质谱法富集细菌脂蛋白及 n-端脂肽的制备结构测定

摘要

用非离子表面活性剂相分配法对细菌脂蛋白的富集进行了描述, 直接用于 TLR 化验或其他应用。进一步详细的步骤, 以准备 n-终端胰蛋白酶脂肽的结构表征的质谱。

摘要

脂蛋白是哺乳动物先天免疫应答的细菌细胞包络和有效活化剂的重要成分。尽管它们对细胞生理学和免疫学都有重要意义, 但对于新的脂蛋白形态、合成方法以及各种形式对宿主免疫的影响, 仍有许多有待发现。为了对脂蛋白进行深入研究, 本协议描述了一种细菌脂蛋白的富集方法和 n-端胰蛋白酶脂肽的制备, 其结构由基质辅助激光解吸电离-飞行时间来确定。质谱 (MALDI)。在建立的海卫 X-114 相分治法中扩展了从细菌细胞膜中提取和富集的方法, 该协议包括去除非脂蛋白污染物的附加步骤, 增加脂蛋白产量和纯度。由于脂蛋白是常用的收费样受体 (TLR) 检测, 这是至关重要的第一个特点的 n-终端结构的 MALDI 的 MS. 本文提出了一种分离富集在 n-端的浓疏水性多肽的方法。脂肽适合直接分析的 MALDI 女士/ms. 经月桂酸钠分离的脂质体-丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 被转移到硝化纤维膜上, 消化原位 胰蛋白酶, 依次洗涤去除极性胰蛋白酶肽, 最后洗脱与氯仿-甲醇。当与洗涤液中极性 trypsinized 肽的 MS 结合时, 这种方法提供了在单个实验中识别脂蛋白并表征其 n-终点的能力。故意的钠加成物也可以作为一种工具, 以促进更结构化的信息碎片谱。最终, 脂蛋白的丰富和对其 n-端结构的测定将允许对这种无处不在的细菌蛋白进行更广泛的研究。

引言

细菌脂蛋白的特点是保守的 n-末端脂修饰半胱氨酸, 锚定球形蛋白领域的细胞膜表面。它们是普遍分布在细菌, 构成2到5% 的所有细胞基因在一个典型的基因组¹。脂蛋白在多种细胞过程中起关键作用, 包括养分吸收、信号传导、蛋白质复合体的组装以及维持细胞包络结构完整性²。在致病性细菌中, 脂蛋白作为致病因子^3,4。在感染过程中, 通过类似于收费受体 (TLR) 2 对 n-端脂肽的识别, 激发了先天免疫应答, 以清除入侵的病原体。根据 n-端酰化态, 脂蛋白通常由交替 TLR2 heterodimeric 配合物识别。TLR2-TLR1 承认 n-酰脂肽, 而 TLR2-TLR6 束缚自由脂肽α氨基终点。一旦绑定, 信号通路汇聚以诱导分泌促炎细胞因子^3,4。

以前认为, 革兰氏阳性菌脂蛋白 diacylated, 革兰阴性菌 triacylated, 不同于不存在或存在酰胺相关脂肪酸的保守 n-端半胱氨酸残留。这种假设支持的是缺乏序列 orthologs 的革兰阳性基因组 Lnt, 革兰阴性 n-酰基转移酶, 形成 triacylated 脂蛋白⁵。然而, 最近的研究揭示了 Firmicutes 中缺乏lnt的脂蛋白 triacylation, 以及三种新的 n-端脂蛋白结构, 称为 peptidyl、溶血和n-乙酰形式^{67 ,8}。这些发现引发了对可能尚未发现的脂蛋白形态的质疑, 还有关于这些新脂蛋白是如何制作的基本问题, 以及各种形式所传授的生理目的或优势。此外, 他们清楚地表明, 目前基因组无法预测脂蛋白结构。事实上, 我们最近发现了一种新的类脂蛋白 n-酰转移酶, 称为点燃, 从粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌, 使溶血脂蛋白 9.这表明需要实验性地验证脂蛋白结构, 这可能是挑战, 由于其极其疏水性的性质和有限的方法, 以表征其分子结构。

