Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Özet

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Özet

Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP'ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP'ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.

Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP - 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.

Giriş

Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat¹doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol^{2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre} . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı dokuları üzerinde sunulan Nanomedicine hedeflenen teslimat ön plana geldi. Birçok nanotheranostic platformlar hala pasif hücre alımı, ön-olgun bozulması, toksisite ve yetersiz Derneği theranostic molekülleri ile muzdarip. VIP birçok hedeflenen teslimat bu engelleri aşmak. Bunlar nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya küçük moleküller teslim için kullanılmıştır: birçok hastalıkları¹mücadele için kullanılan bir rejimi. Bu uygulama ağırlıklı olarak mülkiyeti üzerinde dayanır kendinden montajlı yanı sıra verilen VIP için tasarlanmış uygulama yerine getirmek için genetik değişiklikler kolaylığı. Genetik mühendisliği için karşılaştırıldığında, VIP için yabancı peptidler kimyasal konjugasyon varlıklar, peptidler veya VIP yüzeyine içinde bir modüle Birleşik oligosakkaritler, gibi çok çeşitli izin verdiği için önemli bir avantaj görüntüler ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan.

HEVNPs, rekombinant HEV kapsid protein, 2^nd açık türetilen çerçeve (ORF2) okuma, bulaşıcı olmayan, kendi kendine capsids giriş ve hücre-bağlama verebilir montaj. HEV Mukozal iletimi için evrim çünkü monte kapsid protein proteolitik ve asidik Mukozal koşulları⁵' te aynı şekilde stabil. HEVNPs içi boş, T şeklinde depolama ve hem de sert fizyolojik koşulları son derece kararlı işleme oluşan 60 aynı birim^6,7 , ORF2, / 1 icosahedral kapsid, =. Herhangi bir virüs genetik öğe eksik, verimli, yüksek verim üretim baculovirus ifade sistem böcek hücrelerinde yoluyla elde edilir. Onların proteolitik istikrar nedeniyle, kendi kendine monte HEVNPs çıkarılan ve süpernatant cep gerekli arıtma adımları önemli ölçüde azaltarak saf. Ayrıca, HEVNPs kararlı bir icosahedral üs için esnek bir menteşe ile bağlı bir yüzey maruz çıkıntı etki (P) sahip. Esnek menteşe, önemli temel icosahedral yapısı ödün vermeden P etki alanı değiştirmek olanak verir iken yüzey maruz sivri icosahedral Bankası üstüne P etki alanı oluşturur. 60 tekrarlanan birimleri ile kimyasal modülasyon için 60 simetrik siteleri tek siteye özgü değişiklik sonuçlanır. Son zamanlarda, bir nano-platform önerilen kimyasal ligandlar veya theranostic uygulamalar için küçük moleküller eşlenik HEVNP kullanarak. Bu tek bir amino asit ile sistein HEV-VIP çıkıntı etki tepki site maleimide bağlı peptidler veya molekül ile değiştirerek sağlanır. HEV-VIP ve iyi okudu immünojenik epitopları^8,9önceki yapısal çözümleme bağlı olarak, aşağıdaki beş HEV-VIP amino asitler olarak potansiyel adaylar sistein ile değiştirildi: Y485C, T489C, S533C, N573C ve T586C ( Şekil 1). İfade ve arıtma böcek hücrelerden sonra onların VIP oluşumları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gözlem (Şekil 2) tarafından teyit edildi ve maruz sistein siteleri Western tarafından analiz edildi leke maleimide bağlı biotin sonra fiil (Şekil 2). Beş mutantlar arasında HEVNP - 573C maleimide-biotin konjugasyon (Şekil 2) en güçlü sinyal göstermek ve nanocarrier meme kanser hücresi⁴ (şekil 3) hedefleme için gücümüzü izleme için kullanıldı.

Bu iletişim kuralı tümör hedefleme molekülleri HEVNPs için yüzey sistein konjugasyon eklemek için kimyasal konjugasyon yöntemleri gösterilmektedir. Rekombinant HEVNPs içeren N573 adlı bir sistein ile tümör hedefleme ve algılama molekülleri'tümör dır konjugasyon detay (HEVNP - 573C). Peptid, forma LXY30-HEVNP (şekil 4) LXY30¹⁰ HEVNPs için hedefleme meme kanser tümörü bağlamak için bir tıklama kimya konjugasyon işlemdir üzerinde duruldu. Daha sonra N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 LXY30-HEVNP-Cy5.5 floresan algılama için her iki vitro (şekil 5) oluşturmak için HEVNPs ayrı Lys ücreti için Birleşik ve içinde vivo⁴.

Protokol

1. HEVNP üretim böcek hücrelerinde

Not: Tüm aşağıdaki adımları bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bizim önceki yayın için daha ayrıntılı HEVNP üretim işlemleri¹¹bakın.

1. Kültür Sf9 böcek hücrelerinde ( Tablo malzemelerigörmek) Medya 50-%75 izdiham içinde 6-şey plakaları için hücre.
2. Böcek hücre transfection reaktifler göre üreticinin iletişim kurallarını kullanarak, rekombinant baculovirus üretmek için Bacmids HEVNP - 573C ORF2 Sf99 hücrelere içeren transfect. 27 ° C'de transfected hücreleri hücre canlılığı bağlı olarak 3-6 gün kuluçkaya.
3. (Transfected hücre baculovirus enfeksiyon nedeniyle lysed sonra), 3-6 gün sonrası enfeksiyon süpernatant P0 baculovirus stok olarak toplamak.
4. Kültür orta % 50-75 Konfluent Sf9 hücrelerde bir 25 cm² monolayer şişesi 200 µL P0 stokunun uygulamadan önce kaldırın. Şişeye her 15dk inoculum tam kapsama sağlamak için rock. 4 kez, toplamda 60 dk için yineleyin.
5. Böcek hücre kültür orta 2 mL şişe için ekleyin ve canlılığı hücre baculovirus için daha yüksek bir titresi yükseltmek için bağlı olarak 3-6 gün için 27 ° C'de tutun.
6. ¹²okuma baculovirus titresi elde etmek için plak deneyleri taşımak.
7. Böcek cep orta 250 mL şişe 100 mL ile askıya alınmış Tn5 böcek hücreleri (Tablo reçetesi) kültür ve 150 devirde titresi 0.5 x 10 için 27 ° C'de sallamak⁵ - aşılama için 1 x 10⁶ .
8. Baculovirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, 5-10-100 mL Tn5 hücrelerinin bir 250 mL şişe ekleyin. Aşı sonra 150 rpm'de 27 ° C'de 5-7 gün için salla.
9. Bir kez en hücreleri veziküller sahip gibi görünmesine ve hücrelerin % 70-90 optik mikroskop gözlem altında ölü, Tn5 hücreleri toplamak ve 33 mL ultracentrifuge tüpler içine aktarmak. 10.000 x g için 25 ° C'de 90 dk de kova rotor, denge ve hücre artıkları ve rekombinant baculoviruses aşağı spin sallanan içinde yer ultracentrifuge tüpler
10. Daha fazla arıtma 4 ° C'de yayımlanan HEVNPs içeren süpernatant tutun. Baculovirus süpernatant genişletilmiş depolama için proteaz inhibitörleri ekleyin.

2. HEVNP arıtma

1. Cips ve sezyum klorür (CsCl) degrade ayrımı yöntemi kullanılarak HEVNPs izole:
   1. Toplanan süpernatant nakletmek (adımından 1,10) ve % 20 eklemek NP-%40 0,5 son bir konsantrasyon yapmak her tüpün içine geri kalan herhangi bir hücresel membran çözülmeye NP-40. Yavaşça pipetting tarafından mix ve en az 30 dk. 25 ° C'de için kuluçkaya
   2. Ultracentrifuge HEVNPs süpernatant üzerinden aşağı cips için kova rotorlar için 2 h 4 ° C'de sallanan içinde 112,400 x g de HEVNPs. Süpernatant Santrifüjü sonra atmak ve yavaşça ham Pelet 200 µL her tüp gecede 10 mM MES tampon pH 6.2 (O/N) 4 ° C'de yeniden askıya yılında SDS-52 kDa grup olarak ham Pelet içinde HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için sayfayı (Adım 3.1) çalıştırın.
   3. % 38.5 (w/v) CsCl degrade karıştırma 1.96 g CsCl, yeniden askıya alınmış ham Pelet ve ~ 4 mL 5 mL ultracentrifuge tüp içinde 0.01 M MES pH 6.2 hazırlayın. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de 16 h için de
2. Kesirler CsCl degrade sonra toplamak:
   1. Öncelikle hafif hücre zarı enkaz olan en iyi 500 µL kesir, atın. Tüp, en baştan başlayarak 500 µL kesirleri toplamak ve ipuçları her kesir arasında değiştirin. Her kesir numaralı/etiketli 1,5 mL tüpler içine yerleştirin.
      Not: Varlığı HEVNP ORF2 kesirler degrade jelleri CsCl yüksek konsantrasyon nedeniyle SDS sayfa çalıştırarak tespit edilemez CsCl ayrılmış. CsCl her kesir kaldırılabilir veya CsCl temizlik yordamı izleyerek seyreltilmiş. Alternatif olarak, CsCl gradyan CsCl arta kalan önlemek için bir 10-%40 Sükroz degrade¹³ tarafından değiştirilebilir.
   2. 5 mL ultracentrifuge tüp her kesir aktarmak ve CsCl ile 4.5 mL 10 mm MES, pH 6.2 oranında seyreltin. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de HEVNPs cips için 2 h için de.
   3. Süpernatant atın ve yavaşça HEVNPs 10 mM MES pH 6.2 her tüp 100 µL yeniden askıya. Tüpler buharlaşma önlemek ve O/N 4 ° C'de kuluçkaya kapak
   4. A280 okuma ve A260/A280 nm oranı bir Spektrofotometre kullanarak kaydedin. ORF2 yaklaşık konsantrasyonu belirlemek:
      
      Her ORF2 1 Cys ve kimyasal konjugasyon için 1 Lys siteleri içerir.
      Not: 1.019 mg/mL × A280 eşdeğer olan 60,280, HEVNP ORF2 molar tükenme katsayısı dür. 1:1 yakın bu böyledir bu HEVNPs konsantrasyon (mg/mL içinde) A280 ve bu nedenle, ORF2 konsantrasyon yukarıdaki denklem tarafından yaklaşık. Örneğin, bir HEVNP bir A280 okuma 1 ile 1 mg/mL, 18.8 µM için eşdeğeri olan bir konsantrasyon olacaktır ORF2.
   5. SDS-sayfa hazırlamak. Her kesir 6 µL örnekten 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (Adım 3.1) içeren kesirleri belirlemek için kullanın. HEVNPs kesirler 3-5, yoğunluklu olarak ~1.25 g/mL bulundu.
   6. Varlığı ve HEVNPs saflık TEM gözlem tarafından onaylayın. Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2.0 mg/mL TEM için sulandırmak. HEVNPs boş icosahedral proteinleri olarak ~ 27 TEM içinde görünür nm çapında (Şekil 2). Bazı protein kirletici kesirler içinde kalabilir ve TEM (Adım 3.2) altında gözlenir.
3. Yabancı maddelerin TEM altında mevcut durumda 2.1.3 - 2.2.6 daha iyi HEVNPs saflığı için adımları yineleyin.
   Not: Ekstra arıtma CsCl gradyan ile HEVNPs verim kaybına neden olabilir. Alternatif olarak, CsCl degrade arıtma arta kalan CsCl¹³önlemek için % 10-40 Sükroz degrade tarafından değiştirilebilir.

3. HEVNP karakterizasyonu

1. SDS sayfa 4-%12 Bis-Tris Protein jelleri, 1.0 mm, kullanıcının el ile¹⁴göre 17-wells ( Tablo malzemelerigörmek) hazırlayın:
   1. 4 x 6 µL protein örneği arabelleğe yükleme 2 µL ekleyin. Örnek karışımı bir ısı blok 100 ° C'de protein denatüre için 10 dakika içinde kuluçkaya. Protein örnekleri jel üzerine yükleyin.
   2. SDS-sayfa 100 V 10 dk, 1 cm alt jel yukarıda örneklerini çalıştırma kadar 45 dk sonra 150 V DC güç kaynağı ayarlayarak çalıştırın.
   3. Leke SDS sayfa jel Coomassie mavi (% 0.25 (w/v) Coomassie parlak mavi R250, %30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit), 1 h için.
   4. Sonra boyama yordam Coomassie mavi leke kaldırmak ve uygulamak için protein jel üzerine de-boyama arabellek (%30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit) > oda sıcaklığında 12 h.
   5. Jel 52 kDa band, HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için beyaz ışık altında belge.
2. TEM kullanarak HEVNPs gözlemlemek.
   1. Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2 mg/mL ile TEM görüntüleme için 10 mM MES pH 6.2 oranında seyreltin.
   2. 40 mA kızdırma deşarj için 30 ile karbon kaplı Izgaralar iyonize hidrofilik karbon yüzey üretmek için s. Kızdırma boşaltma ekipmanları Malzemeleri tabloaçıklanmıştır.
      Not: Kılavuzlar hidrofilik karbon yüzeyinde sadece son 30 dakika sonra parlaklık için tedavi akıntı.
   3. Cımbız içinde tutun ve HEVNP örnek 2 µL tasarım kılavuzuna ekleyin, 15-30 s için bekleyin ve filtre kağıdı ile leke.
   4. Hemen GKD₂0 kılavuzla ve leke filtre kağıdı ile yıkayın.
   5. Hemen kılavuz, bekle 15 s sonra leke filtre kağıdı ile 2 µL % 2 uranyl asetat ekleyin. Kuru bir elektronik koyarak onları örnek Izgaralar kuru kabine O/n için Ceketinizi
   6. Izgarayı TEM ve resim 10-80 k büyütmede içine aktarın. HEVNPs ~ 27 çoğu boş icosahedral proteinleri olarak TEM içinde görünür nm çapında, viral RNA yokluğu nedeniyle.

4. kimyasal konjugasyon Biotin, kanser hedefleme Ligand ve Fluorophores ile HEVNPs

1. HEVNPs ve maleimide bağlı biotin bir adım konjugasyon gerçekleştirin.
   1. Tampon Değiştir: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 1 h için oda sıcaklığında karşı diyaliz. HEVNPs 1.5 mL tüpler için aktarmak ve protein konsantrasyonu 280 ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.
   2. (Bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) Cys tepki siteleri, maleimide-biotin (100 µM) 1:5 molar oranı yapmak için 0,01 M PBS, pH 7.4, eşit miktarda 18.8 µM eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP karıştırın; O/N 4 ° C'de tepki İlişkisiz maleimide-biotin üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 40 K MWCO Spin Desalting sütun yordamı ile kaldırın.
   3. SDS-sayfa (Adım 3.1) küçültme bir standart ile örnekleri analiz.
   4. Standart prosedürler kullanarak, HRP bağlantılı Streptavidin kullanarak leke, chemiluminescent bir Western hazırlayın. Chemiluminescent sinyal tarafından X ray film (Şekil 2) yakalama.
2. İki adım LXY30 konjugasyon yüzey maruz sistein HEV NPs (şekil 5) gerçekleştirin.
   1. Arabellek Satım: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 oda sıcaklığında 1 h. 1,5 mL tüpler HEVNPs aktarmak için karşı diyaliz ve ölçmek protein konsantrasyonu 280 nm bir Spektrofotometre kullanarak.
   2. 0,01 M PBS pH 7.4 200 µM CuSO₄ ve 1 mM askorbik maleimide bağlı LXY30 oluşturmak için asit ile 650 µM maleimide-azid ve 650 µM ALKİN-LXY30¹⁰ ekleyin (Mal-LXY30) kuluçkaya 650 µM. 4 ° C'de karışımı O/n için
   3. Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) yaklaşık % 10 ile Mal-LXY30 hacmi (650 µM) 1:3 molar oranı; yapmak için 0,01 M PBS pH 7.4, içinde O/N 4 ° C'de tepki
      Not: Mal-LXY30 nispeten yüksek konsantrasyon nedeniyle, 10 kat, onların zarar HEVNPs görmesini önlemek için karıştırma sonra Reaktanları CuSO₄gibi son konsantrasyonları azaltılır. Başka bir seçenek Cu-Alerjik konjugasyon yöntemi¹⁵' tir.
   4. Kaldır bağlantısı çözülmüş maleimide-tıklayın-LXY30 bir sütunla 40 K MWCO Spin Desalting üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) tutmak
3. LXY30-HEVNPs ve Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5) bir adım konjugasyon gerçekleştirmek
   1. Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) NHS-Cy5.5 eşit hacmi ile (100 µM) 0.01 M PBS pH 7.4 1:5 molar oranı; yapmak içinde O/N 4 ° C'de tepki
   2. Kaldır bağlantısı çözülmüş Cy5.5-NHS bir 40K Spin MWCO Desalting sütun yordamını üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). LXY30, Cy5.5 bağlı HEVNPs 4 ° C'de (LXY30-HEVNP-Cy5.5) tutmak

5. HEVNP bağlama ve MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içselleştirilmesi

1. Tohum MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içine bir 35 mm cam alt yemekleri (5 x 10⁴ tabak başı) O/N kabine bir memeli hücre kültüründe.
2. Hücre bağlama deneme için LXY30-HEVNP-Cy5.5 tarafından aşağıdaki adımları 4.2-4.3 hazırlayın. LXY30-HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), 0 - 250 µL içinde % 1 FBS/DMEM.
   1. Negatif kontrol örneği 0.01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 adımı uygulayarak 4.3 konjuge NHS-Cy5.5 boya sadece, (HEV-Cy5.5) ama'hazırlayın. HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), %250 10 µL içinde FBS DMEM ile desteklenmiştir.
3. Hücreleri bir kez 1 M PBS tamponunun pH 7.4 250 µL uygulayarak yıkayın. Hücre kültür tabak içinde bazı arabellek tutarken yıkama sonra PBS arabellek kaldırın.
4. LXY30-HEVNP-Cy5.5 250 µL % 10 FBS FBS kültürlü MDA-MB231 meme kanseri hücreleri için DMEM ile birlikte % 10 DMEM veya HEVNP-Cy5.5 ile desteklenmiş uygulanır. Kalkan hücre ışık alüminyum folyo ile gelen yemekler kültürlü.
5. Kültürlü hücre yemekleri bir 37 ° C hücre kültüründe içselleştirilmesi için 1 h için kabine tutun.
6. Buz kültürlü hücrelerdeyse 3 kez, yıkama, 1 M PBS, pH 7.4 250 µL ile başına 5 dk yıkayın.
7. % 4 hücreleri tamir PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 min ve o zaman yıkama için 1 M PBS, pH 7.4 250 µL hemen ile içinde.
   Not: Hücreleri tarafından confocal mikroskop yansıması hazırsınız. Temsilcisi veri şekil 5' te gösterilmektedir.

Sonuçlar

HEV-VIP, benzer tüm Cys oluşan HEVNPs çözünür icosahedral capsids değiştirilebilir ve çözümde üretim veya arıtma sırasında toplam değil. Önce ve sonra tek adım maleimide-biotin konjügasyon, her biri Cys modifiye HEVNPs HEV-VIP negatif leke EM (Şekil 2) içinde ayırdedilemez. Maleimide-biotin konjugasyon verimliliği Cys değiştirilmiş HEVNPs ilk Batı chemiluminescent streptavidin bağlama yoluyla kurutma ile test edildi. Maleimide-biot...

Tartışmalar

Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.

Geleneksel genetik han...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger