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Resumo

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Resumo

Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.

Introdução

Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie1. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados conservadoramente4. Medicina regenerativa fornece novas alternativas para uma condição que desafia os tratamentos tradicionais. Terapia de células-tronco autólogas produziu alguns animadores resultados5,6 , mas é limitada pela morbidade associada com a coleção de tecido, administração retardada devido ao processamento/reprogramação de células e a influência da Estado de saúde do paciente (tais como a idade) nas propriedades do tronco células7,8. Estas limitações fornecem uma lógica para a investigação de células-tronco alogênico como uma alternativa de prateleira. Células derivadas de seus anexos fetais são candidatos atraentes porque eles contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma associado com células-tronco embrionárias. Entre seus anexos fetais, matriz de cordão umbilical (UCM), também chamada geleia de Wharton, é abundante e fácil de coletar.

Independentemente da fonte da célula, aumentar stemness é essencial para estabelecer um banco de células para a medicina regenerativa alogênico. Do ponto de vista funcional, stemness pode ser definido como o potencial para diferenciação de auto-renovação e linhagem multi9. Provas de stemness se baseia em proliferação e diferenciação ensaios, juntamente com a expressão de genes marcadores Oct4, Sox2 e Nanog9. Uma estratégia para melhorar a stemness se baseia na utilização de biomateriais para servir como nulo enchimentos e transportadoras, realçando a proliferação e diferenciação de UCM-MSCs. Essa abordagem elimina preocupações em relação a manipulação de fatores transcricionais para reprogramar células maduras em células pluripotentes induzidas. Entre os biomateriais considerados como portadores de potenciais para as células-tronco, quitosana é atraente por sua biocompatibilidade e degradabilidade10. Este aminipolissacarídeo natural é formado por alcalina deacetilação da quitina, a segunda mais abundante polissacarídeo natural, principalmente obtida como um subproduto de marisco10. Temos anteriormente investigados interações entre MSCs e andaimes de quitosana e observou a formação de esferoides11,12,13,14,15, 16. também informamos sobre a superioridade da condrogênese em quitosana matrizes12,13,14,15,16,17, 18. Mais recentemente, dois estudos independentes descreveram formação de esferoides pelo tecido adiposo e tecido de placenta derivada MSCs cultivadas em um filme de quitosana19,20. Esta formação de esferoides não apenas reforçada stemness, mas também melhorou a retenção das células estaminais após na vivo implantação20.

A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda espécie tem solicitado o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia de tendinopatias e testar novas terapias tais como injeções de células-tronco. Em cavalos, tendinite induzida por colagenase é um modelo comum para demonstrar a eficácia usando MSCs no tendão reparação21. A relevância desta abordagem é limitada, como as injeções causam alterações inflamatórias agudas, Considerando que tendinopatias clínicas geralmente resultam de crônica overstrain22,23. Além disso, a indução química de doença do tendão induz uma resposta curativa e não replica o processo de cicatrização prejudicado presente em casos clínicos22,23. Excisão de um segmento do tendão flexor digital superficial tem sido descrito como um modelo cirúrgico da tendinite em cavalos24. Mais recentemente, uma abordagem minimamente invasiva foi usada para restringir o dano traumático para o núcleo central do tendão flexor digital superficial25. Modelos cirúrgicos não simular o mecanismo de fadiga que pode levar à doença natural do tendão e tendem a falta de reprodutibilidade na extensão do dano criado25. Independentemente do modelo, a morbidade e custo associado com equinos modelos do tendão doenças são limitações adicionais, que justificam o interesse em modelos de roedores como um primeiro passo na vivo avaliação de novas terapias.

Uma das principais vantagens de modelos experimentais em roedores consiste o custo e a capacidade de controlar a variabilidade inter-individual. Roedores podem ser padronizados em relação a vários fatores fisiológicos devido a suas taxas de crescimento rápido e relativamente curta expectativa de vida, limitando as fontes de variação e, portanto, reduzindo o número de animais necessários para detectar diferenças. Estratégias para induzir doenças tendão em roedores têm confiado na indução química, mas também na criação cirúrgica de tendão parcial defeitos21. Modelos cirúrgicos podem simular melhor do que os modelos químicos naturais tendinopatias, mas podem levar a maior morbidade e falha catastrófica do tendão danificado. A esse respeito, ratos parecem candidatos melhores do que os ratos para estes modelos, como seu tamanho permite a criação de defeitos maiores, facilitando a avaliação da cicatrização tecidual. Foram utilizados ratos Sprague Dawley em estudos experimentais de tendinopatias em quatro grupos principais do tendão: manguito rotador, flexor, Aquiles e tendões patelar26. Entre estes, modelos envolvendo o tendão patelar são especialmente atraentes por causa do tamanho maior deste tendão e a facilidade de acessá-lo27. O tendão patelar anexa o músculo quadríceps a tuberosidade tibial. No âmbito deste mecanismo extensor, a patela é um osso sesamoide que direciona a ação do quadríceps e delineia a extensão proximal do tendão patelar. A presença de âncoras ósseas nas extensões proximais e distais do tendão patelar facilita testes biomecânicos. Modelos envolvendo o tendão patelar normalmente dependem de defeitos cirúrgicos unilaterais, com um tendão intacto contralateral, servindo como um controle28,29. O modelo mais comum de defeito do tendão patelar envolve a excisão da porção central (1 mm de largura) do tendão patelar partir do ápice distal da patela para a inserção da tuberosidade da tíbia, enquanto o tendão patelar contralateral é deixado intacto. Medidas de resultados incluíram, histologia, testes biomecânicos não-destrutivos ou testes biomecânicos para falha, ultra-sonografia, ex vivo imagens de fluorescência, observação bruta e testes funcionais28,30 ,31. Modelos unilaterais não permitir a comparação de um tratamento proposto com tratamento conservador de lesão semelhante dentro do mesmo animal. Da mesma forma, a comparação entre os vários tratamentos requer animais separados. Um modelo bilateral seria eliminar variações inter individuais e reduzir o número de animais necessários para um estudo de32. No entanto, lesões bilaterais podem aumentar a morbidade e claudicação bilateral poderia comprometer a avaliação do tratamento. Alguns estudos relatam brevemente o uso do tendão patelar bilateral defeitos em ratos mas foco sobre os efeitos dos tratamentos, ao invés de gestão peri-operatório e morbidade do modelo33,34.

Objetivo a longo prazo do presente estudo é desenvolver uma estratégia para melhorar a sobrevivência de stemness e na vivo da UCM-MSCs destinado a transplante alogênico. Para atingir este objetivo, recentemente informamos stemness melhorada da UCM-MSCs por formação de esferoides em filme de quitosana e incubação sob ambiente hipóxico35. Essas propriedades em vitro foram associadas com melhoria propriedades biomecânicas do tendão patelar defeitos tratados com condicionado UCM-MSCs. com base nestes resultados, o modelo de defeito do tendão patelar bilateral de rato parece apropriado para testar o candidato tratamentos para lesões de tendão36. A finalidade do estudo relatado aqui é fornecer protocolos detalhados para isolamento e caracterização de UCM-MSCs, elaboração de um sistema biológico de células-tronco, criação e tratamento de defeitos de tendão patelar bilateral e pós-operatório recuperação e avaliação de cura dentro dos defeitos de tecido.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal.

1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical

  1. Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transferência até o processamento.
  2. Lavar o cordão umbilical duas vezes com temperatura PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL. Secção do cordão umbilical em fragmentos de 2 polegadas-longa na placa de 150 mm e lavar em temperatura ambiente PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL, duas ou três vezes, até a maior parte do sangue é lavado para fora.
  3. Corte o cordão umbilical longitudinalmente para expor os navios. Remova os navios, incluindo 2 artérias, uma veia e uma haste alantoico da medula usando fórceps e a tesoura. Coletar o cordão umbilical matriz (geleia de Wharton), que é os matriz gelatinosa circundante dos navios, em uma placa de 150 mm por raspagem com um bisturi, e picar a gelatina em pedaços bem.
  4. Geleia lugar da Wharton dos fragmentos do cordão umbilical de 2 – 3 (cerca de 12 a 15 g) em um tubo de 50 mL com 15 mL de solução de tipo IA de colagenase de 0,1% (p/v) em PBS. Incube a 37 ° C, com agitação suave para 3-4 h até dissolver.
  5. Centrifugue o tecido digerido a 300 x g durante 15 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda tecido digerido em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, centrifugar a 150 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem). Repeti a lavagem duas vezes mais.
  6. Ressuspender lavada as células em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, estique por com filtro de célula 100 µm, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante.
  7. Preparar o meio de cultura (CM) misturando baixa glicose Dulbecco meio do modificado águia (LG-DMEM) com soro fetal bovino (FBS) e 1% P/S. esterilizar o meio por filtração.
  8. Ressuspender as células tensas em 10 mL de CM pré aquecido a 37 ° C, misture por pipetagem, transferir para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C. Mudança CM cada 3 dias até que a cultura atinja a confluência de 70 a 80%, quando a cultura vai ser passada.
  9. Para a passagem da cultura, Aspire CM do frasco, lavar duas vezes com 5 mL de temperatura PBS e separe com 3 mL de 0,25% ácido de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C por 5 min.
  10. Neutralizar a tripsina/EDTA com 6 mL de CM pré aquecido de 37,0 ° C, misture por pipetagem, transferir para um tubo de 15 mL, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda desanexadas células em 1 mL de CM, misture por pipetagem. Conte as células viáveis usando trypan azul e hemocytometer. Re-sementes para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm em 5.000 células/cm2e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C.

2. preparação de esferoides com UCM-MSCs cultivadas em filmes de quitosana

  1. Para preparar 100 mL de solução de quitosana de 1% (p/v), adicionar 1 g de quitosana em 99 mL de água destilada (dH2O) e misture bem com um agitador magnético.
  2. Adicionar 670 µ l de ácido acético glacial e continue misturando até a quitosana dissolve-se e torna-se viscoso. Isso geralmente leva 3-4 h.
  3. Adicionar 500 µ l de solução de quitosana em cada poço da placa de cultura de tecidos de 12 poços, e a placa para distribuir uniformemente o solução de quitosana e cobrir toda a superfície inferior do redemoinho.
  4. Seque a placa de solução revestida de quitosana sob fluxo laminar sem uma cobertura durante a noite por 24 h. Uma vez seco, película fina será formada e se adere à placa.
  5. Neutralizar o filme de quitosana, adicionando 1 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 N em cada poço e incubar durante 2 h à temperatura ambiente. NaOH de cada poço de aspirar e lavar cada bem com 1 mL de dH2O três vezes. Cada um Lave bem com 1 mL de 70% de etanol (EtOH) uma vez.
  6. Para esterilizar o filme de quitosana, adicione 1 mL de 70% EtOH em cada bem e incubar durante a noite no gabinete de fluxo laminar. No dia seguinte, Aspire EtOH restante de cada poço. Cada um Lave bem com 1 mL de PBS estéril três vezes. Esterilize o filme de quitosana com luz ultravioleta sob fluxo laminar durante a noite sem uma capa.
  7. Esferoides de formulário da UCM-MSCs, semente expandiu e passadas as células em cada poço de 5.000 células/cm2e incuba em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C.
    Nota: As células podem ser incubadas sob hipoxia ou normoxia, dependendo do interesse do investigador.

3. a expressão de marcadores de superfície analisada através de citometria de fluxo

  1. Preparação de uma suspensão de célula única
    1. Placa padrão
      1. Remover o meio de cada poço e duas lavagens com temperatura PBS.
      2. Separe células com 500 µ l de reagente de dissociação uma célula em cada poço de uma placa de 12 para 5 a 10 min à temperatura ambiente.
      3. Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão (PBS contendo 0,5% BSA) de coloração em cada poço e misture pipetando para destacar células.
      4. Transferi a suspensão de células em tubo cônico de 15 mL e centrifugar 150 x g por 5 min.
    2. Placa de quitosana
      1. Colete todos os esferoides por meio de aspiração com uma pipeta com uma ponta de 1.000 µ l. Transferência médio coletado em um tubo cônico de 15 mL. Depois de coletar médio, lavar bem, adicionando 1 mL de PBS e transferir PBS lavado para o mesmo tubo cônico de 15 mL.
      2. Centrifugue esferoides a 150 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
      3. Adicionar 500 µ l de reagente de dissociação de célula (por exemplo, accutase) e incube por 5 a 10 min à temperatura ambiente. Misture por pipetagem usando uma ponta de 1 mL até esferoides dissociam e não são mais visíveis.
      4. Adicione 1 mL de tampão de coloração para a suspensão de célula única e centrifugar 150 x g por 5 min.
  2. Lavagem de células
    1. Remover o sobrenadante do tubo cónico e ressuspender as células em 3 mL de coloração reserva de frio. Manter as células no gelo durante todo o experimento desta etapa.
    2. Centrifugar a 300 x g por 5 min (lavagem).
    3. Lave duas vezes.
  3. Coloração de células
    1. Centrifugar a 300 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
    2. Contagem de células viáveis usando um azul trypan e hemocytometer. Re-suspender 1 x 106 células em 50 µ l de bloqueio buffer (PBS com cavalo 10% soro) e incubam por 30 min no gelo.
    3. Adicionar 10 µ l fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anticorpos (CD44, CD90, CD105, CD34, histocompatibilidade complexo (MHC) classe II ou do isotipo controle para cada anticorpo) e 40 µ l de tampão de coloração e, em seguida, incubar protegido da luz por 1h no gelo.
    4. Adicionar 3 mL de coloração reserva de frio e misture, centrifugar a 300 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem).
    5. Repita duas vezes de lavagem.
    6. Ressuspender o sedimento celular em 0,5 mL de tampão de coloração
    7. Adicionar 5 µ l de 7-AAD (tintura de viabilidade) e incube por 30 min no gelo
    8. Analise amostras de células coradas pelo citômetro de fluxo. Excluir os detritos por sua menor SSC e FSC e identificar células viáveis com baixa absorção de 7-AAD. Lote FL1 e FL2 no e x-eixos y, respectivamente. Use o isotipo controle para criar um portão acima da linha diagonal. Medir a porcentagem de células coradas positivamente na área. Conte pelo menos 20.000 eventos/amostra (complementar a Figura 1).
    9. Medir a porcentagem de células coradas com anticorpos por retenção de células viáveis e autofluorescência e subtrair a porcentagem de células coradas com isotipo controle.

4. modelo de defeito bilateral do tendão patelar em ratos

  1. Selecione ratos Sprague-Dawley (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g). Observe o tamanho relativamente grande dos ratos usados para este modelo.
  2. Anestesia e aplique o lubrificante do olho artificial o rato com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregue via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.
  3. Administre uma injeção intramuscular de Meloxicam (1 mg/kg) como analgesia preemptiva.
  4. Coloque o rato entre duas garrafas de água de 0,5 L com água morna e coberta com um pano para manter a temperatura corporal e posição, enquanto a prevenção de lesões de pele. Fita a cada extremidade da mesa. Para reduzir o risco de hipotermia, cobrir o corpo com plástico bolha (Figura 1).
  5. Manter a anestesia com fluxo contínuo de sevoflurano 5% na mistura de oxigênio 100% 1L através do cone de nariz, com o animal na prostração dorsal na almofada de aquecimento de água.
  6. Para evitar o trauma de pele, não clip os sítios cirúrgicos. Em vez disso, aplique o creme removedor do cabelo sobre ambos os reprima. Use o abaixador de língua para remover o creme e o cabelo.
  7. Esfregue o local cirúrgico com esfoliante de Digluconato de clorexidina e enxágue com etanol a 70% 3 vezes.
  8. Faça uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi 15 # estéril no sentido proximal para distal, no aspecto craniomedial da asfixiar. Iniciar a incisão de cerca de 1 cm proximal ao nível da patela e estendê-lo a cerca de 5 mm distal ao tubérculo tibial.
  9. Refletir a pele para expor o tendão patelar, libertando o tecido subcutâneo subjacente com uma lâmina de bisturi #15.
  10. Utilizando a lâmina de bisturi 15 #, impostos especiais de consumo o terço central da cada tendão patelar (1 mm) do aspecto distal da patela à tuberosidade da tíbia.
    1. Alinhe um fio de Kirschner 0.99 mm de diâmetro contra o tendão como um modelo para padronizar o tamanho do defeito em cada membro (Figura 2).
    2. Fazer 2 incisões da cheio-espessura de cada lado do fio de Kirschner com uma lâmina de bisturi 15 # para isolar a parte central do tendão (Figura 3). Ressecar a secção central proximalmente e distalmente com a tesoura de Iris fina (Figura 4).
    3. Antes de fechar a fáscia da sufocar, inserir o coágulo (suspensão de células mistas e ACP) para os grupos de tratamento adequado, conforme descrito em 5.5. Feche a fáscia com um padrão cruzado e pele com um padrão intradérmico usando 5-0 Poliglactina 910 as suturas (Figura 5).
  11. Repita o procedimento na asfixiar contralateral.
    Nota: Um defeito é aleatoriamente para um tratamento (células-tronco condicionada à quitosana ou cultivadas em placas padrão). O defeito contralateral é deixado vazio, para servir como controle interno.
  12. Após a cirurgia, administrar 4 comprimidos de enrofloxacina (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) e um comprimido de meloxicam (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) por 7 dias. Essas doses foram recomendadas por um veterinário de animais de laboratório e aprovadas no protocolo IACUC.

5. entrega do MSCs dentro o defeito do tendão patelar

  1. Anestesia um rato saudável, que não é usado para criação de defeito do tendão patelar com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregado via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.
  2. Colete sangue 5ml por punção cardíaca de rato Sprague-Dawley anestesiado (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g), em uma seringa de 5 mL com agulha 20g contendo 1 mL de ácido-citrato-dextrose (5:1 v/v).
  3. Eutanásia o rato após punção cardíaca e coleta de sangue, por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), enquanto sob a mesma anestesia.
  4. Centrifugar a amostra a 350 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir o líquido sobrenadante e armazenar (120 µ l cada) de alíquotas a-20 ° C até o uso.
  5. Imediatamente antes da implantação na vivo , descongelar a alíquota acima e misture 20 µ l com 0,5 x 106 MSCs (de 1,9 ou 3.1.2.1) retirados placas padrão usando tripsina/EDTA ou coletar de quitosana placas de rubor (com PBS/médio).
  6. Adicione 6 µ l de 10% de cloreto de cálcio (CaCl2) para os restantes 100 µ l de plasma descongelado num poço da placa de 96 poços para ativar o plasma e induzir a formação de um coágulo (ativado condicionado plasma: ACP).
  7. Misturar a suspensão de células (20 µ l) e ACP (100 µ l) para formar um coágulo (Figura 6). Coloque o coágulo dentro do tendão patelar defeito criado antes de fechar a fáscia da asfixiar (consulte a etapa 4.10.3).

6. resultado funcional

  1. Monitorar ratos duas vezes por dia para sinais de dor, com base no rato careta escala (RGS)37,38 e inchaço sobre os locais de implantação.
    Nota: Um sistema de Pontuação (0-6) foi desenvolvido para avaliar a função ambulatorial com base em 3 atividades, incluindo cronometrado membro posterior permanente com membros dianteiros suportados (0-3), cronometrado desassistida membro posterior permanente (0-2) e a capacidade de escalar um 17cm gaiola plástica (de parede (0-1) A tabela 1).
  2. Avalie as duas atividades permanentes de membro posterior de ratos de manhã e à noite de cada ponto de tempo para calcular um escore médio.
  3. Avalie os ratos para a capacidade de com êxito, escalar uma parede de gaiola plástica de 17 cm com ambas as patas chegar ao topo.

7. bruto aparência e Histopatologia do tendão patelar

  1. Eutanásia em ratos em 7 dias (para avaliar a inflamação) ou 28 dias (para avaliar a cicatrização tecidual) pós tratamento por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), sob anestesia com sevoflurano 8% e 100% de oxigênio de 2 L entregadas via máscara.
  2. Unidades da tuberosidade da tíbia-patela-tendão por bisturi e tesouras de colheita após eutanásia. Remova os tecidos moles e ligamentos em torno a asfixiar, exceto para o tendão patelar.
  3. Examine cada espécime de aparência bruta e espessamento do tendão (Figura 7).
  4. Oriente o espécime, colocando um cirurgião do nó de Polydioxanone 5.0 no aspecto proximal e lateral do tendão. Corrigir cada amostra em solução de formol tamponado neutro de 10% e obter secções transversais (5 µm) da porção média da cada tendão.
  5. Manche as seções usando hematoxilina e eosina e Trichrome de Masson seguindo protocolos padrão de coloração.
  6. Examine a seção para detectar a presença de hematoma dentro do defeito, bem como alterações patológicas, tais como inflamação.
  7. Avalie o resultado histológico das seções usando o sistema de Pontuação publicado anteriormente, com base no grau de colágeno, grau de angiogênese e cartilagem de formação (tabela 2)39.

Resultados

No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliaç...

Discussão

Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos41. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping ...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Su, PhD, a análise estatística dos dados. Os autores também agradecer Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, seus conselhos sobre a anestesia e dor gestão protocolos usados no estudo. Este projecto foi apoiado por concessões do Western University of Health Sciences escritório do Vice-Presidente de pesquisa (12678v) e USDA seção 1433 fundos (2090).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

Referências

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