为了促进对脂蛋白诱导宿主免疫应答以及 n 末端结构测定的研究, 我们已经修改了几种先前描述的协议, 以纯化细菌脂蛋白并制备 n-端胰蛋白酶。脂肽用于分析的 MALDI MS 6, 10, 11, 12.脂蛋白是丰富使用建立的海卫 X-114 (从今以后称为表面活性剂或 TX-114) 相分配方法, 优化去除污染的非脂蛋白和增加脂蛋白产量。这些脂蛋白适用于直接使用 TLR 化验或进一步纯化的 SDS 页。对于 MALDI MS, 脂蛋白转移到硝化棉膜提供了一个脚手架, 有效的原位胰蛋白酶消化, 洗涤, 并随后从膜表面洗脱, 导致高度纯化的 n-端脂肽。硝化棉已被证明可以促进样品处理和改善序列覆盖的高度疏水性肽从整体膜蛋白^13,14, 以及脂蛋白^9,10.该方法具有以极性为基础的分馏肽的额外优势, 在单实验中, 可以分析中间洗涤液与 n-末端结构测定同时进行高置信蛋白鉴定。.该协议独特的特点是有意的钠加成层, 以促进在 ms/毫秒内的父离子分裂为 dehydroalanyl 离子, 协助结构分配的N-酰化态。N 终点是与 TLR 识别脂蛋白有关的最大变量和关键特征。总之, 本议定书允许对脂蛋白进行深入和可重复性的研究, MALDI 的纯化和结构测定的各个阶段根据实验的总体目标容易适应。

研究方案

1. 细胞生长和裂解

1. 在15毫升胰蛋白酶大豆肉汤中生长细菌或类似的富媒体到晚期指数相 (OD₆₀₀ 1.0-1.5)。用离心法收割细胞, 用三缓冲盐水/EDTA (TBSE) 冲洗一次, 并继续使用协议或冷冻直至用途。
   注: TBSE:20 毫米三盐酸盐 (HCl), pH 值 8.0, 130 毫米氯化钠 (氯化钠), 和5毫米乙二胺乙酸 (EDTA))。脂蛋白表达和修饰可能受生长条件 (例如酸度、盐度、生长介质) 和生长阶段¹⁵的影响。细胞生长可以按需要进行缩放, 但是建议用15毫升的细胞来单独制备脂蛋白, 因为过量的生物量可以降低脂蛋白的产量。一个15毫升的准备通常产生足够的样本, 以最佳负载2-4 车道上的标准 SDS 页迷你凝胶。
2. 并用重悬细胞在 800 ul TBSE 与1毫米苄磺酰氟 (PMSF) 和0.5 毫克/毫升溶菌酶。转移解决方案到一个2.0 毫升螺纹离心管与螺钉盖和 O 形环和孵化20分钟37摄氏度。
   注意: 某些物种不容易溶菌酶溶解。应用适当的裂解酶代替以帮助裂解。
3. 将 800 ul 0.1 毫米氧化锆/二氧化硅微珠添加到管中, 在每一个周期之间的5个循环中, 以最大速度 (7000 rpm) 在均质机上摇晃, 以达到每一个循环之间的2分钟, 从而破坏细胞。
4. 离心样品在 3000 x g 5 分钟在4°c (对颗粒珠和未连续的细胞)。将上清液转移到新的2.0 毫升离心管上, 并保持冰。
5. 添加 200 ul TBSE 到剩余的颗粒, 并返回到均质机的一个额外的周期。离心机 (如上所述) 与上清液结合上清液 (应为 800-1000 ul 总容积)。

