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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive la preparazione e la valutazione di cordone ombelicale cellule staminali mesenchimali derivate matrice sferoidi con un modello di difetto bilaterale del tendine patellar in un ratto. Questo modello è stato associato con una morbilità accettabile ed è stato trovato per rilevare le differenze tra i tendini non trattati e trattati e tra i due trattamenti testato.

Abstract

Medicina rigenerativa fornisce romanzo alternative a condizioni che sfidano i trattamenti tradizionali. La prevalenza e la morbosità di tendinopathy tra le specie, combinata con le proprietà curative limitate di questo tessuto, hanno richiesto la ricerca di terapie cellulari e azionato lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la loro efficacia. Cordone ombelicale matrix-derivate cellule staminali mesenchimali (UCM-MSC) sono candidati attraenti perché sono abbondanti, facili da raccogliere, eludere le preoccupazioni di ordine etico e il rischio di formazione di teratoma, ma assomigliano più molto attentamente a cellule staminali embrionali primitive rispetto adulto tessuto-derivato MSCs. significativo interesse si è focalizzato su chitosano come strategia per migliorare le proprietà di MSCs attraverso la formazione della sferoide. Questa carta dettagli tecniche per isolare UCM-MSCs, preparare sferoidi su pellicola di chitosano e analizzare l'effetto di formazione della sferoide sull'espressione di superficie dell'indicatore. Di conseguenza, creazione di un modello di lesione bilaterale del tendine patellar in ratti è descritto per l'impianto in vivo di UCM-MSC sferoidi formata sulla pellicola di chitosano. Nessuna complicazione è stata osservata nello studio rispetto alla morbosità, sottolineare crescenti effetti, o l'infezione del tessuto. Il Punteggio totale funzionale dei ratti operati alle 7 giorni era inferiore a quello dei ratti normali, ma hanno rinviato al normale entro 28 giorni dopo la chirurgia. Istologici punteggi di guarigione del tessuto ha confermato la presenza di un coagulo nei trattati difetti valutati a 7 giorni, assenza di reazione da corpo estraneo e progredendo guarigione a 28 giorni. Questo modello di difetto del tendine della rotula bilaterale controlla la variabilità inter-individuale tramite creazione di un controllo interno in ogni ratto, era associato con la morbosità accettabile e ha permesso la rilevazione delle differenze tra i tendini non trattati e trattamenti.

Introduzione

Lesione del tendine è una delle più comuni cause di atrofia del muscolo e dolore significativo tra specie1. In medicina veterinaria, tendine e lesioni ai legamenti sono di particolare interesse per i cavalli, come 82% di tutte le lesioni in cavalli da corsa coinvolgere il sistema muscolo-scheletrico, e 46% di quelli interessare tendini e legamenti2,3. Formazione di tessuto cicatriziale colpisce le proprietà biomeccaniche dei tendini guariti e spiega la prognosi custodita per ritorno all'uso atletico dopo lesioni del tendine del flessore; re-infortunio si verifica entro 2 anni in fino al 67% di cavalli trattati conservativamente4. Medicina rigenerativa fornisce alternative romanzo ad una condizione che sfida i trattamenti tradizionali. Terapia con cellule staminali autologhe ha prodotto alcuni risultati incoraggianti5,6 , ma è limitata dalla morbosità connessa con la raccolta di tessuto, amministrazione in ritardo a causa di elaborazione/riprogrammazione delle cellule e l'influenza della lo stato di salute del paziente (ad esempio età) sulle proprietà delle staminali cellule7,8. Queste limitazioni forniscono una spiegazione razionale per lo studio di cellule staminali allogeniche in alternativa disponibile immediatamente. Cellule derivate da annessi fetali sono candidati attraenti perché essi eludere le preoccupazioni di ordine etico e rischio di formazione di teratoma è associata con le cellule staminali embrionali. Tra annessi fetali, matrice del cordone ombelicale (UCM), anche denominato gelatina di Wharton, è abbondante e facile da raccogliere.

