الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

Summary

ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.

Abstract

جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة في الكشف والعلاج من الأمراض المختلفة. يعتمد هذا التطبيق على التحوير الوراثي، التجميع الذاتي وتصريف سيستين للوفاء بتطبيق استهداف الورم من المؤتلف فلبس. بالمقارنة مع الوراثية يقدم التعديل الاقتران وحدها، والمواد الكيميائية من الببتيدات الأجانب إلى فلبس كبير فائدة لأنه يسمح بمجموعة متنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات الاصطناعية أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس بطريقة مرنة والتضمين دون تغيير للجمعية عزام.

هنا، نحن توضح كيفية استخدام التهاب الكبد الوبائي ه فيروس نانوحبيبات (هيفنب)، كبسولة ثيرانوستيك نمطي، كناقل توصيل متعددة الوظائف. وتشمل مهام هيفنبس استهداف الأنسجة وتصوير وتقديم العلاج. استناداً إلى بحوث هيفنب الهيكلية الراسخة، اختيرت بقايا مستقلة هيكلياً والمعرضة للسطح لاستبدال سيستئين كمواقع التصريف لمجموعات كيميائية ترتبط ماليميدي عن طريق الروابط ثيول انتقائية. سيستين واحد بعينه-تعديل هيفنب (Cys استبدال الهليونين في 573 aa (هيفنب-573 ج)) كان مترافق للثدي سرطان خلية محددة يجند، LXY30 وتسميته بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الأسفار صبغ (Cy5.5)، التقديم الورم المستهدفة هيفنبس كبسولات التشخيصية الفعالة (LXY30-هيفنب-Cy5.5). يمكن أن تستخدم استراتيجيات هندسية مماثلة مع المجمعات الجزيئات الأخرى مع هياكل ذرية معروفة جيدا لاستكشاف تطبيقات محتملة في إيصال ثيرانوستيك.

Introduction

تطوير ناقلات نانو الحجم في إيصال التشخيصية والعلاجية، المعروفة باسم نانوثيرانوستيكس، حولت الكثير من ميدان الطب الحيوي بعيداً عن العلاجات معممة نحو التنفيذ الهادف¹. تسليم نانوثيرانوستيك المستهدفة يدمج ناقلات نانو الحجم (nanoparticles) مع جزيئات ثيرانوستيك ستابلي توجيه الجزيئات ثيرانوستيك إلى أنسجة مريضة محددة أو المسارات البيوكيميائية^2،3،4 . قد حان لطب النانوي في صدارة التنفيذ الهادف لأن جسيمات نانوية الحجم الأمثل لها القدرة على تحقيق استقرار الدورة الدموية لجزيئات ثيرانوستيك واستهداف جزيئات سطح الخلية المقدمة في الأنسجة المريضة بشكل انتقائي. لا تزال تعاني العديد من الأنظمة الأساسية نانوثيرانوستيك من امتصاص الخلية سلبية وتدهور ناضجة مسبقاً وسمية ورابطة غير كافية مع جزيئات ثيرانوستيك. فلبس التغلب على كثير من هذه العقبات في التنفيذ الهادف. فقد استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة: نظام التي يمكن استخدامها لمكافحة العديد من الأمراض¹. هذا التطبيق يعتمد أساسا على الخاصية التجميع الذاتي فضلا عن سهولة التعديلات الوراثية، لتحقيق التطبيق مصممة لعزام معطى. ومقارنة بالهندسة الوراثية، تصريف المواد الكيميائية من الببتيدات الأجنبية إلى عزام يعرض ميزة كبيرة لأنه يسمح بمجموعة كبيرة ومتنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس في التضمين و طريقة مرنة دون تغيير للجمعية عزام.