2. TX-114 相分配法富集脂蛋白

1. 用 TX-114 表面活性剂补充上清液到最终浓度为 2% (卷/量) 通过增加等量的 4% (音量/容量) 表面活性剂在冰冷 TBSE 和孵化在冰上1小时, 混合通过反转每 ~ 15 分钟。
   注: 当冷却时, 上清和表面活性剂将被混溶。
2. 将管子转移到37摄氏度的水浴中, 孵化10分钟, 诱导相分离。在室温下, 将样品以 1万 x g 为10分钟离心, 以保持双相分离。
3. 轻轻地移开上水相并丢弃。在较低的表面活性剂阶段加入冰冷 TBSE, 将管子重新装入原体积, 并将其转化为混合。在冰上孵育10分钟。
4. 将管子转移到37摄氏度的水浴中, 孵化10分钟, 以诱导相分离, 然后离心机在 1万 x g 处室温下进行10分钟。
5. 重复步骤 2.3-2.4 次, 总共3个分色。移除上水相并丢弃。
6. 去除萃取过程中形成的沉淀蛋白颗粒 (可见于管底), 加入1的冰冷 TBSE 到表面活性剂相。离心机在4°c 在 1.6万 x g 为2分钟到颗粒不溶性蛋白质。
   注: 样品应保持单一的阶段。如果相分离发生, 重新冷却样品和离心机。该颗粒一般由非脂蛋白污染物组成, 但可保留以供进一步分析。
7. 立即转移上清到一个新鲜的2.0 毫升离心管含有 1250 ul 100% 丙酮。吸管向上和向下彻底清洗样品从尖端, 因为它将是粘性的。混合通过反转和孵化隔夜在-20 °c 沉淀蛋白。
8. 离心样品在 1.6万 x g 在室温下为20分钟的颗粒脂蛋白, 注意管的方向。脂蛋白会沿着管子的外壁形成一层薄薄的白色薄膜。
9. 用100% 丙酮清洗颗粒两次。醒酒丙酮, 并允许样品风干。
10. 添加 20-40 ul 10 毫米三 HCl, pH 8.0 或标准 Laemmli SDS 页样本缓冲区¹⁶ , 并彻底并用重悬吹打上下对墙壁与沉淀脂蛋白。用吸管尖刮掉管子的一侧以去除脂蛋白。
    注: 脂蛋白不会溶解在三个缓冲, 而是形成一个悬浮。
    1. 储存脂蛋白在-20 °c, 直到使用。

3. SDS 页、Electroblotting 和胭脂红的染色

1. 使用标准方法¹⁶, 用 SDS 页分隔脂蛋白。
   注: 适当的凝胶丙烯酰胺百分比将根据其预期用途和脂蛋白的大小而异。在这里,大肠杆菌脂蛋白被分离了10% 三甘氨酸凝胶, 而16.5% 三 tricine 凝胶用于小的大肠杆菌脂蛋白 Lpp¹⁷。
2. 使用标准的 electroblotting 程序将脂蛋白转移到硝化棉转移膜上。
   注意: 使用 Bjerrum 谢弗-尼尔森缓冲器加 0.1% SDS 的半干转移是在 25 V, 1.3 mA 上执行15分钟¹⁸。交替地, 聚偏聚氟 (PVDF) 膜可以使用, 但由于它比硝化纤维素更疏水性, 它可能减少疏水性脂肽的有效洗脱从膜在以后的步骤。
3. 将硝化膜转移到容器中, 用胭脂红溶液 (0.2% (w/v) 胭脂红5% 乙酸) 覆盖。轻轻摇动5分钟, 或直到红色粉红色的条纹可见。
4. 倒入胭脂红溶液, 用 dH₂O 小心冲洗硝化棉膜, 去除多余的污渍。
   注: 胭脂红染色带将迅速 destain。如果乐队消失, 重复染色过程。
5. 用干净的刀片, 消费所需的带和转移到离心管。用1毫升 dH₂O 洗涤三次, 完全 destain 带。
   注意: 协议可以在这里暂停。将被切除的部分用水覆盖-20 摄氏度, 直到使用。
6. 将该部分转移到干净的表面, 用干净的剃刀刀片, 将硝化棉片切成大约1毫米 x 1 毫米的小块. 将这些碎片收集成一个0.5 毫升低蛋白结合离心管。
7. 用0.5 毫升新鲜制备的50毫米碳酸氢铵 (NH₄HCO₃), 用高效液相色谱 (HPLC) 级水中的 pH 值7.8 清洗两次工件。

4. 胰蛋白酶消化, 从硝化棉膜中提取脂肽, 沉积到 MALDI 靶上, 并进行数据采集

1. 并用重悬硝化棉片在 20 ul 20 微克/毫升溶液的胰蛋白酶在50毫米_NH4_HCO3, pH 7.8 在 HPLC 级水中。涡流混合, 然后简单地旋转, 以确保所有的部分完全覆盖的胰蛋白酶溶液。用石蜡膜覆盖管盖, 以防止蒸发和孵育消化过夜在37摄氏度。
2. 旋转样品在 1.6万 x g 三十年代和去除液体吹打。
   注意: 这去除了 trypsinized 亲水性肽, 可以在以后被 MALDI 的 MS 用于蛋白质鉴定。
3. 在 HPLC 级水中加入 50 ul 0.5% 三氟乙酸酸 (TFA)。涡流混合, 然后简单地旋转样品, 以确保所有零件都被溶液覆盖。室温下孵育10分钟。用吹打除去液体。
   警告:TFA 是有害的, 如果吸入。小心处理并在化学油烟机中使用。避免接触皮肤。
4. 重复步骤4.3 与 50 ul 10% 乙腈在 HPLC 级水。
   警告:乙腈吸入有害。小心处理并在化学油烟机中使用。避免接触皮肤。
5. 重复步骤4.3 与 50 ul 20% 乙腈在 HPLC 级水。
   注意: 这去除松散地束缚在硝化棉中的任何适度疏水肽。
6. 为洗脱紧密绑定的脂肽, 添加 15 ul 的新制成的10毫克/毫升α氰基-4-肉桂酸 (CHCA) 基质溶解在氯仿-甲醇 (2:1, v/v) 和孵化为10分钟在室温下, 间歇性涡流。
   1. 交替地, 添加 15 ul 氯仿-甲醇洗脱脂肽, 并与基质混合在以后的时间。其他矩阵, 如 25-苯甲酸酸 (DHB), 应作为替代 CHCA, 如果获得不满意的结果, 为特定的脂肽组成。
      警告:氯仿和甲醇都是有害的, 如果吸入。小心处理并在化学油烟机中使用。避免接触皮肤。
   2. 可选:为促进钠合物的形成, 用水碳酸氢钠 (NaHCO₃) 补充氯仿-甲醇中 CHCA 的溶液, 最终浓度为1毫米。
7. 简单地旋转示例。用吸管, 小心地将液体转移到一个新的低蛋白结合离心管。此解决方案将包含 N 终端脂肽的大部分。
   注: 硝化棉可部分或完全溶解在氯仿-甲醇溶液中。这不会对 MS 结果产生负面影响, 可以作为替代方法来增加脂肽的回报。PVDF 膜不会以同样的方式溶解。
8. 将洗脱脂肽的 1 ul 沉积在抛光钢 MALDI 靶上 CHCA。
   注: 氯仿-甲醇将迅速蒸发, 留下结晶 CHCA 和脂肽。可选的第二 1 ul 整除可以放置到同一地点, 以增加样品浓度。氯仿-甲醇在沉积到靶上后可能会有很大的扩散, 因此应注意避免样品在靶上混合。建议将每个样品的多个斑点存入并拍摄。
9. 立即进行质谱分析。扫描现场的所有区域的脂肽信号, 特别是如果现场包含两层样本, 因为第二层可能推脂肽到现场的外缘。
   注: 建议的启动激光强度为 25%, 但可能需要增加强度获取信号和总和多光谱 (20 或更多的扫描), 以达到足够的信噪比。在这里, 光谱是在一个 MALDI 的仪器上获得的 (参见材料表), 使用工厂配置的仪器方法对 700-3500 m/z范围的反射器进行正离子检测。该仪器用牛血清白蛋白 (BSA) 胰蛋白酶肽混合物进行校准。

结果

协议的示意图在图 1中提供。图 2中显示了从粪肠球菌ATCC 19433 中提取的富含脂蛋白的分数 TX-114。为比较, 还显示了沉淀蛋白分数的带状模式。从这个分数的蛋白质证实了 MALDI-MS 是高度丰富的污染蛋白质以外的脂蛋白 (表 1)。在图 3中的质谱显示了 PnrA 的胰蛋白酶肽离子剖面, 该蛋白是在?...

讨论

本协议描述了两个不同阶段的脂蛋白表征: 富集 TX-114 相分配和结构确定的 MALDI MS。在 TX-114 萃取过程中, 额外的离心去除了在这个过程中沉淀的蛋白质, 其次是丙酮沉淀产生高浓度脂蛋白。通过将每个准备的规模限制为15毫升的细胞, 可以很容易地并行处理多个样本, 如果需要, 则在协议结束时将它们汇集在一起。

对于 MS 的结构分析, 将脂蛋白转移到硝化纤维素, 有利于胰蛋白酶...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser