Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

Résumé

L’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une phase de surfactant non ionique, méthode de partitionnement est décrite pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou d’autres applications. D’autres mesures sont détaillées pour préparer des N-terminal lipopeptides tryptique pour la caractérisation structurale par spectrométrie de masse.

Résumé

Les lipoprotéines sont des constituants importants de l’enveloppe de la cellule bactérienne et puissants activateurs de la réponse immunitaire innée chez la mammifères. Malgré leur importance à la fois la physiologie cellulaire et immunologie, il reste encore beaucoup à découvrir sur les lipoprotéines nouveaux formulaires, comment ils sont synthétisés et l’effet des différentes formes sur l’immunité de l’hôte. Pour permettre des études approfondies sur les lipoprotéines, ce protocole décrit une méthode pour l’enrichissement de lipoprotéines bactériennes et préparation de N-terminal lipopeptides tryptique pour la détermination de structure par laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS). Poursuivant sur une phase de Triton X-114 établie partitionnement méthode pour extraction de lipoprotéines et l’enrichissement de la membrane de la cellule bactérienne, le protocole prévoit des mesures supplémentaires pour éliminer les contaminants non-lipoprotéines, augmentant le rendement de la lipoprotéine et pureté. Étant donné que les lipoprotéines sont couramment utilisés dans les essais de récepteurs Toll-like (TLR), il est essentiel d’abord caractériser la structure de N-terminal par MALDI-TOF Mme Herein, on présente une méthode pour isoler des peptides hydrophobes concentrés enrichis en N-terminal lipopeptides adaptés à l’analyse directe par MALDI-TOF MS/MS. lipoprotéines qui ont été séparés par électrophorèse Sodium dodécyl Sulfate Poly-Acrylamide (SDS-PAGE) sont transférées à une membrane de nitrocellulose, digérés in situ avec la trypsine, séquentiellement lavé pour enlever des peptides tryptiques polaires et finalement élué avec du chloroforme-méthanol. Lorsqu’il est couplé avec MS des peptides trypsinisés plus polaires de solutions de lavage, cette méthode fournit la capacité à identifier la lipoprotéine et caractériser son extrémité N-terminale dans une expérience simple. Formation d’un adduit sodium intentionnelle peut également être utilisée comme un outil pour promouvoir plusieurs spectres de fragmentation structurellement informative. En fin de compte, enrichissement des lipoprotéines et détermination de leurs structures de N-terminal permettra des études plus approfondies sur cette classe omniprésente des protéines bactériennes.

Introduction

Lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par une conservée cystéine des lipides modifiés de N-terminal qui ancre le domaine protéine globulaire à la surface de la membrane cellulaire. Ils sont universellement distribués chez les bactéries, qui constituent 2 à 5 % de tous les gènes cellulaires au sein d’un génome typique¹. Assemblée de complexes protéiques et dans le maintien de cellules enveloppe intégrité structurale², lipoprotéines jouent un rôle crucial dans une grande variété de processus cellulaires, notamment l’absorption des éléments nutritifs, transduction du signal. Chez les bactéries pathogènes, lipoprotéines servent de facteurs de virulence^3,4. Lors d’une infection, reconnaissance des lipopeptides N-terminale de récepteur Toll-like (TLR) 2 incite à une réaction immunitaire innée pour éliminer les pathogènes envahisseurs. Selon l’état de l’acylation N-terminale, lipoprotéines sont généralement reconnus par le remplaçant TLR2 hétérodimérique complexes. TLR2-TLR1 reconnaît N-acylés lipopeptides, tandis que TLR2-TLR6 lie lipopeptide libre α-aminé termini. Une fois lié, les voies de signalisation convergent pour induire la sécrétion de proinflammatory cytokines^3,4.