هيفنبس، المستمدة من البروتين قفيصه الهجينة المؤتلف، 2^nd فتح قراءة الإطار (ORF2)، وهي غير معدية، تجميع ذاتي كابسيدس قادرة على ربط الخلايا وإدخال. نظراً لتطور الهجينة لانتقال الغشاء المخاطي، المثل مستقرة في ظروف المخاطية proteolytic وحمضيه⁵البروتين قفيصه المجمعة. هيفنبس تشكل جوفاء، T = 1 قفيصه icosahedral، تتألف من وحدات متطابقة 60^6،7 من ORF2، جعلها مستقرة جداً سواء في التخزين وفي ظروف قاسية الفسيولوجية. تفتقر إلى أي عناصر جينية فيروسية، يتحقق إنتاج فعالة وعالية الغلة من خلال نظام التعبير باكولوفيروس في خلايا الحشرات. بسبب استقرارها proteolytic، تستخرج هيفنبس الذاتي تجميعها وتنقيته من المادة طافية الخلية، خفض إلى حد كبير خطوات التنقية اللازمة. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك هيفنبس نتوء مكشوفة سطح مجال (ف) متصلاً من خلال مفصل مرنة لقاعدة icosahedral مستقرة. المجال ف أشكال التموج المكشوفة السطح فوق قاعدة icosahedral بينما المفصل مرنة تجعل من الممكن تعديل المجال ف إلى حد كبير دون المساس بالهيكل الأساسي إيكوساهيدرال. مع الوحدات المتكررة 60، نتائج تعديل مواقع محددة واحدة في 60 موقعا متماثل للتحوير الكيميائي. في الآونة الأخيرة، وقد اقترحنا نانو-منصة استخدام هيفنب التي يمكن كيميائيا متزاوجة يغاندس أو الجزيئات الصغيرة للتطبيقات ثيرانوستيك. وتحقق ذلك باستبدال واحد من الأحماض الأمينية سيستين في مجال نتوء الهجينة-عزام كموقع رد فعل مع الببتيدات مرتبطة ماليميدي أو الجزيئات. استناداً إلى التحليل الهيكلي السابق عزام الهجينة ومدروسة مكسبه [ابيتوبس]^8،9استعيض الأحماض الأمينية الهجينة-عزام الخمسة التالية مع سيستئين كمرشحين محتملين: Y485C، T489C، S533C، N573C، و T586C ( الشكل 1). وأكدت بها تشكيلات عزام بعد التعبير وتنقية من خلايا الحشرات، انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) المراقبة (الشكل 2)، والمواقع سيستين المكشوفة التي تم تحليلها بواسطة الغربية لطخة بعد البيوتين مرتبطة ماليميدي الاقتران (الشكل 2). بين طفرات الخمسة، ج هيفنب-573 عرض أقوى إشارة من تصريف ماليميدي-البيوتين (الشكل 2)، وكان يستخدم لمتابعة مظاهرة ك nanocarrier لخلايا سرطان الثدي تستهدف⁴ (الشكل 3).

ويصور هذا البروتوكول أساليب تصريف المواد الكيميائية لإرفاق جزيئات استهداف الورم هيفنبس عن طريق التصريف السطحي سيستين. نحن بالتفصيل على تصريف الورم الاستهداف والكشف عن الجزيئات لإيصال الورم مع المؤتلف هيفنبس التي تحتوي على سيستين في N573 (هيفنب-573C). ركزنا على انقر فوق كيمياء اقتران عملية من خطوتين لربط ورم سرطان الثدي تستهدف الببتيد، LXY30¹⁰ إلى هيفنبس بشكل LXY30-هيفنب (الشكل 4). وفي وقت لاحق، N-هيدروكسيسوكسيميدي (NHS)-كانت مترافق Cy5.5 إلى موقع Lys منفصلة في هيفنبس لبناء LXY30-هيفنب-Cy5.5 لكشف فلوري على حد سواء في المختبر (الشكل 5) و المجراة في⁴.

Protocol

1-هيفنب الإنتاج في خلايا الحشرات

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية في غطاء ثقافة خلية. الرجوع إلى المنشور السابق لدينا لإنتاج هيفنب أكثر تفصيلاً الإجراءات¹¹.

1. ثقافة الخلايا Sf9 في وسائل الإعلام خلية الحشرات (انظر الجدول للمواد) لالتقاء 50-75% في لوحات 6-جيدا.
2. باستخدام الخلية الحشرات تعداء الكواشف طبقاً للبروتوكولات الشركة المصنعة، ترانسفيكت باكميدس التي تحتوي على ORF2 هيفنب-573 ج داخل الخلايا Sf99 لإنتاج باكولوفيروس المؤتلف. احتضان transfected الخلايا عند 27 درجة مئوية ل 3-6 أيام، اعتماداً على بقاء الخلايا.
3. جمع المادة طافية في الإصابة بعد 3-6 أيام (بعد أن يتم تفكيك الخلايا ترانسفيكتيد بسبب الإصابة باكولوفيروس) كمخزون باكولوفيروس P0.
4. إزالة الثقافة المتوسطة قبل تطبيق 200 ميليلتر من الأسهم P0 إلى الخلايا Sf9 المتلاقية 50-75% في قارورة أحادي الطبقة² سم 25. روك قارورة كل 15 دقيقة لضمان التغطية الكاملة للعدوى. كرر 4 مرات، لمدة 60 دقيقة.
5. إضافة 2 مل مستنبت الخلية الحشرات قارورة وتبقى عند 27 درجة مئوية لمدة 3-6، اعتماداً على بقاء الخلايا، تضخيم باكولوفيروس إلى عيار أعلى.
6. القيام بفحوصات اللوحة للحصول على عيار باكولوفيروس قراءة¹².
7. الثقافة علقت Tn5 الحشرات الخلايا (جدول المواد) مع 100 مل من خلايا الحشرات المتوسطة في قارورة 250 مل ويهز في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لعيار من 0.5 × 10⁵ -1 × 10⁶ للتطعيم.
8. إضافة باكولوفيروس في عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 5-10 إلى 100 مل Tn5 الخلايا في قارورة 250 مل. بعد التلقيح، هزة في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 أيام.
9. عندما يبدو أن معظم خلايا الحويصلات و 70-90% خلايا ميتة تحت المجهر الضوئي الملاحظة، جمع الخلايا Tn5 ونقل إلى أنابيب ultracentrifuge مل 33. المكان أولتراسينتريفوجي الأنابيب في يتأرجح الدوارات دلو، والتوازن، وتدور إلى أسفل الخلية تحت الأنقاض والمؤتلف باكولوفيروسيس في 10,000 س ز لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
10. الاحتفاظ بالمادة طافية يحتوي على هيفنبس صدر في 4 درجات مئوية لمزيد من التنقية. لتخزين ممتدة من باكولوفيروس طافية، إضافة مثبطات البروتياز.

2. تنقية هيفنب

1. بيليه، وعزل هيفنبس استخدام الفصل التدرج (CsCl) كلوريد السيزيوم:
   1. نقل المادة طافية المجمعة (من الخطوة 1، 10) وإضافة 20% NP-40 في كل أنبوب لجعل تركيز نهائي من 0.5% 40 NP بحل أي غشاء خلوي المتبقية. مزيج من بيبيتينج برفق واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 25 درجة مئوية.
   2. أولتراسينتريفوجي هيفنبس في 112,400 س ز في يتأرجح الدوارات دلو ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه أسفل هيفنبس من المادة طافية. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي ولطف إعادة تعليق بيليه الخام في ميليلتر 200 من 10 ملم مس المخزن المؤقت pH 6.2 في كل أنبوب بين عشية وضحاها (O/N) في 4 درجات مئوية. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة (الخطوة 3.1) للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في النفط الخام بيليه كعصابة كاتشين 52.
   3. إعداد تدرج CsCl 38.5% (w/v) بخلط ز 1.96 CsCl وبيليه الخام إعادة تعليق ~ 4 مل من 0.01 م مس 6.2 درجة الحموضة في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 16 عند 4 درجة مئوية.
2. جمع الكسور بعد CsCl التدرج:
   1. تجاهل الكسر ميليلتر 500 الأعلى، الذي هو أساسا غشاء الخلية خفيفة الوزن الحطام. جمع 500 ميليلتر الكسور، بدءاً من الجزء العلوي من الأنبوب، وتغيير نصائح الفترات الفاصلة بين كل جزء. وضع كل جزء في أنابيب مرقمة المسمى 1.5 مل.
      ملاحظة: وجود ORF2 هيفنب في الكسور يفصل CsCl التدرج لا يمكن الكشف عنها عن طريق تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الهلام بسبب التركيز العالي ل CsCl. يمكن إزالة أو تضعف باتباع إجراء تنظيف CsCl CsCl في كل جزء. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن التدرج CsCl 10-40% سكروز تدرج¹³ لتجنب CsCl المتبقية.
   2. نقل كل جزء في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل وتمييع CsCl مع مل 4.5 من 10 ملم مس، 6.2 درجة الحموضة. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه لأسفل هيفنبس.
   3. تجاهل المادة طافية ولطف إعادة تعليق هيفنبس في 100 ميليلتر من 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة في كل أنبوبة. وتغطي هذه الأنابيب تجنب التبخر واحتضان س/ن في 4 درجات مئوية.
   4. سجل A280 القراءة ونسبة نانومتر A260/A280 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تحديد تركيز ORF2 التقريبي:
      
      وسوف تحتوي على كل ORF2 1 Cys الموقع وموقع Lys لتصريف المواد الكيميائية.
      ملاحظة: هو معامل الانقراض المولى ORF2 هيفنب 60,280، وما يعادل 1.019 مغ/مل × A280. والسبب في ذلك ما يقرب من 1:1 التي يمكن تقريبها تركيز هيفنبس (في ملغ/مل) A280، ومن ثم تركيز ORF2 حسب المعادلة المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، سيتعين هيفنب مع أن قراءة A280 من 1 بتركيز 1 ملغ/مل، وما يعادل 18.8 مكم ORF2.
   5. إعداد صفحة بالحزب الديمقراطي الصربي. استخدام عينة ميليلتر 6 من كل جزء بسيط لتحديد الكسور التي تحتوي على 53.3 كاتشين ORF2 هيفنب البروتين (الخطوة 3.1). وينبغي إيجاد في هيفنبس في الكسور 3-5، مع كثافة ~1.25 غ/مل.
   6. التأكد من الوجود ونقاء هيفنبس تيم الملاحظة. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2.0 ملغ/مل لل. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral فارغة، ~ 27 نانومتر في القطر (الشكل 2). بعض الملوثات البروتين قد تبقى في الكسور، وسيتبع تحت تيم (الخطوة 3، 2).
3. في حالة أن الشوائب موجودة تحت TEM، كرر الخطوة 2.1.3-2.2.6 لنقاء أفضل من هيفنبس.
   ملاحظة: قد يسبب تنقية إضافية من خلال التدرج CsCl خسارة العائد من هيفنبس. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن تنقية CsCl التدرج تدرج سكروز 10-40% لتجنب المتبقية CsCl¹³.

3-هيفنب الوصف

1. إعداد صفحة الحزب الديمقراطي الصربي % 4-12 مكررا-تريس "البروتين الهلام"، 1.0 مم، 17-الآبار (انظر الجدول للمواد) وفقا لدليل المستخدم¹⁴:
   1. إضافة 2 ميليلتر من 4 × تحميل المخزن المؤقت إلى 6 ميكروليتر من عينة البروتين. احتضان المخلوط عينة في كتلة حرارة لمدة 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية تجريدها من البروتين. تحميل عينات البروتين على الهلام.
   2. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة بوضع العاصمة إمدادات الطاقة في 100 V مدة 10 دقيقة، ثم 150 الخامس لمدة 45 دقيقة حتى تشغيل العينات إلى حوالي 1 سم فوق الجزء السفلي من الجل.
   3. وصمة هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ الأزرق (0.25% (w/v) أخذ R250 الزرقاء الرائعة، الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v))، عن ح 1.
   4. بعد هذا الإجراء المصبوغة، إزالة وصمة عار أخذ الأزرق وتطبيق المصبوغة إزالة المخزن المؤقت (الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v)) على هلام بروتين > ح 12 في درجة حرارة الغرفة.
   5. الوثيقة الجل تحت الضوء الأبيض للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في الفرقة كاتشين 52.
2. مراقبة هيفنبس استخدام ال.
   1. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2 مغ/مل مع 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة لتصوير تيم.
   2. تتأين الشبكات المغلفة بالكربون مع 40 mA توهج التفريغ لمدة 30 ثانية لإنتاج الكربون ماء سطح. ويرد في الجدول للموادمعدات تفريغ الوهج.
      ملاحظة: على سطح الكربون ماء شبكات يمكن فقط آخر لمدة 30 دقيقة بعد توهج الاضطلاع بالعلاج.
   3. عقد في ملاقط وإضافة 2 ميليلتر من عينة هيفنب إلى الشبكة، انتظر 15-30 ثانية، ولطخة مع أوراق الترشيح.
   4. فورا غسل الشبكة مع ddH₂0 ووصمة عار مع أوراق الترشيح.
   5. فور إضافة 2 ميليلتر من خلات اليورانيل 2% إلى الشبكة، انتظر 15 ثانية، ثم وصمة عار مع أوراق الترشيح. الجافة الشبكات عينة بوضعها في إلكتروني تجفيف مجلس الوزراء الجافة س/أ.
   6. نقل الشبكة إلى تيم والصورة عند التكبير 10-80 ك. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral الفارغة التي هي ~ 27 نانومتر في القطر، ونظرا لعدم وجود الرنا الفيروسي.

4-الأسلحة الكيميائية تصريف هيفنبس مع البيوتين ويجند استهداف سرطان فلوروفوريس

1. إجراء اقتران خطوة واحدة هيفنبس وماليميدي المرتبطة البيوتين.
   1. المخزن المؤقت التغيير: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة ح 1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد). نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
   2. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر Cys رد فعل المواقع (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع مبلغ مساو من ماليميدي-البيوتين (100 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 متر، الرقم الهيدروجيني 7.4، جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية. إزالة البيوتين ماليميدي غير منضم مع إجراء ك 40 عمود Desalting موكو تدور وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد).
   3. تحليل العينات من خلال معيار الحد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.1).
   4. استخدام إجراءات معيارية، تعد من تشيميلومينيسسينت "الغربية لطخة" استخدام Streptavidin المرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية. التقاط الإشارات تشيميلومينيسسينت برأي X الفيلم (الشكل 2).
2. تنفيذ الخطوة اثنين الاقتران LXY30 إلى سيستين سطح مكشوف على "مصادر القدرة النووية الهجينة" (الشكل 5).
   1. المخزن المؤقت exchange: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد برنامج تلفزيوني 0.01 م الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة حاء 1 نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
   2. إضافة 650 مكم ماليميدي-أزيد و 650 ميكرومتر ألكاين-LXY30¹⁰ في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 مع 200 ميكرومتر CuSO₄ و 1 ملم حمض الأسكوربيك لتشكيل LXY30 المرتبطة ماليميدي (القانون النموذجي للتحكيم-LXY30) في 650 ميكرومتر. احتضان الخليط في 4 درجات مئوية عن س/أ.
   3. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر من موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع حوالي 10% حجم من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30 (650 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 M pH 7.4، جعل نسبة مولى 1:3؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: نظراً لتركيز عالية نسبيا من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30، تركيزات نهائية من كواشف مختبر، مثل CuSO₄، تقل حوالي 10 مرات بعد الاختلاط، لتفادي إلحاق الضرر بهم هيفنبس. خيار آخر هو أسلوب التصريف خالية من الاتحاد الجمركي¹⁵.
   4. إزالة غير منضم LXY30--ماليميدي--انقر فوق مع عمود "الدوران الملحي موكو ك" 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). تبقى هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) في 4 درجات مئوية.
3. إجراء اقتران خطوة واحدة من LXY30-هيفنبس واستر Cy5.5 دائرة الصحة الوطنية (نهس-Cy5.5)
   1. مزيج هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر في موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع تساوي حجم دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 (100 ميكرومتر) في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
   2. إزالة غير منضم Cy5.5--دائرة الصحة الوطنية مع إجراء عمود "الدوران الملحي موكو" ك 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). الحفاظ على LXY30، ترتبط Cy5.5 هيفنبس (LXY30-هيفنب-Cy5.5) في 4 درجات مئوية.

5-هيفنب ملزم والاستيعاب في خلايا سرطان الثدي نجمة داود الحمراء--MB231

1. خلايا سرطان الثدي MDA-MB231 البذور في كوب 35 ملم أسفل الأطباق (5 × 10⁴ كل طبق) س/ن في ثقافة خلية الثديية مجلس الوزراء.
2. لتجربة ربط الخلية، وإعداد LXY30-هيفنب-Cy5.5 بالخطوات التالية 4.2-4.3. تمييع LXY30-هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 0-1% FBS/دميم.
   1. إعداد نموذج التحكم السلبي في 0.01 ملغ/مل هيفنب-Cy5.5 خطوة بعد 4.3 لكن مترافق مع دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 صبغ فقط، (الهجينة-Cy5.5). تمييع هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 10% FBS تكملة مع دميم.
3. تغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تطبيق 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4. إزالة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني بعد الغسيل، مع الاحتفاظ ببعض المخزن المؤقت في الطبق ثقافة الخلية.
4. تطبيق 250 ميليلتر من LXY30-هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم أو هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم لخلايا سرطان الثدي MDA MB231 المستزرعة. درع الخلية مثقف الأطباق من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
5. تبقى الأطباق الخلايا المزروعة في ثقافة خلية 37 درجة مئوية مجلس الوزراء ح 1 لاستيعاب.
6. أغسل 3 مرات، 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي، مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 الخلايا المستزرعة على الجليد.
7. إصلاح الخلايا 4% في منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 20 دقيقة ويغسل ثم مرة واحدة مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4.
   ملاحظة: الخلايا جاهزة الآن تصويرها بالمجهر [كنفوكل]. وترد البيانات الممثلة في الشكل 5.

النتائج

أقرب إلى الهجينة-فلبس، Cys جميع تعديل كابسيدس هيفنبس شكل icosahedral القابلة للذوبان، والإجمالي لا في الحل أثناء الإنتاج أو تنقية. قبل وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين خطوة واحدة، كل من Cys تعديل هيفنبس تم تمييزه عن فلبس الهجينة في وصمة سلبية م (الشكل 2). ماليميدي-ا...

Discussion

على النقيض من الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً في مجال الهندسة الوراثية، التي عادة ما يستغرق أسابيع، هنا نظهر خطوتين بسيطة وإجراءات تصريف المواد الكيميائية خطوة واحدة، والتي يمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام، إضافة السرطان استهداف يجند و/أو الأسفار صبغ الكشف عن مواقع Cys/ليز هيفنبس. يمكن استخدام هذا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger