用荧光标记示踪剂对小鼠血脑屏障通透性的体内检测

摘要

在这里, 我们提出了一个小鼠脑血管通透性检测, 采用腹腔注射荧光示踪剂后灌注, 适用于动物模型的血脑屏障功能障碍。一个半脑用于定量评估渗透性, 另一个用于示踪器可视化/染色。10只老鼠的手术过程需要 5-6 小时。

摘要

血脑屏障 (BBB) 是一种专门的屏障, 保护大脑微环境的毒素和病原体在循环和保持大脑稳态。屏障的主要部位是脑毛细血管内皮细胞, 其屏障功能来自于细胞膜上表达的紧密细胞间结和外排转运体。这个功能是由毛细血管和星形胶质细胞组成的神经血管单元 (NVU) 调节。一些神经系统疾病, 如中风, 阿尔茨海默病 (AD), 脑肿瘤与受损的 BBB 功能。因此, 评估脑屏障通透性对于评估神经系统疾病的严重性和所采用的治疗策略的成功至关重要。

我们提出了一个简单而稳健的渗透试验, 已成功地应用于几个小鼠模型, 遗传和实验。该方法与常用的示踪荧光分析法相比, 具有较高的定量和客观性。在这种方法中, 小鼠被注射腹腔的混合水惰性荧光示踪剂后麻醉小鼠。动物的心脏灌注是在收割大脑、肾脏或其他器官之前进行的。器官是均匀的和离心的, 其次是荧光测量从上清。在灌注前从心脏穿刺中提取的血液为规范化目的的血管室。组织荧光对湿重和血清荧光进行规范化, 获得定量示踪剂通透性指数。为进一步确认, 对侧半脑保存的免疫组化可用于示踪荧光显示的目的。

引言

血脑屏障 (BBB) 由紧密相关的毛细血管 (pc) 支持的微血管内皮细胞 (ECs) 组成, 它们是基底叶片中的 ensheathed, 而星形胶质细胞 (ACs) 将基底膜包裹在其端脚上^{1 ,2}。ECs 与支持和调节屏障功能的几种细胞类型相互作用, 主要是 ACs 和 pc, 以及神经元和小胶质, 它们共同构成神经血管单元 (NVU)。NVU 对脑屏障功能至关重要, 它限制了血液传播毒素和病原体进入大脑的传输。这一功能是紧密连接分子, 如 claudin-5, occludin, 拼装 occludens-1, 这是存在之间的, 也由于转运体, 如 p-糖蛋白 (p gp) 的作用, 外流分子进入内皮回到容器流明^1,2,3。然而, 在 EC 等离子膜^1,2,3上表达的特定运输者, 血脑屏障允许运输必要的分子, 如营养素 (葡萄糖, 铁, 氨基酸)。欧共体层是高度极化的在不同的运输载体之间的分布 (血面) 和 abluminal (脑面膜), 以允许特定和向量传输函数^4,5.虽然脑屏障在严密调节中枢神经系统环境方面是有保护作用的, 但对于中枢神经系统药物在帕金森氏症和功能性脑屏障等疾病中的传递来说, 这是一个重大挑战。即使在神经疾病的脑屏障功能障碍, 它不能假设, 大脑药物传递是增加特别是因为屏障功能障碍可能包括损害特定的运输目标, 例如阿尔茨海默病 (AD)。在 AD 中, 一些淀粉样β转运体, 如 LRP1, 愤怒, P gp 被称为失调, 因此针对这些转运可能是徒劳的^6,7,8。脑屏障损伤在一些神经疾病, 如中风, AD, 脑膜炎, 多发性硬化症, 并在脑瘤^9,10,11。恢复屏障功能是治疗策略的重要组成部分, 因此其评估是至关重要的。

在这项工作中, 我们已经描述了一个目标和定量协议的渗透率检测啮齿目动物, 我们成功地应用到几个鼠标线的转基因和实验性疾病模型^{10,12,13 ,14}。该方法是建立在简单的腹腔注射荧光示踪剂的基础上, 然后通过灌注小鼠来去除血管腔内的示踪物。脑和其他器官被收集后灌注和渗透率评估的客观和绝对渗透指数的基础上的荧光测量组织组织匀浆在一个板块阅读器。所有原始的荧光值都是用组织组织匀浆或不接受任何示踪的假动物的血清来矫正的。大量的标准化包括在血清体积, 血清荧光和组织的重量, 从而产生的通透性指数是绝对的和可比的实验和组织类型。为了便于组之间的比较, 绝对渗透率索引值可以很容易地转换为比我们以前执行的¹²。同时, 储存的半脑和肾脏可用于示踪剂可视化的荧光显微术¹⁰。经典荧光显微术对获得区域通透性的差异有很高的价值, 尽管由于对组织切片和图像的主观选择进行了半定量的分析。详细步骤载于协议中, 并酌情添加注释。这为在小鼠中成功执行体内通透性检测提供了必要的信息, 可以将其扩展到其他小动物身上。该方法可应用于多种示踪剂, 通过与不同荧光光谱的示踪物相结合进行电荷和尺寸的渗透率评估。

研究方案

在手术过程中, 所有动物都非常小心的处理, 尽量减少疼痛或不适。本程序遵循本机构的动物保育准则, 并经当地委员会批准 (Regierungspraesidium 达姆施塔特, 批准号 FK/1044)。

图 1显示了鼠标中体内渗透性检测的工作步骤示意图。每个步骤的详细信息如下所述。

1. 动物搬运

1. 示踪剂和麻醉剂的制备与管理
   1. 在渗透率测定前至少一天为组织嵌入的标记管和模具准备。在清洁通风罩下工作, 使用80% 乙醇清洗的工具, 在整个协议中保持无菌状态。使用雄性或雌性野生型 (Ang-2) 或 angiopoietin-2 (GOF) CD1 小鼠在成熟的成年年龄组3-6 月为当前协议。按照前面描述的¹⁰对小鼠进行基因分型。
      注: 80% 酒精不会导致无菌器械, 但会减少所制备样品的污染。
   2. 将无菌 PBS 中的所有示踪剂稀释成2毫米的股票, 并将保护的整除数保存在-20 摄氏度。
   3. 选择示踪剂, 如 (四甲基罗丹明) 和 (异硫氰酸荧光素) FITC 具有不同的激发/发射光谱, 是赖氨酸可以修复, 导致在染料之间的最小干扰, 荧光显微镜 (使用FITC 过滤器) 和通过荧光法在平板阅读器中进行渗透率测定。
      注: 葡聚糖 3 kd 和 FITC 葡聚糖 3 kd 在研究中都是赖氨酸可修复的, 因此也可以用于固定化醛后的免疫组化分析, 以调查区域差异。
   4. 遵循机构护理指南, 尽最大的努力处理所有动物。在1:1 混合^10、13中使用每个跟踪器的100µL 组合时, 用100µL 示踪解决方案注入腹腔每个鼠标, 可增加多达200µL。注射至少一个动物与 PBS 单独而不是示踪剂, 作为假的控制自体荧光背景减法。
   5. 5分钟后示踪剂注射, 麻醉动物与 i. p 注射液氯胺酮和甲苯噻嗪 (100 毫克和5-10 毫克在0.9% 生理盐水每公斤体重分别, 150 µL 的鸡尾酒每25克鼠标)。
      注: 在手术过程中, 由于动物麻醉和灌注/牺牲之间的时间短暂 (10 分钟), 没有观察到任何干燥的眼睛, 兽医软膏没有在眼睛上应用。
2. 血液采集与心脏灌注
   1. 麻醉后为心脏灌注10分钟准备动物。检查没有爪子抽搐反应, 以确保动物达到手术平面的麻醉。
   2. 将动物放在背上, 在腹部皮肤上涂抹80% 乙醇。使用小剪刀, 打开腹壁与小切口 (2 厘米) 刚刚下方的肋骨笼。分开肝脏从膜片然后慢慢地切开通过膜片暴露胸膜腔¹⁵。
   3. 将肋骨保持在双边和修复切口胸骨, 以暴露左心室。在左心室后部插入一个21尺的蝶形针, 连接到蠕动灌注系统。
   4. 穿刺右心房, 并迅速 (在十年代) 收集200-300 µL 血液释放到胸腔使用1毫升吸管提示 (末端切断) 在血清收集管和储存在冰上。
      注: 这种灌注过程是不生存的。
   5. 一旦血液收集, 打开灌注系统 (10-12 rpm, 5 毫升/分钟) 和灌注动物为3分钟与温暖 (RT) 1x PBS (免费的 Ca^{2 +/}毫克^{2 +}离子)。
      注意: 在灌注过程中, 含有 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}离子的 PBS 可以用于更好的心脏活动。用于灌注的 PBS 总数量在15-20 毫升范围内。
   6. 通过注意肝脏、肾脏的颜色来评估灌注质量, 在灌注后呈白色/苍白。
      注: 肾脏或肝脏灌注不一定表明脑灌注, 因为动脉 (颈动脉/椎体) 到达大脑从主动脉可能会在3的准备过程中, 特别是在心房穿刺期间破裂。

2. 组织加工

1. 器官收集和存贮
   1. 在灌注结束时, 通过颈椎脱位确认动物死亡, 并获得大脑和肾脏。通过大脑的颜色来验证脑灌注 (脑膜血管中没有可见的血液), 以便在灌注质量不好时排除动物的渗透率分析。使用手术刀将大脑分成 2 hemibrains (图 1)。
   2. 解剖与手术刀一 hemibrain 没有嗅觉裂片和小脑和转移 hemicerebrum 到一个2毫升管。如果需要小脑通透性评估, 则将半小脑储存在额外的导管中。
   3. 把一个肾脏转移到另一个2毫升的试管里。立即将样品存放在干冰上。
   4. 本机嵌入在干冰上的最佳切削温度 (o.c. T) 化合物的剩余肾脏和半脑 (包括小脑和嗅觉裂片)。
   5. 最后, 离心机在 10, 000 克, 10 分钟4°c 的血液标本储存在冰上。将血清上清液转移到1.5 毫升管并放置在干冰容器中。
   6. 将收集到的所有样品在干冰上转移到-80 °c 冷藏库, 直到进一步加工。
      注: 在进行均匀化步骤之前, 冷冻样品是很重要的, 因为在冷冻解冻后均匀化效率增加。
2. 均匀化和离心
   1. 冰上解冻的半脑和肾脏样本冻结在-80 摄氏度, 并称管含有器官。从这些权重, 减去几个空管的平均值 (约 20), 以获得组织重量。将300µL 和200µL 的冷 1X PBS 分别添加到含有肾脏和半大脑的管中。
      注: 对于低剂量的组织 (如半小脑, 低于100毫克) 体重的个别管的建议。
   2. 融汇在原来的离心管中的每个样品与一个聚四氟乙烯 (PTFE) 杵连接到一个电动顶部搅拌器 (1, 000 rpm) 通过执行约15冲程 (1 冲程 = 1 和1下来)。在样品之间用 PBS 冲洗杵, 然后擦干, 然后再进行下一个样品。
      注意: 在均匀化过程中使用洗涤剂是避免的, 因为可能会干扰荧光法。然而, 在本协议中也检测到细胞内示踪物, 因为组织完全均匀化, 在一轮冰冻解冻后效率更高。
   3. 将均匀的样品保存在光和离心机的冰上, 最后在1.5万克, 20 分钟, 4 摄氏度的桌面离心机上。将上清液转移到新的1.5 毫升的冰上, 以便立即进行荧光或-80 °c 的分析。
3. 荧光测量与定量
   1. 如果在上一步结束时冻结, 在冰上解冻的组织上清和血清标本储存在-80 ˚C 保护他们从光与箔。
   2. 吸管50µL 稀释血清 (30 µL 1x PBS + 20 µL 血清) 或组织上清液 (as) 成384井黑板。包括至少一个来自假动物的血清和组织上清液的样本, 以确保适当的背景减法, 因为这种组织匀浆背景通常高于作为稀释剂的 PBS。
      注: 平均3只假动物可用于自体荧光, 尽管在假的自发荧光值 (未显示的数据) 中有很小的变异性。用 PBS 稀释后可降低血清用量, 也可提高低荧光样本 (如脑样) 的信噪比。对10µL 血清进行了测试, 稀释40µL PBS。确保井里没有气泡。
   3. 将384井黑板插入板读取器, 并打开一个新的脚本选择荧光测量。
   4. 将增益设置为最佳, 并分别使用550/580 或490/520 的激发/发射 (nm) 值 (FITC dyee), 并开始测量以获得原始荧光单元 (RFUs)。
   5. 使用原始荧光单元 (RFUs) 从板读取器计算渗透率指数 (PI) 后减去相应的假值。
      1. * 渗透率索引(毫升/克)= (组织 RFUs/g 组织重量)/(血清 RFUs/毫升血清)
   6. 动物 GOF1 的脑通透指数 (PI) 的示例计算 (表 1):
      1. GOF1 脑 RFUs-假脑 RFUs = 154-22.5 = 131。5
      2. GOF1 血清 RFUs-假血清 RFUs = 38305-27 = 38278
      3. 脑重量 (g) = 0.195
      4. 血清容积 (毫升) = 0.02
      5. 脑通透性指数 (10^-3毫升/克) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         注: 渗透率指数计算产生的价值是绝对的和可比性的实验和组织类型。然而这些可以被提出作为比率为容易比较在2个小组之间¹²。这可以通过将两组动物的 pi 与对照组的平均 pi 进行分割, 从而使对照组的平均值达到 1, 同时保持对照组的动物间变异。此转换为相对于控件组设置为1的实验组 (或组) 提供值。
4. 示踪剂的免疫荧光可视化
   1. 将本机内嵌入的肾脏/半脑块 (o.c. T) (步骤 2.1) 切成10µm 节, 恒温器设置为-20 摄氏度, 并将切片转移到放置在室温下的幻灯片。一旦部分被烘干 (大约30分钟), 转移幻灯片到-80 °c 冷冻机, 直到使用。
   2. 染色当日, 将37摄氏度的滑梯解冻10分钟, 然后在室温下用 4% paraformaladehyde (粉煤灰) 固定部分, 然后在 PBS 中快速清洗。
   3. 在室温下, 用含有 1% BSA 的无菌 PBS 和0.5% 海卫 X-100 pH 7.5 为1小时的通透/阻塞缓冲区孵化部分。
   4. 用 CD31 原抗体 (0.5 毫克/毫升, 克隆肌 13.3) 在室温下孵化1.5 小时的幻灯片, 在1:100 的缓冲中稀释, 含无菌 PBS, 0.5% BSA, 0.25% 海卫 X-100 (pH 7.2), 随后三5分钟清洗 PBS。
   5. 在上述缓冲区中进行二次抗体孵化, 在室温下使用特定物种的荧光标记抗体稀释 1:500 (2 毫克/毫升)。对于 CD31, 山羊抗鼠 alexa 568 或 alexa 488 可以使用稀释1:500。包括 DAPI (300 µM) 的二次抗体组合 (1:1, 000 稀释从股票) 染色的细胞核。
   6. 将染色的部分装上水 polymount, 在天黑时将其留在室温聚合。
   7. 利用光谱成像共聚焦激光扫描显微镜系统获取图像。通过 NIS 元素软件分析图像 (版本 4.3)。软件, 如 Photoshop 可以用于生成蒙太奇数字。

结果

我们最近表明, angiopoietin-2 (Ang-2) 增益功能 (GOF) 小鼠脑血管通透性比控制小鼠在健康条件下¹⁰。在脑卒中诱导的小鼠中, GOF 小鼠的梗死面积较大, 通透性大于对照窝。这些结果显示 Ang-2 在脑屏障通透性中的重要作用。因此, 该议定书利用 GOF 小鼠, 并将其与对照窝来描述体内通透性试验。然而, 这种方法可以应用于任何疾病模型, 转基因小鼠模型或药?...

讨论

血脑屏障功能障碍与一系列神经系统疾病有关, 包括原发性和次级脑肿瘤或中风。脑屏障破裂通常与危及生命的中枢神经系统水肿有关。因此, 分子机制的阐明, 触发开放或关闭的脑屏障是治疗的意义, 在神经系统疾病和一般调查的研究人员。然而, 研究文献中报告的脑屏障通透性在体内的方法往往与技术上的困难有关, 这取决于荧光图像的单调和主观量化,^17,

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R