.0 °c。
    注意: 细胞可以在缺氧或 normoxia 下孵化, 这取决于研究者的兴趣。

3. 流式细胞仪分析表面标记物的表达

  1. 单细胞悬浮液的制备
    1. 标准板材
      1. 从每个井中取出介质, 用室温 PBS 清洗两次。
      2. 分离细胞与500µL 细胞离解试剂入每井12井板为5–10分钟在室温下。
      3. 孵化后, 添加1毫升的染色缓冲 (PBS 包含 0.5% BSA) 到每个井和混合通过吹打分离细胞。
      4. 将电池悬浮液转移到15毫升锥形管中, 离心机在 150 x g 处进行5分钟。
    2. 壳聚糖板材
      1. 使用1000µL 尖的吸管吸吸培养基收集所有球体。将收集到的介质转化为15毫升锥形管。收集介质后, 通过加入1毫升的 pbs 进行冲洗, 并将冲洗过的 pbs 转换成相同的15毫升圆锥管。
      2. 离心机球体为 150 x 克, 5 分钟, 清除上清液。
      3. 添加500µL 细胞离解试剂 (例如, accutase), 并在室温下孵育5–10分钟。混合吹打使用1毫升尖端, 直到球体离解, 不再可见。
      4. 在单细胞悬浮液中加入1毫升的染色缓冲液, 离心机在 150 x g 处为5分钟。
  2. 洗涤单元
    1. 从锥形管中取出上清, 并在3毫升的冷染色缓冲器中重新悬浮细胞。从这一步, 在实验中保持细胞在冰上。
    2. 离心机在 300 x g 5 分钟 (洗涤)。
    3. 洗两次。
  3. 染色细胞
    1. 离心机在 300 x g 5 分钟, 并清除上清。
    2. 使用台盼蓝和 hemocytometer 计数可行细胞。在50µL 阻塞缓冲区中重新挂起 1 x 106单元格 (PBS 含有10% 匹马血清), 并在冰上孵化30分钟。
    3. 添加10µL 荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 共轭抗体 (CD44, CD90, CD105, CD34, 主要组织相容性复合物 (MHC) II 类, 或同种控制每个抗体) 和40µL 的染色缓冲器, 然后孵化保护从光1小时冰。
    4. 添加3毫升的冷染色缓冲和混合, 离心机在 300 x g 5 分钟, 并吸入上清 (洗涤)。
    5. 重复洗涤两次。
    6. 在0.5 毫升的染色缓冲器中重新悬浮细胞颗粒
    7. 添加5µL 7-反式 (活性染料) 和孵育30分钟冰
    8. 用流式细胞仪分析染色样品。通过其较小的 SSC 和 FSC 排除碎片, 并识别出低吸收 7-反的可行细胞。分别在 y 和 x 轴上绘制 FL1 和 FL2。使用同种控件在对角线上方创建一个门。测量该区域阳性染色细胞的百分比。计数至少2万个事件/示例 (辅助图 1)。
    9. 用门控细胞和自动荧光测量抗体染色细胞的百分比, 并减去同种控制的细胞百分比。

4. 大鼠双侧髌腱缺损模型的建立

  1. 选择大大鼠 (成年男性, 第4-5 月大, 体重 350–375 g)。注意这个模型所用的大鼠的体积相对较大。
  2. 麻醉和应用人工眼润滑剂的大鼠与8% 七氟醚在2升/分100% 氧气通过面罩提供, 直到消失的捏脚趾反射在感应室。
  3. 用肌肉注射 Meloxicam (1 毫克/千克) 作为先发制人镇痛。
  4. 将老鼠放在装有温水的两个0.5 升水瓶之间, 用布覆盖以保持体温和位置, 同时防止皮肤损伤。把每一个肢体带到桌子上。为了降低体温过低的风险, 请用气泡包装覆盖身体 (图 1)。
  5. 保持麻醉, 连续5% 七氟醚在1升100% 氧混合物通过鼻锥, 与动物在背卧床上的水加热垫。
  6. 为避免皮肤外伤, 请勿夹住手术部位。相反, 在两个窒息中应用脱毛膏。使用舌抑制剂去除奶油和头发。
  7. 用洗必泰 digluconate 擦洗手术部位, 用70% 乙醇冲洗3次。
  8. 用无菌 #15 手术刀刀片在近端向远端切开皮肤, 在窒息的 craniomedial 方面。开始切口约1厘米近的髌骨水平, 并延长约5毫米远端胫骨结节。
  9. 通过 #15 手术刀刀片释放底层皮下组织, 反映皮肤暴露髌骨肌腱。
  10. 使用 #15 手术刀刀片, 把每个髌骨肌腱 (1 毫米) 的中心第三个从髌骨远端到胫骨股骨。
    1. 将0.99 毫米直径的克氏针线与肌腱对齐, 作为模板, 以规范每个肢体缺陷的大小 (图 2)。
    2. 用 #15 手术刀刀片在克氏针的两侧进行2个全厚切口, 以隔离肌腱的中心部分 (图 3)。切除中心部分下部和远端的细虹膜剪刀 (图 4)。
    3. 在关闭窒息的筋膜前, 将血栓 (混合细胞悬浮和非加太) 插入适当治疗组, 如5.5 所述。使用 5-0 polyglactin 910 缝线 (图 5), 用交叉图案和皮肤与皮图案闭合筋膜。
  11. 重复对侧窒息的程序。
    注意: 一个缺陷被随机分配给治疗 (在壳聚糖或标准板材上培养的干细胞)。对侧缺损留空, 作为内部控制。
  12. 术后, 4 粒的恩诺沙星 (2 毫克/片, 口服, 一次每日) 和一片剂的 meloxicam (2 毫克/片剂, 口服, 每天一次) 7 天。这些剂量是由实验动物兽医推荐并在 IACUC 协议中批准的。

5. 骨髓间充质干细胞在髌骨肌腱缺损中的传递

  1. 麻醉一只不用于髌骨肌腱缺损的健康大鼠, 8% 七氟醚在2升/分100% 氧气通过面罩传递, 直到在感应腔内的夹趾反射消失。
  2. 收集5毫升血液的心脏穿刺从麻醉的大鼠 (成年男性, 第4-5 月, 体重 350–375 g), 在5毫升注射器与20克针含有1毫升酸柠檬酸-葡萄糖 (5:1 v/v)。
  3. 弄死大鼠心脏穿刺和采血后, 心内注射戊巴比妥 (100 毫克/千克), 同时在同一麻醉下。
  4. 在室温下离心样品在 350 x g 15 分钟。转移上清和存储整除数 (120 µL 每) 在-20 °c, 直到使用。
  5. 在体内植入之前, 立即解冻上述整除, 并将20µL 与 0.5 x 106 MSCs (从1.9 或 3.1.2.1) 分离出来, 使用胰蛋白酶/EDTA, 或通过冲洗 (与 PBS/培养基) 从壳聚糖板中收集。
  6. 将6µL 10% 氯化钙 (CaCl2) 添加到96井板井中解冻血浆的其余100µL, 以激活血浆并诱发血栓形成 (活化条件血浆: 非加太)。
  7. 混合细胞悬浮 (20 µL) 和非加太 (100 µL) 形成血栓 (图 6)。在关闭窒息的筋膜前, 将血栓放置在髌骨肌腱缺损中 (见步骤 4.10.3)。

6. 功能成果

  1. 监测老鼠每天两次的疼痛迹象, 根据大鼠的鬼脸比例 (RGS)37,38和肿胀在植入点。
    注: 建立评分系统 (0–6), 以评估动态功能的基础上3活动, 包括定时后肢站立的前肢支持 (0-3), 定时无辅助后肢站立 (0–2), 并有能力爬上17厘米塑料笼壁 (0–1) (表 1)。
  2. 评价大鼠的两个后肢站立活动在早上和晚上的每个时间点计算平均得分。
  3. 评估大鼠的能力, 成功地爬上一个17厘米的塑料笼壁与两个后肢到达顶端。

7. 髌腱的毛外观和组织病理学

  1. 弄死大鼠在7天 (评估炎症) 或28天 (评估组织愈合) 后治疗的心内注射戊巴比妥 (100 毫克/千克) 麻醉下, 8% 七氟醚和2升100% 氧气通过口罩提供。
  2. 在安乐死后用手术刀和剪刀收割髌骨-肌腱-胫骨股骨单位。除髌腱外, 除去窒息周围的软组织和韧带。
  3. 检查每个标本的总外观和加厚的肌腱 (图 7)。
  4. 将标本放置在肌腱的近端和侧向处, 将 5.0 Polydioxanone 的外科医生的结放在一起。将每个标本固定在10% 中性缓冲福尔马林溶液中, 从每根肌腱的中部获得横断面 (5 µm)。
  5. 用苏木精和三色染色切片, 并按照标准规程对马尾松进行染色。
  6. 检查部分, 以检测是否存在血肿内的缺陷, 以及病理变化, 如炎症。
  7. 根据胶原分级、血管生成程度和软骨形成 (表 2)39, 使用先前发布的评分系统评估各节的组织学评分。

结果

在目前的研究中, 结果被显示为平均值, 即标准差。细胞从6匹母马的脐带中分离出来, 在标准或壳聚糖条件下表达每个细胞表面标记物的分离细胞系的百分比与弗里德曼试验比较, 作为非参数分析的方差与重复措施.对于肌腱缺损模型的建立, 8 只大鼠进行7天术后评估, 12 只大鼠用于28天的评估。将功能结局的结果显示为均值电子扫描电镜 (平均标准误差), 并与 t 检验进行比较?...

讨论

为这个项目选择了马细胞, 因为我们最终打算测试在马的自然 tendinopathies 管理的候选方法。事实上, 由于马表面数字屈肌和跟腱在人类中的生物学相似性, 马匹肌腱损伤是肌腱的自然模型 (41。根据国际细胞治疗学会建议的标准, CD44、CD90、CD105、CD34 和 MHC II 的细胞表面标记物为免疫分型细胞选择了42。在最近的一项研究中, 无论培养条件如何, eqUCM-MSCs 对 CD34 和 MHC ...

披露声明

作者没有披露利益冲突。

致谢

作者要感谢博士, 博士, 她对数据的统计分析。作者还感谢麦克卢尔博士, DVM, 博士 DACLAM, 她的意见, 在麻醉和疼痛管理协议中使用的研究。该项目得到了西方卫生科学大学研究副会长 (12678v) 和美国农业部1433基金 (2090) 的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

参考文献

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