Indipendentemente dall'origine delle cellule, migliorando la staminalità è indispensabile istituire una banca di cellule per trapianto allogenico medicina rigenerativa. Da un punto di vista funzionale, staminalità può definirsi il potenziale di differenziazione di auto-rinnovamento e multi-lignaggio9. Prova di staminalità si basa sulla proliferazione e differenziamento saggi, con l'espressione di gene marcatori Oct4, Sox2 e Nanog9. Una strategia per migliorare la staminalità si basa sull'uso di biomateriali per servire come Sub riempitivi e vettori migliorando la proliferazione e la differenziazione di UCM-MSCs. Questo approccio elimina le preoccupazioni relative alla manipolazione di fattori trascrizionali per riprogrammare cellule mature in cellule pluripotenti indotte. Tra biomateriali considerati come potenziali vettori per le cellule staminali, chitosano è attraente per la sua biocompatibilità e degradabilità10. Questo aminopolysaccharide naturale è formata da deacetilazione alcalina della chitina, il secondo più abbondante polisaccaride naturale, ottenuta principalmente come un sottoprodotti di crostacei10. In precedenza abbiamo studiato le interazioni tra MSCs e chitosano scaffold e osservato la formazione di sferoidi11,12,13,14,15, 16. abbiamo anche segnalato sulla superiorità di Condrogenesi il chitosano matrici12,13,14,15,16,17, 18. Più recentemente, due studi indipendenti hanno descritto sferoidi formazione di tessuto adiposo e placenta tessuto derivato MSCs coltivate su una pellicola di chitosano19,20. Questa formazione di sferoidi non solo migliorato la staminalità, ma anche migliorato la conservazione di cellule staminali dopo in vivo l'impianto20.

La prevalenza e la morbosità di tendinopathy attraverso le specie hanno richiesto lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la fisiopatologia delle tendinopatie e testare nuove terapie come iniezioni di cellule staminali. Nei cavalli, indotta da collagenosi tendinite è un modello comune per dimostrare l'efficacia utilizzando MSCs nel tendine riparazione21. La rilevanza di questo approccio è limitata, come iniezioni causano cambiamenti infiammatori acuti, mentre tendinopatie cliniche sono generalmente frutto di cronica affaticare22,23. Inoltre, induzione chimica della malattia del tendine induce una risposta di guarigione e non replica il processo di guarigione alterato presente in casi clinici22,23. L'asportazione di un segmento del tendine flessore superficiale è stato descritto come un modello chirurgico di tendinite in cavalli24. Più recentemente, è stato utilizzato un approccio mini-invasivo per limitare il danno traumatico al nucleo centrale del tendine flessore superficiale25. Modelli chirurgici non simulare il meccanismo di affaticamento che può condurre alla malattia naturale del tendine e tendono alla mancanza di riproducibilità nell'entità del danno creato25. Indipendentemente dal modello, morbilità e costi associati modelli equine del tendine malattie sono ulteriori limitazioni, che giustificano un interesse nei modelli del roditore come un primo passo per la valutazione in vivo di nuove terapie.

Uno dei principali vantaggi dei modelli sperimentali in roditori è costituito dal costo e la capacità di controllare la variabilità inter-individuale. Roditori possono essere standardizzate riguardo ai vari fattori fisiologici a causa dei loro tassi di crescita rapida e relativamente brevi durate, limitazione delle fonti di variazione e riducendo pertanto il numero di animali necessari per rilevare le differenze. Strategie per indurre malattie del tendine in roditori hanno contato su induzione chimica, ma anche sulla creazione chirurgica di parziale del tendine difetti21. Modelli chirurgici possono simulare naturale tendinopatie meglio di modelli chimici, ma possono portare a più alta morbilità e fallimento catastrofico del tendine danneggiato. A tale proposito, ratti sembrano candidati migliori rispetto ai topi per questi modelli, come la loro dimensione consente la creazione di più grandi difetti, facilitando così la valutazione della guarigione dei tessuti. Ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in studi sperimentali di tendinopatie in quattro gruppi principali del tendine: cuffia dei rotatori, flessori, Achille e tendini patellar26. Tra questi modelli che coinvolgono il tendine rotuleo sono particolarmente attraente per la taglia più grande di questo tendine e la facilità di accesso allo stesso27. Il tendine rotuleo si attacca il muscolo quadricipite alla tuberosità tibiale. All'interno di questo meccanismo dell'estensore, la rotula è un osso sesamoide che dirige l'azione del quadricipite e delinea il limite prossimale del tendine rotuleo. La presenza di ancoraggi ossute gli extent prossimali e distali del tendine patellar facilita prove biomeccaniche. Modelli che tipicamente coinvolgono il tendine rotuleo si basano sui vizi chirurgiche unilaterale, con un tendine intatto controlaterale che serve come un controllo28,29. Il modello più diffuso di difetto tendine rotuleo coinvolge asportare la parte centrale (1 mm di larghezza) del tendine rotuleo dall'apice distale della rotula per l'inserimento della tuberosità tibiale, mentre il tendine rotuleo controlaterale è lasciato intatto. Misure dei risultati hanno incluso l'istologia, prove biomeccaniche distruttive o prove biomeccaniche per fallimento, formazione immagine di ultrasuono, ex vivo imaging di fluorescenza, lordo osservazione e test funzionali28,30 ,31. Modelli unilaterale non permettere il confronto di un trattamento proposto con l'amministrazione conservatrice di una ferita simile all'interno dello stesso animale. Allo stesso modo, il confronto tra diversi trattamenti richiede animali separati. Un modello bilaterale sarebbe eliminare le variazioni inter-individuali e ridurre il numero di animali necessari per un Studio32. Tuttavia, le lesioni bilaterali possono aumentare la morbosità e zoppia bilaterale potrebbe ostacolare la valutazione della terapia. Alcuni studi segnalano brevemente l'uso bilaterale del tendine patellar difetti di ratti ma si concentrano sugli effetti di trattamenti anziché amministrazione peri-attiva e morbosità del modello33,34.

Obiettivo a lungo termine di questo studio è quello di sviluppare una strategia per migliorare la sopravvivenza di staminalità e in vivo di UCM-MSCs destinati al trapianto allogenico. Per raggiungere questo obiettivo, recentemente abbiamo segnalato staminalità migliorata di UCM-MSCs dalla formazione di sferoidi sulla pellicola di chitosano e incubazione sotto ambiente ipossico35. Queste proprietà in vitro sono state associate con migliorate proprietà biomeccaniche del tendine rotuleo difetti trattati con condizionata UCM-MSCs. basato su questi risultati, il modello di difetto bilaterale del tendine patellar del ratto sembra adatto a testare il candidato trattamenti per tendine lesioni36. Lo scopo dello studio segnalato qui è quello di fornire protocolli dettagliati per isolamento e caratterizzazione di UCM-MSCs, preparazione di un sistema di consegna biologico per le cellule staminali, creazione e trattamento di difetti del tendine della rotula bilaterale e post-operatorio recupero e valutazione di guarigione all'interno dei difetti dei tessuti.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Western University of Health Sciences.

1. isolamento ed espansione di cellule staminali mesenchimali da cordone ombelicale equino Matrix

  1. Ottenere la placenta da un mare adulto (incinto) dopo osservato parto e asetticamente isolare il cordone ombelicale dalla placenta. Tenere il cordone ombelicale in tampone fosfato salino (PBS) con 1% di penicillina-streptomicina (P/S) a 4 ° C durante il trasferimento fino al trattamento.
  2. Lavare il cordone ombelicale due volte con temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL. Sezione il cordone ombelicale in frammenti 2-pollice-lungo su 150 mm piastra e lavare a temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL due o tre volte, fino a quando la maggior parte del sangue è risciacquato.
  3. Tagliare il cordone ombelicale longitudinalmente per esporre i vasi. Rimuovere le navi, incluse 2 arterie e una vena un gambo allantoico da cavo con pinze e le forbici. Raccogliere la matrice del cordone ombelicale (gelatina di Wharton), ovvero i vasi circostanti di matrice gelatinosa, su un piatto di 150mm raschiando con un bisturi, e tritare la gelatina in pezzi pregiati.
  4. Gelatina di Wharton posto da 2 – 3 del cordone ombelicale frammenti (circa 12 – 15 g) in un tubo da 50 mL con 15 mL di soluzione di tipo IA collagenosi 0,1% (p/v) in PBS. Incubare a 37 ° C con agitazione delicata per 3-4 h fino a completa dissoluzione.
  5. Centrifugare il tessuto digerito a 300 x g per 15 min e aspirare il surnatante. Risospendere tessuto digerito in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, centrifugare a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio). Ripetere il lavaggio due volte più.
  6. Risospendere lavato cellule in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, ceppo di con filtro di 100 µm cella, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante.
  7. Preparare il terreno di coltura (CM) con glucosio basso Dulbecco Medium dell'Aquila per volta (LG-DMEM) con siero bovino fetale (FBS) e 1% P/S. sterilizzare il medium di filtrazione.
  8. Risospendere le cellule sforzate in 10 mL di CM pre-riscaldato a 37 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm e incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C. Cambiamento CM ogni 3 giorni fino a quando la cultura raggiunge la confluenza di 70 – 80%, quando la cultura sarà essere attraversata.
  9. Per la cultura del passaggio, aspirare CM dalla boccetta, lavare due volte con 5 mL di PBS di temperatura e staccare con 3 mL di 0,25% acido di tripsina/etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C per 5 min.
  10. Neutralizzare la tripsina/EDTA con 6 mL di CM pre-riscaldato a 37,0 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in una provetta da 15 mL, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule indipendenti in 1 mL di CM, Miscelare pipettando. Contare le cellule vitali utilizzando trypan blu e un emocitometro. Reseeding in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm a 5.000 cellule/cm2ed incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C.

2. preparazione di sferoidi con UCM-MSCs coltivate sulle pellicole di chitosano

  1. Per preparare 100 mL di soluzione di chitosano 1% (p/v), aggiungere 1 g di chitosano in 99 mL di acqua distillata (dH2O) e mescolare bene con un agitatore magnetico.
  2. 670 µ l di acido acetico glaciale e continuare a mescolare fino a quando il chitosano si scioglie e diventa viscoso. Questo di solito prende 3-4 h.
  3. Aggiungere 500 µ l di soluzione di chitosano in ciascun pozzetto della piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti, e agitare la piastra per distribuire uniformemente la soluzione di chitosano e coprire tutta la superficie di fondo.
  4. Asciugare la piastra di soluzione rivestito di chitosano sotto flusso laminare senza una copertura durante la notte per 24 h. Una volta essiccato, film sottile sarà formata e aderito alla piastra.
  5. Neutralizzare il chitosano pellicola aggiungendo 1 mL di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,5 N in ogni pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. NaOH da ciascun pozzetto di aspirare e lavare ogni bene con 1 mL di dH2O tre volte. Lavare ogni bene con 1 mL di etanolo al 70% (EtOH) una volta.
  6. Per sterilizzare chitosano film, aggiungere 1 mL di 70% EtOH in ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a flusso laminare mobile. Aspirare EtOH rimanenti da ogni pozzetto nel giorno seguente. Lavare ogni bene con 1 mL di PBS sterile tre volte. Sterilizzare il chitosano film con luce ultravioletta sotto flusso laminare durante la notte senza una copertura.
  7. A sferoidi forma di UCM-MSCs, semi espansa e attraversate le cellule in ogni pozzetto a 5.000 cellule/cm2e incubare in 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C.
    Nota: Le cellule possono essere incubate sotto ipossia o normoxia, a seconda dell'interesse del ricercatore.

3. espressione di marcatori di superficie analizzata tramite flusso Cytometry

  1. Preparazione di una sospensione singola cella
    1. Piastra standard
      1. Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e lavare due volte con PBS di temperatura.
      2. Staccare le cellule con 500 µ l di reagente di dissociazione una cella in ogni pozzetto di una piastra 12-pozzetti per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente.
      3. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di buffer (PBS contenente 0.5% BSA) la macchiatura in ciascun pozzetto e Miscelare pipettando per staccare le cellule.
      4. Trasferire la sospensione di cellule in provetta conica da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 min.
    2. Piastra di chitosano
      1. Raccogliere tutti gli sferoidi di aspirante medio utilizzando una pipetta con una punta di 1.000 µ l. Termovettore raccolti in una provetta conica da 15 mL. Dopo aver raccolto medio, lavare bene aggiungendo 1 mL di PBS e trasferire PBS lavato lo stesso tubo conico da 15 mL.
      2. Centrifugare sferoidi a 150 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      3. Aggiungere 500 µ l del reagente di dissociazione delle cellule (per esempio, accutase) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente. Mescolare di pipettaggio utilizzando una punta da 1 mL fino a sferoidi dissociano e non sono più visibili.
      4. Aggiungere 1 mL di tampone colorazione nella sospensione unicellulare e centrifugare a 150 x g per 5 min.
  2. Celle di lavaggio
    1. Rimuovere il surnatante dal tubo conico e risospendere le cellule in 3 mL di buffer di colorazione fredda. Mantenere le cellule sul ghiaccio in tutto esperimento da questo passaggio.
    2. Centrifugare a 300 x g per 5 min (lavaggio).
    3. Lavare due volte.
  3. Macchiatura delle celle
    1. Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
    2. Conta cellule vitali utilizzando un trypan blu e un emocitometro. Risospendere 1 x 106 cellule in 50 µ l blocco buffer (PBS contenente 10% di siero equino) e incubare per 30 min in ghiaccio.
    3. Aggiungere 10 µ l della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato anticorpi (CD44, CD90, CD105, CD34, (istocompatibilità complex MHC) di classe II o controllo di isotipo per ciascun anticorpo) e 40 µ l di tampone di colorazione, quindi incubare protetta dalla luce per 1h sul ghiaccio.
    4. Aggiungere 3 mL di buffer di colorazione fredda e mescolare, centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio).
    5. Ripetere il lavaggio due volte.
    6. Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di tampone di colorazione
    7. Aggiungere 5 µ l di 7-AAD (tintura di vitalità) e incubare per 30 min in ghiaccio
    8. Analizzare i campioni delle cellule macchiato da citometro a flusso. Escludere i detriti da loro piccoli SSC e FSC e identificare cellule vitali con assorbimento inferiore di 7-AAD. Plot FL1 e FL2 su y - e assi x, rispettivamente. Isotype controllo consente di creare un cancello sopra la linea diagonale. Misurare la percentuale di cellule positivamente marcate nella zona. Contare almeno 20.000 eventi/campione (complementare figura 1).
    9. Misurare la percentuale di cellule colorate con gli anticorpi di gating cellule vitali e auto-fluorescenza e sottrarre la percentuale di cellule colorate con controllo di isotipo.

4. bilaterale del tendine Patellar difetto modello nel ratto

  1. Selezionare ratti Sprague-Dawley (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo). Notare le dimensioni relativamente grandi dei ratti utilizzato per questo modello.
  2. Anestetizzare e applicare lubrificante occhio artificiale il ratto con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.
  3. Somministrare un'iniezione intramuscolare di Meloxicam (1 mg/kg) come preemptive analgesia.
  4. Posto il ratto tra due bottiglie da 0,5 L acqua riempita con acqua calda e coperto con un panno per mantenere la temperatura corporea e la posizione, evitando la ferita della pelle. Nastro ogni estremità alla tabella. Per ridurre il rischio di ipotermia, coprire il corpo con pluriball (Figura 1).
  5. Mantenere l'anestesia con flusso continuo di sevoflurane 5% nella miscela di ossigeno 100% 1L via cono di naso, con l'animale in decubito dorsale, il rilievo di riscaldamento dell'acqua.
  6. Per evitare traumi cutanei, non agganciare i siti chirurgici. Al contrario, applicare crema di rimozione dei capelli sopra entrambi soffoca. Per rimuovere la crema ed i capelli, utilizzare un abbassalingua.
  7. Strofinare il sito chirurgico con chlorhexidine digluconate macchia e risciacquare con etanolo al 70% 3 volte.
  8. Incidere la pelle con una lama per bisturi #15 sterile in senso prossimale a distale, l'aspetto craniomedial della soffocano. Avviare l'incisione di circa 1 cm prossimale al livello della patella ed estenderlo distale al tubercolo tibia di circa 5 mm.
  9. Riflettere la pelle per esporre il tendine rotuleo liberando il tessuto sottocutaneo sottostante con una lama per bisturi #15.
  10. Utilizzando la lama per bisturi #15, asportare il terzo centrale di ogni tendine rotuleo (1 mm) dalla funzione distale della rotula alla tuberosità tibiale.
    1. Allineare un filo di Kirschner 0.99 mm-diametro contro il tendine come modello per standardizzare le dimensioni del difetto in ogni arto (Figura 2).
    2. Fare 2 incisioni di pieno-spessore su ogni lato del filo di Kirschner con una lama per bisturi #15 per isolare la porzione centrale del tendine (Figura 3). Resecare la sezione centrale prossimalmente e distalmente con forbice Iris (Figura 4).
    3. Prima di chiudere la fascia della soffocano, inserire il coagulo (sospensione cellulare mista e ACP) per i gruppi di trattamento appropriato, come descritto in 5.5. Chiudere la fascia con un motivo crociato e la pelle con un modello intradermica 5-0 polyglactin 910 suture (Figura 5).
  11. Ripetere la procedura sul ginocchio controlaterale.
    Nota: Un difetto viene assegnato casualmente ad un trattamento (cellule staminali condizionato il chitosano o coltivate su piastre standard). Il difetto controlaterale viene lasciato vuoto, per servire come controllo interno.
  12. Dopo la chirurgia, amministrare 4 compresse di enrofloxacina (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) e una tavoletta di meloxicam (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) per 7 giorni. Queste dosi sono state consigliate da un veterinario di animali di laboratorio e approvate nel protocollo IACUC.

5. consegna di MSCs all'interno del difetto di tendine rotuleo

  1. Anestetizzare un topo sano che non viene utilizzato per la creazione di difetto del tendine rotuleo con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.
  2. Raccogliere 5 mL di sangue da puntura cardiaca dal ratto Sprague-Dawley anestetizzato (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo), in una siringa da 5 mL con ago 20 G contenente 1 mL di acido-citrato-destrosio (5:1 v/v).
  3. Eutanasia del ratto dopo puntura cardiaca e raccolta del sangue, tramite l'iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg), mentre sotto l'anestesia stessa.
  4. Centrifugare il campione a 350 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante e conservare le aliquote (120 µ l) a-20 ° C fino all'utilizzo.
  5. Immediatamente prima in vivo dell'impianto, scongelare l'aliquota di cui sopra e mescolare 20 µ l con 0,5 x 106 MSCs (da 1,9 o 3.1.2.1) staccato da piastre standard con tripsina/EDTA o raccogliere da chitosano piastre di vampate di calore (con PBS/medio).
  6. Aggiungere 6 µ l di 10% cloruro di calcio (CaCl2) per il restante 100 µ l di plasma scongelato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti per attivare il plasma e indurre la formazione di un coagulo (attivato condizionato al plasma: ACP).
  7. Mescolare la sospensione cellulare (20 µ l) e ACP (100 µ l) per formare un coagulo (Figura 6). Posizionare il coagulo all'interno del tendine rotuleo difetto creato prima di chiudere la fascia della soffocano (vedi passo 4.10.3).

6. functional Outcome

  1. Ratti di monitorare due volte al giorno per segni di dolore, basato sul ratto smorfia scala (RGS)37,38 ed il gonfiamento sopra i siti di impianto.
    Nota: Un sistema di Punteggio (0-6) è stato sviluppato per valutare la funzione ambulatoria basato su 3 attività, tra cui temporizzata dell'arto in piedi con arti anteriori supportati (0-3), cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (0 – 2) e la capacità di scalare una gabbia plastica parete (0 – 1) (17cm Tabella 1).
  2. Valutare ratti per le due attività in piedi dell'arto al mattino e alla sera di ogni punto del tempo per calcolare un punteggio medio.
  3. Valutare ratti per poter correttamente scalare una parete di plastica gabbia di 17cm con entrambi gli arti posteriori, raggiungendo la cima.

7. lordo aspetto e l'istopatologia del tendine rotuleo

  1. Eutanasia di ratti a 7 giorni (per valutare l'infiammazione) o 28 giorni (per valutare la guarigione dei tessuti) post-trattamento mediante iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg) in anestesia con sevoflurane 8% e 2 L 100% ossigeno trasportato tramite maschera.
  2. Vendemmia unità della tuberosità rotula-tendine-tibia di bisturi e forbici dopo l'eutanasia. Rimuovere i tessuti molli e legamenti intorno la soffocano, fatta eccezione per il tendine rotuleo.
  3. Esaminare ciascun campione per apparenza lorda ed ispessimento del tendine (Figura 7).
  4. Orientare il preparato inserendo un nodo del chirurgo di 5.0 polidioxanone sull'aspetto prossimale e laterale del tendine. Fissare ogni campione in soluzione di formalina neutra tamponata 10% e ottenere sezioni trasversali (5 µm) da metà di-parte del ogni tendine.
  5. Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina e Trichrome di Masson macchiatura seguendo protocolli standard.
  6. Esaminare la sezione per rilevare la presenza di ematoma all'interno del difetto, come pure i cambiamenti patologici quali l'infiammazione.
  7. Valutare il punteggio istologico delle sezioni utilizzando il sistema di Punteggio precedentemente pubblicato, basato sul grado di collagene, grado di angiogenesi e cartilagine formazione (tabella 2)39.

Risultati

Nello studio corrente, i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (deviazione standard). Le cellule sono state isolate dai cavi ombelicali di 6 mares, e percentuale di linee cellulari isolate che esprimono ogni indicatore della superficie delle cellule sotto condizionata standard o chitosano sono stati confrontati con un test di Friedman, come un'analisi della varianza non parametrica con ripetuto misure. Per la creazione di modelli di difetto del tendine, 8 ratti sono ...

Discussione

Cellule Equine sono state selezionate per questo progetto, perché alla fine abbiamo intenzione di testare candidato approcci nella gestione delle tendinopatie naturale nei cavalli. Infatti, lesioni del tendine nei cavalli sono attraenti come modelli naturali di tendinopathy nell'uomo a causa della somiglianza biologica tra il flessore digitale superficiale equino e tendine di Achille in esseri umani41. Gli indicatori di superficie delle cellule CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II sono stati selezion...

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Riconoscimenti

Gli autori desidera ringraziare Dr. Su, PhD, per la sua analisi statistica dei dati. Gli autori ringraziano anche Dr. McClure, DVM, PhD, DACLAM, per la sua consulenza sull'anestesia e dolore gestione protocolli utilizzati nello studio. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni da Western University of Health Sciences ufficio del Vice Presidente per la ricerca (12678v) e USDA sezione 1433 fondi (2090).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

Riferimenti

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness?. Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

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