On pensait auparavant que lipoprotéines de bactéries Gram-positives ont été diacylated et ceux des bactéries à Gram négatif triacylated, différant par l’absence ou la présence d’un acide gras amidé sur le résidu de cystéine N-terminale conservé. Cette hypothèse a été soutenue par l’absence de séquences orthologues dans les génomes de Lnt, la transférase de N-acyl-Gram négatif qui forme triacylated lipoprotéines⁵Gram positifs. Cependant, des études récentes ont révélé triacylation lipoprotéine dans Firmicutes Gram positif que manque lnt, ainsi que trois structures de lipoprotéines N-terminal roman, appelés la peptidyl, lyso et N -acétyl formes^{6,7 ,},⁸. Ces résultats soulèvent des questions sur les formulaires de lipoprotéine d’encore-à-être-découvert possible, aux côtés des questions fondamentales sur comment ces nouvelles lipoprotéines sont faites et quel but physiologique ou avantage répandre des diverses formes. En outre, ils démontrent clairement l’incapacité actuelle de la génomique pour prédire la structure de lipoprotéines. En effet, nous avons récemment identifié une nouvelle classe de transférase de N-acyl-lipoprotéine, appelé Lit, Enterococcus faecalis et Bacillus cereus qui rend lyso-formulaire lipoprotéines⁹. Ceci indique la nécessité de vérifier expérimentalement la structure de lipoprotéines, qui peut s’avérer difficile en raison de leur nature extrêmement hydrophobe et limitée des méthodes permettant de caractériser leur structure moléculaire.

Pour faciliter les études sur l’induction de la réponse immunitaire de l’hôte, ainsi que la détermination structurale N-terminal de lipoprotéine, nous avons adapté plusieurs protocoles décrits précédemment afin de purifier les lipoprotéines bactériennes et préparer le tryptique N-terminal lipopeptides pour analyse par MALDI-TOF MS^6,10,11,12. Les lipoprotéines sont enrichis en utilisant une phase de X-114 Triton (désormais dénommé surfactant ou TX-114) établie partitionnement méthode, avec optimisation pour enlever les contaminants non-lipoprotéines et augmenter le rendement de la lipoprotéine. Ces lipoprotéines sont appropriés pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou pour davantage de purification par SDS-PAGE. Pour MALDI-TOF MS, transfert des lipoprotéines de membrane de nitrocellulose fournit un échafaudage pour efficace in situ la digestion trypsique, lavage et élution subséquente de la surface de la membrane, ce qui entraîne très purifiée lipopeptides N-terminale. Nitrocellulose a été établi pour faciliter la manipulation des échantillons et améliorer la couverture de séquence pour les peptides fortement hydrophobes de l’intégrale de membrane protéines^13,14, ainsi que les lipoprotéines^9,10 . La méthode a l’avantage supplémentaire de fractionnement des peptides basées sur la polarité, afin que des solutions de lavage intermédiaire peuvent être analysées pour l’identification de protéines de haute confiance en même temps que la détermination de structure N-terminale dans une expérience simple . Ce protocole unique sodium intentionnelle caractéristiques la formation d’adduits à promouvoir la fragilisation d’ion parent vers dehydroalanyl ions pendant MS/MS, aidant à affectation structurelle de l’état d’acylation - N. L’extrémité N-terminale est deux la fonctionnalité plus variable et clée liée à la reconnaissance TLR des lipoprotéines. Pris ensemble, ce protocole a permis des études intensives et reproductibles sur les lipoprotéines, les différentes étapes de purification et de la détermination de structure par MALDI-TOF MS facilement adapté selon l’objectif global de l’expérience.

Protocole

1. la croissance et la lyse des cellules

1. Se développent bactéries dans 15 mL de bouillon de trypticase soja (TSB) ou multimédias semblables à la fin de la phase exponentielle (OD₆₀₀ de 1,0 à 1,5). Récolter les cellules par centrifugation, laver une fois avec une solution saline tampon Tris/EDTA (TBSE) et poursuivre avec le protocole ou geler jusqu'à l’utilisation.
   NOTE : TBSE : 20 mM Tris-hydrochloride (HCl), pH 8,0, le chlorure de sodium (NaCl), 130 mM et 5 mM d’acide tétraacétique (EDTA)). Modification et expression de lipoprotéines peuvent être influencés par des conditions de croissance (p. ex. l’acidité, salinité, milieux de culture) et la phase de croissance¹⁵. La croissance des cellules peut évoluer comme vous le souhaitez, mais 15 mL de cellules est recommandé pour une préparation unique de lipoprotéines comme la biomasse excédentaire peut diminuer le rendement des lipoprotéines. Une préparation de 15 mL donne généralement assez échantillon pour un chargement optimal de ~ 2 à 4 voies sur un gel mini standard de SDS-PAGE.
2. Remettre en suspension les cellules en 800 μL TBSE avec fluorure de sulfonyle de benzyle 1 mM (PMSF) et le lysozyme de 0,5 mg/mL. Transvaser la solution dans un tube de microcentrifuge fileté 2,0 mL avec bouchon à vis et le joint torique et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
   NOTE : Certaines espèces ne sont pas sensibles à la lyse par la lysozyme. Une enzyme lytique appropriée devrait être substituée afin d’aider à la lyse.
3. Ajouter des perles de zircone/silice 0,1 mm ~ 800 μL dans le tube et perturber les cellules par agitation à vitesse maximale (7 000 tr/min) sur un homogénéisateur pour 5 cycles de 30 s chacune, avec 2 min de repos sur la glace entre chaque cycle.
4. Échantillon de centrifuger à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C (pour granuler perles et ininterrompu de cellules). Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 2,0 mL et rester sur la glace.
5. Ajouter 200 μl TBSE au culot restant et revenir à l’homogénéisateur pour un cycle supplémentaire. Centrifuger (voir ci-dessus) et combiner le surnageant avec le surnageant précédent (devrait être le volume total de la 800-1000 μL).

2. enrichissement des lipoprotéines par séparation de phases TX-114

1. Compléter le surnageant avec TX-114 agent tensio-actif à une concentration finale de 2 % (vol/vol) en ajoutant un volume égal de 4 % (vol/vol) le surfactant dans TBSE glacée et incuber sur glace pendant 1 heure, mélanger par inversion chaque ~ 15 min.
   Remarque : Lorsqu’on les refroidit, le surnageant et le surfactant sera miscibles.
2. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et laisser incuber pendant 10 min induire la phase de séparation. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour maintenir l’espacement bi-phasique.
3. Doucement Pipetter au large de la phase aqueuse supérieure et le jeter. Ajouter TBSE glacé à la phase inférieure de surfactant pour remplir le tube à son volume initial et renverser pour mélanger. Incuber sur glace pendant 10 min.
4. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et incuber pendant 10 min induire la séparation des phases, puis centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à température ambiante.
5. Répétez les étapes 2,3-2,4 fois plus pour un total de 3 séparations. La phase aqueuse supérieure de retirer et jeter.
6. Enlever la pastille de protéines précipités formé au cours de l’extraction (visible au fond du tube), en ajoutant 1 volume de TBSE glacé à la phase de surfactant. Centrifuger à 4 ° C à 16 000 x g pendant 2 min granuler les protéines insolubles.
   NOTE : Échantillon doit rester une seule phase. En cas de séparation de phase, re-chill échantillon et centrifuger à nouveau. Le culot est généralement composé de contaminants non-lipoprotéines, mais peut être conservé pour une analyse ultérieure.
7. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube de frais microtubes de 2,0 mL contenant 1250 μL d’acétone 100 %. Pipette de haut en bas soigneusement laver l’échantillon de la pointe, car il sera visqueuse. Mélanger par retournement et incuber une nuit à-20 ° C à précipiter les protéines.
8. Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 20 min à température ambiante pour granuler des lipoprotéines avec attention à l’orientation du tube. Lipoprotéines formera un film mince, blanc le long de la paroi extérieure du tube.
9. Pellet de laver deux fois avec l’acétone à 100 %. Décanter l’acétone et laisser l’échantillon à l’air sec.
10. Ajouter 20-40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ou une norme Laemmli SDS-PAGE échantillon tampon¹⁶ et soigneusement resuspendre par pipetage verticalement contre le mur avec les lipoprotéines précipités. Raclez les parois de l’éprouvette avec l’embout de la pipette pour déloger des lipoprotéines.
    Remarque : Les lipoprotéines seront dissoudront pas dans un tampon Tris, mais plutôt forment une suspension.
    1. Stocker des lipoprotéines à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. SDS-PAGE, Electroblotting et coloration avec Ponceau S

1. Lipoprotéines séparés par SDS-PAGE à l’aide de méthodes standard¹⁶.
   NOTE : Le pourcentage d’acrylamide gel appropriée variera selon son utilisation prévue et de la taille des lipoprotéines. Ici, E. faecalis lipoprotéines ont été séparés sur un 10 % gel de Tris-glycine, alors qu’un gel de Tris-tricine 16,5 % a été utilisé pour la lipoprotéine d’e. coli plus petite Lpp¹⁷.
2. Transférer les lipoprotéines à une membrane de nitrocellulose transfert en utilisant une procédure standard electroblotting.
   Remarque : Un transfert semi-sec à l’aide de Bjerrum Schafer-Nielsen tampon plus 0,1 % SDS s’est déroulée à 25 V, 1.3 mA pour 15 min¹⁸. Alternativement, membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) pourrait être utilisé, mais comme il est plus hydrophobe que la nitrocellulose, elle pourrait diminuer efficace d’élution des lipopeptides hydrophobe de la membrane aux étapes ultérieures.
3. Transférer la membrane de nitrocellulose dans un récipient et le couvercle avec la solution de Ponceau S (0,2 % (p/v) : Ponceau S dans l’acide acétique à 5 %). Rocher doucement pendant 5 min ou jusqu'à ce que les bandes rouge-rose sont visibles.
4. Décanter la solution de Ponceau S et Rincez soigneusement la membrane de nitrocellulose avec dH₂O pour supprimer excès stain.
   NOTE : Les bandes colorées Ponceau vont décolorer rapidement. Si les bandes disparaissent, répétez le processus de coloration.
5. Avec une lame de rasoir propre, exciser la bande désirée et transférez dans un tube de microcentrifuge. Laver trois fois avec 1 mL de dH₂O à décolorer entièrement la bande.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Stocker la section excisée recouverte d’eau à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
6. La section de transfert sur une surface propre et avec une lame de rasoir propre, dés la bande de nitrocellulose en petits morceaux d’environ 1 mm x 1 mm. collecter les morceaux dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL hypoprotidique liaison.
7. Laver les morceaux deux fois avec 0,5 mL de fraîchement préparés 50 mM de bicarbonate d’ammonium (NH₄HCO₃), pH 7,8 en eau de qualité de chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

4. tryptique Digestion, Lipopeptide Extraction de la Membrane de Nitrocellulose, déposition sur cible MALDI et Acquisition de données

1. Remettre en suspension les morceaux de nitrocellulose dans 20 μL d’une solution de 20 μg/mL de trypsine dans 50 mM NH₄HCO₃pH 7,8 en eau de qualité HPLC. Vortex pour mélanger, puis tourner brièvement pour s’assurer que toutes les pièces sont entièrement couverts par la solution de trypsine. Couvrir le couvercle du tube à l’aide de film de paraffine pour éviter l’évaporation et incuber digérer pendant une nuit à 37 ° C.
2. Rotation de l’échantillon à 16 000 x g pendant 30 s et retirer le liquide de pipetage.
   NOTE : Cette commande supprime les peptides hydrophiles trypsinisés pouvant être examinés plus tard par MALDI-TOF MS pour l’identification des protéines.
3. Ajouter 50 μL de 0,5 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans l’eau de qualité HPLC. Vortex pour mélanger, puis faites tourner l’échantillon brièvement pour s’assurer que toutes les pièces sont couverts par la solution. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Retirer le liquide de pipetage.
   Mise en garde : TFA est nocif par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
4. Répétez l’étape 4.3 avec 50 μL de 10 % d’acétonitrile dans l’eau de qualité HPLC.
   Mise en garde : L’acétonitrile est nocif par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
5. Répétez l’étape 4.3 avec 50 μL de 20 % d’acétonitrile dans l’eau de qualité HPLC.
   Remarque : Cette commande supprime toute peptides modérément hydrophobes faiblement liées à la nitrocellulose.
6. Éluer les lipopeptides étroitement liée, ajouter 15 μl de matrice (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique 10 mg/mL fraîchement dissoute dans du chloroforme-méthanol (2:1, v/v) et incuber pendant 10 min à température ambiante avec agitation intermittente.
   1. On peut aussi ajouter 15 μL de chloroforme-méthanol pour éluer les lipopeptides et matrice se mêlent à une date ultérieure. Autres matrices, tels que l’acide 2, 5-dihydroxybenzoïque (DHB), doivent être testés comme solutions de rechange de CHCA si on obtient des résultats insatisfaisants pour une composition particulière lipopeptide.
      Mise en garde : Tant chloroforme / méthanol sont nocifs par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
   2. Facultatif : Sodium de promouvoir la formation d’adduits, compléter la solution de CHCA dans le chloroforme-méthanol avec du bicarbonate de sodium aqueux (NaHCO₃) à une concentration finale de 1 mM.
7. Faire tourner l’échantillon brièvement. Avec une pipette, transvaser avec soin le liquide dans un nouveau tube de microcentrifuge de liaison faible en protéines. Cette solution contient l’essentiel de la lipopeptides N-terminale.
   Remarque : La nitrocellulose peut partiellement ou totalement se dissolvent dans la solution de chloroforme-méthanol. Cela n’affectera pas négativement les résultats de MS et peut être utilisé comme une méthode alternative d’accroître le rendement de lipopeptides. Membrane de PVDF se dissoudront pas de la même manière.
8. Déposer 1 μL des lipopeptides éluée avec CHCA sur une cible MALDI en acier polie.
   Remarque : Le chloroforme-méthanol s’évaporera rapidement, laissant derrière eux cristallisé CHCA et lipopeptides. Une option seconde 1 μL aliquote peut être déposé sur le même endroit pour augmenter la concentration de l’échantillon. Chloroforme-méthanol peut se propager significativement après la déposition sur la cible et à ce titre, il faut pour éviter le mélange d’échantillon sur la cible. Il est recommandé de déposer et de tirer plusieurs spots de chaque échantillon.
9. Procéder immédiatement à la spectrométrie de masse. Balayer tous les domaines de la tache pour lipopeptide signal, surtout si l’endroit contient deux couches d’échantillon, car la deuxième couche peut pousser les lipopeptides au bord extérieur de la tache.
   NOTE : Intensité du laser départ recommandée est 25 %, mais il peut être nécessaire d’augmenter l’intensité pour acquérir le signal et la somme de plusieurs spectres (analyses de 20 ou plus) pour atteindre le rapport signal-bruit proportionné. Ici, les spectres ont été acquis sur un instrument de MALDI-TOF-TOF (voir la Table des matières) en utilisant une méthode de l’instrument configuré en usine pour la détection d’ions positifs de réflecteur sur la plage de m/z 700-3500. L’appareil a été étalonné avec un mélange de peptide trypsique de l’albumine sérique bovine (BSA).

Résultats

Une représentation schématique du protocole est fournie à la Figure 1. La fraction enrichie en lipoprotéines extraite de Enterococcus faecalis ATCC 19433 par TX-114 est illustrée à la Figure 2. À titre de comparaison, le marquage chromosomique de la fraction des protéines précipitées est aussi indiquée. Protéines de cette fraction ont été confirmés par MALDI-MS pour être très abondantes contaminent les p...

Discussion

Le protocole ci-après décrit deux étapes distinctes de caractérisation des lipoprotéines : enrichissement de TX-114 phase de détermination de partitionnement et structurale par MALDI-TOF MS. Pendant l’essorage TX-114, centrifugation supplémentaire supprime les protéines contaminantes qui précipitent au cours de ce processus, suivi par la précipitation de l’acétone à céder des lipoprotéines hautement enrichis. En limitant l’échelle de chaque préparation à une valeur de 15 mL de cellules, plusieurs ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser