Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Resumen

El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.

Resumen

Las lipoproteínas son importantes componentes de la envoltura celular bacteriana y potentes activadores de la respuesta inmunitaria innata mamífera. A pesar de su importancia para la fisiología celular e Inmunología, queda mucho por descubrir el efecto de las distintas formas sobre la inmunidad del anfitrión, cómo se sintetizan y lipoproteína novedosas formas. Para permitir estudios cuidadosos en las lipoproteínas, este protocolo describe un método para el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos tríptico N-terminal para la determinación estructural por láser de matriz asistida por desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS). Expansión en una fase de Tritón X-114 establecida repartir método para la extracción de la lipoproteína y enriquecimiento de la membrana celular bacteriana, el protocolo incluye medidas adicionales para eliminar contaminantes no-lipoproteína, aumentar la producción de lipoproteínas y pureza. Puesto que las lipoproteínas son comúnmente utilizadas en ensayos de Toll-like receptor (TLR), es fundamental primero caracterizar la estructura del N-terminal por MALDI-TOF MS. adjunto, se presenta un método para aislar péptidos hidrofóbicos concentrados enriquecidos en N-terminal lipopéptidos de directo análisis por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que se han separado por electroforesis en Gel poli-acrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, digerido en situ con tripsina, secuencialmente se lava para quitar polar péptidos trípticos y finalmente se eluyeron con Cloroformo-metanol. Cuando se combina con MS de los péptidos más polares de trypsinized de soluciones de lavado, este método proporciona la capacidad para identificar la lipoproteína y caracterizar su N-terminal en un solo experimento. Sodio intencional aducción formación también puede ser empleado como una herramienta para promover más espectros de fragmentación estructural informativo. En última instancia, el enriquecimiento de lipoproteínas y determinación de sus estructuras del N-terminal permitirá estudios más extensos en esta clase ubicua de proteínas bacterianas.

Introducción

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por una conservada N-terminal modificada en lípidos cisteína que ancla el dominio globular de la proteína a la superficie de la membrana de la célula. Están distribuidos universalmente en las bacterias, constituyendo el 2 y el 5% de todos los genes celulares dentro de un genoma típico¹. Las lipoproteínas juegan un papel crítico en una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la absorción de los nutrientes, transducción de señales, montaje de complejos de proteínas y en el mantenimiento de la célula envolvente integridad estructural². En bacterias patógenas, las lipoproteínas sirven como factores de virulencia^3,4. Durante una infección, reconocimiento de lipopéptidos N-terminal por Toll-like receptor (TLR) 2 genera una respuesta inmune innata para eliminar patógenos invasores. Dependiendo del estado de acilación del N-terminal, las lipoproteínas son reconocidas generalmente por alternativos complejos heterodiméricos de TLR2. TLR1 TLR2 reconoce N-acilados lipopéptidos, mientras que TLR2-TLR6 ATA gratis Lipopéptido termini α-amino. Una vez enlazado, convergen las vías de señalización para inducir la secreción de proinflammatory cytokines^3,4.

Se pensaba que las lipoproteínas de bacterias Gram-positivas eran diacylated y los de bacterias Gram-negativas triacylated, difiriendo en la ausencia o presencia de un ácido graso amida vinculados a los residuos conservados de cisteína N-terminal. Esta hipótesis fue apoyada por la falta de secuencia ortólogos en Gram-positivas genomas a Lnt, la Gram negativos N-acil transferasa que forma de lipoproteínas triacylated⁵. Sin embargo, estudios recientes han revelado triacylation lipoproteína en Gram-positivas Firmicutes falta lnt, así como tres nuevos N-terminal lipoproteína estructuras, denominadas la peptidil lyso y N -acetil formas^{6,7 ,8}. Estos resultados plantean cuestiones sobre formas posible lipoproteína con todo descubierto, junto a preguntas fundamentales acerca de cómo se hacen estas lipoproteínas novela y qué propósito fisiológico o ventaja imparten las distintas formas. Además, claramente demuestran la incapacidad actual de la genómica para predecir la estructura de la lipoproteína. De hecho, recientemente se identificaron una nueva clase de transferasas de N-acil de lipoproteína, llamado Lit, de Enterococcus faecalis y Bacillus cereus que hace forma de lyso lipoproteínas⁹. Esto indica la necesidad de verificar experimentalmente la estructura de la lipoproteína, que puede ser difícil debido a su naturaleza extremadamente hidrofóbica y métodos limitados disponibles para caracterizar su estructura molecular.

Para facilitar los estudios sobre la inducción de la lipoproteína de la inmunorespuesta del anfitrión, así como la determinación estructural del N-terminal, hemos adaptado varios protocolos descritos previamente para purificar las lipoproteínas bacterianas y preparar el caso del N-terminal lipopéptidos para análisis por MALDI-TOF MS^6,10,11,12. Las lipoproteínas están enriquecidas con una fase de X-114 de Tritón (en adelante denominado surfactante o TX-114) establecida repartir método, con optimización para eliminar contaminantes no-lipoproteínas y aumentar la producción de lipoproteína. Estas lipoproteínas son aptos para su uso directo en los ensayos de TLR o para su posterior purificación por SDS-PAGE. MALDI-TOF MS, transferencia de lipoproteínas de las membrana de nitrocelulosa proporciona un andamio para eficiente en situ la digestión de la tripsina, lavado y elución posterior de la superficie de la membrana, resultando altamente purificada lipopéptidos N-terminal. Nitrocelulosa se ha demostrado para facilitar el manejo de la muestra y mejorar la cobertura de la secuencia de péptidos altamente hidrofóbicos de las proteínas de membrana integral^13,14, así como las lipoproteínas^9,10 . El método tiene la ventaja adicional de fraccionamiento péptidos basados en polaridad, para que soluciones de lavado intermedio pueden ser analizadas para identificación de proteínas de alta confianza simultáneamente con determinación estructural N-terminal en un solo experimento . Presente Protocolo únicamente sodio intencional características aducción formación para promover la fragmentación de iones de padre hacia los iones dehydroalanyl en MS/MS, ayudar en la asignación estructural de estado N- acilación. N-terminal es la característica más variable y clave relacionados con el reconocimiento TLR de las lipoproteínas. Tomados en conjunto, este protocolo ha permitido estudios intensivos y reproducibles en las lipoproteínas, de las fases individuales de la purificación y determinación estructural por MALDI-TOF MS fácilmente adaptada dependiendo del objetivo del experimento.

Protocolo

1. crecimiento y lisis de la célula

1. Crecen bacterias en 15 mL de caldo de soja tríptica (TSB) o multimedia similar a última fase exponencial (OD₆₀₀ , de 1.0-1.5). Cosecha de las células por centrifugación, lavar una vez con tampón Tris salino/EDTA (TBSE) y continuar con el protocolo o congelar hasta su uso.
   Nota: TBSE: 20 mM Tris-clorhidrato (HCl), pH 8.0, 130 mM cloruro de sodio (NaCl) y 5 mM el ácido etilendiaminotetracético (EDTA)). Modificación y expresión de la lipoproteína pueden ser influenciados por las condiciones de crecimiento (por ejemplo, acidez, salinidad, medios de cultivo) y de la fase de crecimiento¹⁵. Crecimiento de la célula puede escalarse como deseado y 15 mL de células se recomienda para una sola preparación de lipoproteínas como biomasa exceso puede disminuir la producción de lipoproteína. Uno de 15 mL preparación generalmente produce suficiente muestra para la óptima carga de ~ 2-4 carriles en gel de SDS-PAGE mini estándar.
2. Resuspender las células en 800 μL TBSE con 1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF) y lisozima de 0.5 mg/mL. Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga roscada 2,0 mL con tapón de rosca y junta tórica e incubar por 20 min a 37 ° C.
   Nota: Algunas especies no son susceptibles a la lisis por la lisozima. Una enzima lítica apropiada debe sustituirse para ayudar en la lisis.
3. Añadir cuentas de zirconia/sílice de 0,1 mm de ~ 800 μL al tubo y romper células agitando a máxima velocidad (7.000 rpm) en un homogenizador durante 5 ciclos de 30 s cada uno, con 2 minutos reposar en hielo entre cada ciclo.
4. Muestra de centrífuga a 3000 x g durante 5 min a 4 ° C (para que sedimenten los granos y las células intactas). Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 2.0 mL y conservar en hielo.
5. Añada 200 μL TBSE al sedimento restante y volver al homogeneizador para un ciclo adicional. Centrífuga (como arriba) y combinar el sobrenadante con el sobrenadante anterior (debe ser 800-1000 μL volumen total).

2. enriquecimiento de lipoproteínas por partición de fase de TX-114

1. Complementar el sobrenadante con TX-114 surfactante a una concentración final de 2% (vol/vol) mediante la adición de un volumen igual del 4% (vol/vol) el surfactante en TBSE helada e incubar en hielo durante 1 hora, mezclar por inversión cada ~ 15 minutos.
   Nota: Frío, el sobrenadante y surfactante será miscibles.
2. Transferir el tubo a un baño de agua de 37 ° C e incubar por 10 min inducir la separación de fases. Centrifugar la muestra a 10.000 x g por 10 min a temperatura ambiente para mantener la separación bifásico.
3. Suavemente la pipeta de la fase acuosa superior y deseche. Añadir TBSE helada a la fase inferior de surfactante para rellenar el tubo a su volumen e invertir para mezclar. Incubar en hielo durante 10 minutos.
4. Transferir el tubo a un baño de agua de 37 ° C e incubar por 10 min inducir la separación de fases, luego centrifugar a 10.000 x g por 10 min a temperatura ambiente.
5. Repita los pasos 2.3-2.4 una vez más para un total de 3 separaciones. Retirar la fase acuosa superior y desechar.
6. Retire el pellet de proteínas precipitadas que formó durante el curso de extracciones (visibles en la parte inferior del tubo), mediante la adición de 1 volumen de TBSE helada a la fase de surfactante. Centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g durante 2 min a proteína insoluble de la pelotilla.
   Nota: La muestra debe permanecer una sola fase. Si se produce la separación de la fase, volver a enfriar la muestra y centrifugar nuevamente. El pellet está generalmente compuesto de lipoproteínas no contaminantes, pero puede ser retenido para su posterior análisis.
7. Inmediatamente transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL fresco que contiene 1250 μL de acetona al 100%. Pipetee hacia arriba y hacia abajo completamente para lavar la muestra de la punta ya que es viscosa. Mezclar por inversión e incubar durante la noche a-20 ° C para precipitar proteínas.
8. Centrifugar la muestra a 16.000 x g por 20 min a temperatura ambiente para que sedimenten las lipoproteínas con atención a la orientación del tubo. Las lipoproteínas forman una película delgada y blanca a lo largo de la pared exterior del tubo.
9. Lavar el pellet dos veces con acetona al 100%. Decantar la acetona y deje secar la muestra al aire.
10. Añadir 20-40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 o un estándar muestra Laemmli SDS-PAGE buffer¹⁶ y resuspender completamente mediante pipeteo arriba y abajo contra la pared con las lipoproteínas precipitadas. Raspar el lado del tubo con la punta de la pipeta para desalojar a las lipoproteínas.
    Nota: Las lipoproteínas no se disolverán en tampón Tris, pero más bien forman una suspensión.
    1. Almacenar las lipoproteínas a-20 ° C hasta su uso.

3. SDS-PAGE, Electroblotting y tinción con Ponceau S

1. Lipoproteínas separadas por SDS-PAGE utilizando métodos estándar de¹⁶.
   Nota: El porcentaje de acrilamida del gel adecuado variará dependiendo de su uso y tamaño de las lipoproteínas. Aquí, las lipoproteínas de E. faecalis fueron separadas sobre un 10% gel Tris glicina, mientras que un gel Tris-Tricina de 16.5% fue utilizado para la lipoproteína más pequeños de e. coli Lpp¹⁷.
2. Las lipoproteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa transferencia usando un procedimiento estándar de electroblotting.
   Nota: Una transferencia semiseco utilizando Bjerrum Nielsen Schafer buffer más 0,1% de SDS se realizó a 25 V, 1.3 mA por 15 min¹⁸. Alternativamente, membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno podría utilizarse, sin embargo es más hidrofóbica que la nitrocelulosa, puede reducir eficiente elución de lipopéptidos hidrofóbico de la membrana en pasos posteriores.
3. Transferir la membrana de nitrocelulosa a un recipiente y cubrir con solución de Ponceau S (0,2% (peso/volumen) Ponceau S en ácido acético al 5%). Rock suavemente durante 5 minutos o hasta que el rojo-rosa bandas son visibles.
4. Retirar la solución de Ponceau S y enjuague cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa con dH₂O para quitar exceso de la mancha.
   Nota: Vendas manchadas de Ponceau se desmanchar rápidamente. Si bandas desaparecen, repita el proceso de tinción.
5. Con una cuchilla de afeitar limpia, suprimir la banda deseada y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Lavar tres veces con 1 mL de dH₂O a desteñir totalmente la banda.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí. Tienda la sección suprimida cubiertos de agua a-20 ° C hasta su uso.
6. La sección de transferencia a una superficie limpia y con una cuchilla de afeitar limpia, dados la tira de nitrocelulosa en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm x 1 mm. recoger los pedazos en un tubo de microcentrífuga de 0.5-mL baja proteína vinculante.
7. Lave las piezas dos veces con 0,5 mL recién preparado de 50 mM de bicarbonato de amonio (NH₄HCO₃), pH 7.8 en agua de grado cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

4. tríptica digestión, extracción de bacterias de una membrana de nitrocelulosa, deposición en MALDI destino y adquisición de datos

1. Resuspender pedazos de nitrocelulosa en 20 μL de solución 20 μg/mL de tripsina en 50 mM NH₄HCO₃, pH 7.8 en agua de calidad HPLC. Vortex para mezclar, luego girar brevemente para asegurar que todas las piezas están completamente cubiertas por la solución de tripsina. Cubra la tapa del tubo usando la película de parafina para evitar la evaporación e incubar digest durante la noche a 37 ° C.
2. Hacer girar la muestra a 16.000 x g por 30 s y quitar el líquido mediante pipeteo.
   Nota: Esto elimina tripsinizaron péptidos hidrofílicos que pueden ser examinados más tarde por MS de MALDI-TOF para identificación de proteínas.
3. Añadir 50 μL de 0.5% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua de calidad HPLC. Vortex para mezclar, luego gire la muestra brevemente para asegurar que todas las piezas están cubiertas por la solución. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Retire el líquido mediante pipeteo.
   PRECAUCIÓN: TFA es dañino si se inhala. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.
4. Repita el paso 4.3 con 50 μL de 10% de acetonitrilo en agua de calidad HPLC.
   PRECAUCIÓN: Acetonitrilo es dañino si se inhala. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.
5. Repita el paso 4.3 con 50 μL de acetonitrilo 20% en agua de calidad HPLC.
   Nota: Esto elimina cualquier péptidos moderadamente hidrófobos ligadas a la nitrocelulosa.
6. Para eluir los lipopéptidos estrechamente enlazado, añadir 15 μL de 10 mg/mL recién hecho α-ciano-4-hidroxicinámico ácido (CHCA) matriz disuelto en Cloroformo-metanol (2:1, v/v) e incube durante 10 min a temperatura ambiente con un vórtex intermitente.
   1. Alternativamente, añadir 15 μL Cloroformo-metanol para eluir lipopéptidos y mezclar con la matriz en un momento posterior. Otras matrices, tales como el ácido 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB), deben ser probados como alternativas a la CHCA si se obtienen resultados satisfactorios para una composición particular de bacterias.
      PRECAUCIÓN: Cloroformo y metanol son dañinos si se inhalan. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.
   2. Opcional: Promover sodio formación de aducción, complementar la solución de CHCA en Cloroformo-metanol con acuoso bicarbonato de sodio (NaHCO₃) a una concentración final de 1 mM.
7. Hacer girar la muestra brevemente. Con una pipeta, transferir cuidadosamente el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga baja proteína vinculante. Esta solución contiene la mayor parte de los lipopéptidos de N-terminal.
   Nota: La nitrocelulosa puede disolver total o parcialmente en la solución de Cloroformo-metanol. Esto no afectarán negativamente los resultados de la MS y puede utilizarse como un método alternativo para aumentar el retorno de bacterias. Membrana PVDF no se disolverá en la misma forma.
8. Depositar 1 μL de los lipopéptidos eluídas con CHCA en un objetivo MALDI acero pulido.
   Nota: El Cloroformo-metanol se evaporará rápidamente, dejando atrás el cristalizadas CHCA y lipopéptidos. Una opcional segunda 1 μL alícuota puede ser depositado en el mismo lugar para aumentar la concentración de la muestra. Cloroformo-metanol puede extenderse significativamente después de la deposición sobre el objetivo y como tal, debe tener cuidado para evitar muestra de mezcla en el destino. Se recomienda depositar y disparar múltiples puntos de cada muestra.
9. Inmediatamente proceder a espectrometría de masas. Analizar todas las áreas del punto para señal de bacterias, especialmente si el terreno contiene dos capas de la muestra, como la segunda capa puede empujar los lipopéptidos al borde exterior de la mancha.
   Nota: Intensidad de láser inicial recomendada es 25%, aunque puede ser necesario aumentar la intensidad para adquirir señal y suma múltiples espectros (exploraciones de 20 o más) para lograr adecuada relación señal a ruido. Aquí, los espectros fueron adquiridos en un instrumento de MALDI-TOF-TOF (véase la Tabla de materiales) utilizando un método de instrumento configurado de fábrica para la detección de iones positivos del reflector en el rango de m/z de 700-3500. El instrumento fue calibrado con una mezcla de péptidos trípticos de albúmina de suero bovino (BSA).

Resultados

Un esquema del Protocolo se proporciona en la figura 1. La fracción enriquecida de lipoproteína extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 se muestra en la figura 2. Para la comparación, también se muestra el patrón de bandas de la fracción de proteína precipitada. Las proteínas de esta fracción fueron confirmadas por MALDI-MS a ser altamente abundantes proteínas distintas lipoproteínas (...

Discusión

El protocolo en el presente documento describe dos etapas distintas de la caracterización de la lipoproteína: determinación estructural y particionada por MALDI-TOF MS de la fase de enriquecimiento por TX-114. Durante TX-114 extracción, centrifugación adicional elimina proteínas contaminantes que precipitan durante este proceso, seguido por la precipitación de acetona para producir lipoproteínas muy enriquecidas. Limitando la magnitud de cada preparación valor 15 mL de las células, varias muestras pueden ser f?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser