化学共轭法在戊型肝炎病毒纳米粒子表面功能化中的应用

摘要

我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白作为 theranostic 纳米微粒 (HEVNP) 进行了设计。HEVNP 自组装成一个稳定的 icosahedral 笼在黏膜分娩。在这里, 我们描述了 HEVNPs 的改变的肿瘤靶向性的变异表面暴露残留到半胱氨酸, 共轭合成配体, 具体绑定肿瘤细胞。

摘要

病毒样粒子 (VLPs) 被用作 nanocarriers, 用于显示异物抗原和/或在各种疾病的检测和治疗中提供小分子。该应用依赖于基因修饰、自组装和半胱氨酸共轭来实现重组 VLPs 的肿瘤靶向应用. 与单基因修饰相比, 国外多肽对 VLPs 的化学共轭提供了一种很大的优势, 因为它允许多种实体, 如合成肽或寡糖, 以调制和灵活的方式共轭到 VLPs 表面, 而不改变 vip 组装。

在这里, 我们演示如何使用 E 型肝炎病毒纳米粒子 (HEVNP), 一个模块化的 theranostic 胶囊, 作为一个多功能运送载体。HEVNPs 的功能包括组织靶向、影像学和治疗性分娩。在 HEVNP 的结构研究基础上, 选取了结构上独立的和表面暴露的残留物作为 maleimide 连接化学基团的共轭点, 通过硫醇选择性的联系来选择半胱氨酸置换。一种特殊的半胱氨酸修饰 HEVNP (胱氨酸取代天门冬在 573 aa (HEVNP-573C)) 被共轭到乳腺癌细胞特异配体, LXY30 和标记为近红外线 (近红外) 荧光染料 (Cy5.5), 呈现肿瘤靶向HEVNPs 作为有效的诊断胶囊 (LXY30-HEVNP Cy5.5)。类似的工程策略可以与其他大分子复合物与众所周知的原子结构, 以探索潜在的应用 theranostic 交付。

引言

在治疗和诊断分娩中纳米载体的发展, 被称为 nanotheranostics, 已经把大部分生物医学领域从广义治疗转移到目标传递¹。靶向 nanotheranostic 交付将纳米载体 (纳米粒子) 与 theranostic 分子结合在一起, 稳定地直接 theranostic 分子到特定患病组织或生物化学途径^2,3,4.纳米医学已经走到了目标交付的前列, 因为最佳尺寸的纳米粒子有能力稳定 theranostic 分子的循环, 有选择地靶向细胞表面分子呈现在患病的组织上。许多 nanotheranostic 平台仍然遭受被动细胞吸收, 前成熟退化, 毒性和与 theranostic 分子不充分的联系。VLPs 克服了目标交付中的许多障碍。它们被用作 nanocarriers 来显示外来的表位和/或提供小分子: 一种可以用来对抗许多疾病的方案¹。该应用主要依赖于自组装的特性以及遗传修饰的方便性, 以满足给定 vip 的设计应用。与基因工程相比, 国外多肽对 vip 的化学共轭显示了一个重要的优势, 因为它允许多种实体, 如多肽或寡糖, 被共轭到 VLPs 的表面, 在调制和灵活的方式, 不改变贵宾大会。

HEVNPs, 来自重组的混合动力衣壳蛋白, 2^nd开放阅读框架 (ORF2), 是非传染性的, 自组装衣壳能够细胞结合和进入。由于混合动力汽车进化为黏膜传输, 组装的衣壳蛋白是同样稳定的水解和酸性粘膜条件⁵。HEVNPs 形成一个空心, T = 1 icosahedral 衣壳, 由60个相同的单位组成,^6,7 ORF2, 使其在储存和严酷的生理条件下高度稳定。由于缺乏任何病毒遗传元素, 通过昆虫细胞的杆状病毒表达系统实现了高效、高产的生产。由于其蛋白水解稳定性, 自组装 HEVNPs 提取和纯化的细胞上清, 大大减少必要的净化步骤。此外, HEVNPs 拥有一个表面暴露的凸出域 (P 域) 通过一个灵活的铰链连接到一个稳定的 icosahedral 基础。p 域在 icosahedral 基础上形成表面暴露的尖峰, 而柔性铰链使得在不损害基 icosahedral 结构的情况下可以显著地修改 P 域。与60个重复的单位, 单一站点特定的修改结果在60个对称站点的化学调制。最近, 我们提出了一个纳米平台使用 HEVNP, 可以化学共轭配体或小分子的 theranostic 应用。这是通过取代单一氨基酸与半胱氨酸的突出领域的混合动力-vip 作为一个反应地点与 maleimide 链接的肽或分子。基于以前对混合动力-vip 和研究良好的免疫表位^8,9的结构分析, 以下五个 hev-vip 氨基酸以半胱氨酸取代为潜在候选者: Y485C、T489C、S533C、N573C 和 T586C (图 1)。通过透射电镜 (TEM) 观察 (图 2) 对昆虫细胞的表达和纯化后的 vip 形成进行了验证, 并在 maleimide 链接生物素后对暴露的半胱氨酸部位进行了分析。共轭 (图 2)。在五变种人中, HEVNP-573C 显示了 maleimide-生物素共轭 (图 2) 的最强信号, 并被用来作为乳腺癌细胞靶向⁴ (图 3) nanocarrier 的后续演示。

该协议描述了化学共轭方法, 通过表面半胱氨酸共轭将肿瘤靶向分子附着在 HEVNPs 上。我们详细的肿瘤靶向和检测分子结合的肿瘤传递与重组 HEVNPs 含有半胱氨酸在 N573 (HEVNP-573C)。我们专注于两步点击化学共轭过程, 以绑定乳腺癌肿瘤靶向肽, LXY30¹⁰到 HEVNPs 形成 LXY30-HEVNP (图 4)。随后, n-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 被共轭到单独的赖氨酸站点在 HEVNPs 建立 LXY30 HEVNP-Cy5.5 为荧光检测的在体外(图 5) 和在体内⁴.

研究方案

1. 昆虫细胞的 HEVNP 生产

注意: 所有以下步骤都应在单元格培养罩中执行。有关更详细的 HEVNP 生产过程¹¹, 请参阅我们以前的出版物。

1. 在昆虫细胞介质中培养 Sf9 细胞 (参见材料表), 以 50-75% 汇流在6井板上。
2. 利用昆虫细胞转染试剂根据制造商的协议, 染 Bacmids 含有 HEVNP-573C ORF2 到 Sf99 细胞生产重组杆状病毒。根据细胞的生存能力, 在27摄氏度孵育转染细胞, 3-6 天。
3. 在感染后 3-6 天收集上清液 (转染后的细胞因杆状病毒感染裂解) 为 P0 杆状病毒。
4. 在25厘米²单层烧瓶中应用200µL P0 库存到 50-75% 汇合 Sf9 细胞之前, 移除培养基。每15分钟摇动烧瓶, 确保接种的全部覆盖。重复4次, 总共60分钟。
5. 添加2毫升的昆虫细胞培养培养基到烧瓶, 并保持在27摄氏度 3-6 天, 取决于细胞的生存能力, 放大杆状病毒, 以更高的效价。
6. 进行斑块化验以获得杆状病毒滴度阅读¹²。
7. 培养悬浮的 Tn5 昆虫细胞 (材料表) 与100毫升昆虫细胞媒介在250毫升瓶并且在27°c 在150转到一个滴度 0.5 x 10⁵ -1 x 10⁶为接种。
8. 添加杆状病毒在 5-10 到100毫升 Tn5 细胞在250毫升瓶中的多重感染 (语言)。接种后, 在27°c 以150转每分钟晃动 5-7 天。
9. 一旦大多数细胞出现囊泡, 70-90% 的细胞在光学显微镜观察下死亡, 收集 Tn5 细胞并转移到33毫升 ultracentrifuge 管。将 ultracentrifuge 管放在摆动斗转子中, 平衡, 并将细胞碎片和重组杆状在 1万 x g 处旋转90分钟, 达到25摄氏度。
10. 将含有释放 HEVNPs 的上清液保持在4摄氏度, 以进一步纯化。为进一步贮存杆状病毒上清, 添加蛋白酶抑制剂。

2. HEVNP 纯化

1. 用氯化铯 (中海) 梯度分离 HEVNPs 颗粒和分离:
   1. 转移收集到的上清 (从步骤 1.10), 并添加 20% NP-40 到每个管, 使最终浓度 0.5% NP-40, 以溶解任何剩余的细胞膜。轻轻地混合吹打和孵化至少30分钟在25摄氏度。
   2. Ultracentrifuge HEVNPs 在 112400 x g 在摆动的桶式转子为2小时在4°c 从上清的 HEVNPs 颗粒下来。离心后丢弃上清, 在每管200µL 10 毫米的 MES 缓冲 pH 值 6.2 (O/N) 在4摄氏度的情况下, 轻轻地重新悬浮原油颗粒。运行 SDS 页 (步骤 3.1) 以确认 ORF2 在粗颗粒中存在 HEVNP, 作为 52 kDa 带。
   3. 在6.2 毫升 ultracentrifuge 管中混合1.96 克中海, 再悬浮的粗球团, 4 毫升0.01 米的 MES pH 5, 准备 38.5% (w/v) 中海梯度。平衡管和地方在摆动斗转子。Ultracentrifuge 在 14.7万 x g 16 小时在4摄氏度。
2. 收集了中海梯度后的分数:
   1. 丢弃前500µL 分数, 这主要是轻量细胞膜碎片。收集500µL 分数, 从管的顶端开始, 并改变每个分数之间的提示。将每个分数放入编号/标记为1.5 毫升的管。
      注: 由于中海中高浓度, HEVNP ORF2 的存在, 不能通过运行 SDS 页凝胶来检测。中海中的每一个分数可以被删除或稀释通过遵循中海清洁程序。另外, 中海梯度可由 10-40% 蔗糖梯度¹³取代, 以避免中海中残留。
   2. 把每一个分数转移到一个5毫升 ultracentrifuge 管和稀释中海中与4.5 毫升10毫米 MES, pH 值6.2。平衡管和地方在摆动斗转子。Ultracentrifuge 在 14.7万 x g 2 小时, 在4°c, 以球团下来的 HEVNPs。
   3. 放弃上清, 并轻轻地重新悬浮在100µL 10 毫米 MES pH 6.2 在每管 HEVNPs。覆盖管, 以避免蒸发和孵化4摄氏度的 O/N。
   4. 使用分光光度计记录 A280 读数和 A260/A280 nm 比值。确定 ORF2 的近似浓度为:
      
      每个 ORF2 将包含1胱氨酸站点和1赖氨酸站点为化学共轭。
      注: HEVNP ORF2 的摩尔消光系数为 60280, 相当于1.019 毫克/毫升 x A280。这是如此接近 1:1, HEVNPs 的浓度 (在镁/毫升) 可以接近的 A280, 因此, ORF2 的浓度由上述方程式。例如, A280 读数为1的 HEVNP 将有1毫克/毫升的浓度, 相当于18.8 µM ORF2。
   5. 准备一个 SDS 页面。使用每个分数的6µL 样本来确定含有 53.3 kDa HEVNP ORF2 蛋白的分数 (步骤 3.1)。HEVNPs 应该被发现在分数 3-5, 与密度为 ~ 1.25 克/毫升。
   6. 通过 TEM 观察, 确定 HEVNPs 的存在和纯度。准备或稀释 HEVNP 样品到 0.5-2.0 毫克/毫升的 TEM。HEVNPs 以透射电镜显示为空 icosahedral 蛋白, 直径约 27 nm (图 2)。一些蛋白质污染物可能留在分数, 并将在 TEM 下观察 (步骤 3.2)。
3. 在透射电镜下存在杂质的情况下, 重复步骤 2.1.3 2.2.6, 以提高 HEVNPs 的纯度。
   注: 通过中海梯度的额外净化可能导致 HEVNPs 的产量损失。另外, 中海梯度纯化可以用 10-40% 蔗糖梯度代替, 以避免中海中的残留¹³。

3. HEVNP 特征

1. 准备 SDS 页4-12% 双三蛋白凝胶, 1.0 毫米, 17 井 (见材料表) 根据用户手册¹⁴:
   1. 添加2µL 4x 加载缓冲到6µL 蛋白质样品。将样品混合物在热块中孵育10分钟, 在100摄氏度变性蛋白质。将蛋白质样品装载到凝胶上。
   2. 通过将 DC 电源设置为10分钟, 然后 150 v 为45分钟, 运行 SDS 页面, 直到样品在凝胶底部的约1厘米处运行为止。
   3. 染色 SDS 页凝胶与考马斯蓝色 (0.25% (瓦特/v) 考马斯明亮的蓝色 R250, 30% (v/v) 甲醇, 10% (v/v) 乙酸), 1 h。
   4. 染色程序后, 去除考马斯蓝染色, 并应用去除染色缓冲器 (30% (v/v) 甲醇, 10% (v/v) 醋酸) 到蛋白质凝胶 > 12 小时室温。
   5. 在白光下记录下凝胶以确认在 52 kDa 带 HEVNP ORF2 的存在。
2. 用 TEM 观察 HEVNPs。
   1. 将 HEVNP 样品准备或稀释为 0.5-2 毫克/毫升, 10 毫米 MES pH 6.2 用于 TEM 成像。
   2. 电离 40 mA 辉光放电的碳涂层网格在三十年代生产一个亲水性的碳表面。辉光放电设备在材料表中描述。
      注: 在辉光放电处理后, 网格的亲水性碳表面只能持续30分钟。
   3. 按住镊子, 在网格中添加2µL 的 HEVNP 样品, 等待15三十年代, 并用滤纸涂抹。
   4. 立即用 ddH₂0 清洗网格, 然后用过滤纸涂抹。
   5. 立即在网格中加入2µL 2% 的醋酸铀, 等待十五年代, 然后用过滤纸涂抹。将样品栅格放在电子除湿干燥柜中, 使其干燥。
   6. 将网格转换成透射电镜和10-80k 放大图像。HEVNPs 出现在透射电镜作为空的 icosahedral 蛋白, 是27毫微米直径, 由于缺乏病毒 RNA。

4. HEVNPs 与生物素、肿瘤靶向配体、显影的化学共轭

1. 执行一步共轭 HEVNPs 和 maleimide 链接生物素。
   1. 缓冲变化: 根据制造商的协议 (材料表), 将 HEVNPs 在迷你透析单元和透析中应用于室温下的0.01 米 PBS pH 值为1小时。将 HEVNPs 转移到1.5 毫升管, 用分光光度计测量 280 nm 的蛋白质浓度。
   2. 将 HEVNP 混合到1毫克/毫升, 相当于18.8 µM 的胱氨酸反应站点 (参见步骤2.2.4 中的详细信息), 在0.01 米 PBS, pH 为 7.4, 以相等的 maleimide-生物素 (100 µM), 使1:5 摩尔比;反应4摄氏度。根据制造商的协议 (材料表), 删除未绑定 maleimide-生物素与 40 K 截留分子量自旋脱盐塔工艺。
   3. 通过标准的减少 SDS 页面 (步骤 3.1) 分析样品。
   4. 使用标准程序, 用酶联的链亲和素制备一种化学发光印迹。通过 x 射线胶片捕获化学发光信号 (图 2)。
2. 在混合动力核动力源上执行两步 LXY30 共轭到表面暴露的半胱氨酸 (图 5)。
   1. 缓冲交换: 应用 HEVNPs 在微型透析单位和透析对 0.01 M PBS pH 值7.4 在室温下为 1 h. 将 HEVNPs 转移到1.5 毫升管, 用分光光度计测定 280 nm 的蛋白质浓度。
   2. 添加650µM maleimide-叠氮化物和650µM alkyne-LXY30¹⁰在 0.01 M PBS pH 7.4 与200µM 丘索₄和1毫米抗坏血酸形成 maleimide 链接的 LXY30 (Mal-LXY30) 在650µM. 孵育混合物在4°c 为 O/N。
   3. 混合 HEVNP 到1毫克/毫升, 相当于18.8 µM 的胱氨酸反应站点 (见细节在步骤 2.2.4), 约10% 卷 Mal-LXY30 (650 µM) 在0.01 米 PBS pH 7.4, 使一个1:3 摩尔比率;反应4摄氏度。
      注: 由于 Mal-LXY30 浓度相对较高, 反应物的最终浓度 (如丘索₄) 在混合后减少约10倍, 以避免其对 HEVNPs 的损害。另一个选项是无铜共轭方法¹⁵。
   4. 根据制造商的协议删除未绑定 maleimide-click-LXY30 与 40 K 截留分子量自旋脱盐塔 (请参阅材料表)。保持 LXY30-linked HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 在4摄氏度。
3. 执行一步共轭 LXY30-HEVNPs 和 Cy5.5 nhs 酯 (nhs-Cy5.5)
   1. 混合 LXY30-linked HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 到1毫克/毫升, 这相当于胱氨酸反应站点的18.8 µM (参见步骤2.2.4 中的详细信息), 在0.01 米 PBS (100 Cy5.5) 的同等数量的 NHS-µM 的 pH 7.4, 使1:5 摩尔比率;反应4摄氏度。
   2. 根据制造商的协议, 删除未绑定 Cy5.5-NHS 与40K 截留分子量自旋脱盐塔程序 (请参阅材料表)。保持 LXY30, Cy5.5 链接 HEVNPs (LXY30 HEVNP Cy5.5) 在4摄氏度。

5. HEVNP 对 MDA-MB231 乳腺癌细胞的束缚和内化

1. 种子 MDA-MB231 乳腺癌细胞成一个35毫米的玻璃底部菜肴 (5 x 10⁴每碟) O/N 在哺乳动物细胞培养柜。
2. 对于细胞结合实验, 请按照步骤 4.2-4.3 准备 LXY30-HEVNP Cy5.5。稀释 LXY30-HEVNP-Cy5.5 0.01 毫克/毫升, 相当于 HEVNP ORF2 的0.188 µM (指步骤 2.2.4), 250 µL 0-1% 的血清/DMEM。
   1. 在0.01 毫克/毫升 HEVNP Cy5.5 的情况下, 按步骤 4.3, 但与 NHS-Cy5.5 染料共轭, (HEV-Cy5.5), 准备阴性对照样品。稀释 HEVNP-Cy5.5 到0.01 毫克/毫升, 相当于 HEVNP ORF2 的0.188 µM (指步骤 2.2.4), 250 µL 10% 的血清补充 DMEM。
3. 通过应用250µL 1 米 PBS 缓冲液, pH 值7.4 来清洗细胞。清洗后取出 PBS 缓冲器, 同时在细胞培养皿中保留一些缓冲液。
4. 应用250µL 的 LXY30-HEVNP Cy5.5 在10% 的血清补充 DMEM 或 HEVNP Cy5.5 在10% 的血清补充 DMEM 的培养 MDA-MB231 乳腺癌细胞。用铝箔保护细胞培养皿。
5. 将细胞培养皿保持在37摄氏度细胞培养柜内, 用于内部化1小时。
6. 在冰上冲洗培养的细胞3次, 每洗5分钟, 250 µL 1 米 PBS, pH 7.4。
7. 在1米 pbs 中固定4% 只粉煤灰中的细胞, ph 7.4 为20分钟, 然后用250µL 的1米 pbs, ph 7.4 清洗一次。
   注意: 细胞现在已经准备好被共聚焦显微镜成像。代表性数据显示在图 5中。

结果

类似于 HEV-VLPs, 所有胱氨酸改性 HEVNPs 形成可溶性 icosahedral 衣壳, 并没有聚集在溶液中的生产或纯化。在单步 maleimide-生物素共轭之前和之后, 每个胱氨酸修改后的 HEVNPs 在负染色 EM (图 2) 中都与混合动力 VLPs 不区分。Maleimide-生物素共轭效率胱氨酸改性 HEVNPs 首次测试与西方印迹通过化学发光链亲和素结合。继 maleimide-生物素共轭后, 胱氨酸修饰 HEVNPs 显...

讨论

与耗时的基因工程程序, 这通常需要几个星期, 在这里我们演示简单的两步和一步化学共轭程序, 可以在3天内完成, 增加癌症靶向配体和/或荧光检测染料到胱氨酸/赖氨酸 HEVNPs 的部位。该技术可用于筛选候选池中的最佳配体目标, 从而在合理的成本和交付时间内利用可用的肽/小分子合成服务。

不同于传统的基因工程, 它只能将多肽插入到感兴趣的蛋白质中, 化学共轭可以将各种...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger