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Resumo

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Resumo

Barreira hemato - encefálica (BBB) é uma barreira especializada que protege o microambiente do cérebro de toxinas e patógenos na circulação e mantém a homeostase do cérebro. Os principais locais da barreira são células endoteliais dos capilares cerebrais cuja função de barreira resulta de junções intercelulares apertadas e transportadores de efluxo expressados na membrana plasmática. Esta função é regulada por pericitos e astrócitos que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). Várias doenças neurológicas, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), tumores cerebrais estão associados uma função prejudicada do BBB. Avaliação da permeabilidade do BBB é, portanto, crucial na avaliação da gravidade da doença neurológica e o sucesso das estratégias de tratamento empregado.

Apresentamos aqui um simples ainda ensaio de permeabilidade robusto que foram aplicadas com êxito ao rato vários modelos ambos, genética e experimental. O método é altamente quantitativa e objectiva em comparação com a análise de fluorescência de traçador por microscopia que é comumente aplicada. Neste método, os ratos são injectados intraperitonealmente com uma mistura de aquosas inertes marcadores fluorescentes, seguido por anestesiar os ratos. Perfusão cardíaca dos animais é executada antes da colheita, cérebro, rins ou outros órgãos. Órgãos são homogeneizados e centrifugados seguido por medição de fluorescência de sobrenadante. Sangue da punção cardíaca antes de perfusão tem finalidade de normalização para o compartimento vascular. A fluorescência de tecido é normalizada para a molhado fluorescência peso e soro para obter um quantitativo índice de permeabilidade do traçador. Para confirmação adicional, o contralateral hemi-cérebro preservado para imuno-histoquímica pode ser utilizado para fins de visualização do traçador fluorescência.

Introdução

A barreira hemato - encefálica (BBB) consiste nas células endoteliais microvasculares (ECs), apoiadas por pericitos intimamente associados (PCs), que são ensheathed na lâmina basal, e astrócitos (ACs) que envolvem a membrana basal com os pés-final1 ,2. ECs interagirem com vários tipos de células que suportam e regulam a função de barreira, principalmente ACs e PCs, e também os neurônios e microglia, que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). O NVU é crítico para a função do BBB, que limita o transporte de sangue toxinas e patógenos de entrar no cérebro. Esta função é um resultado da junção apertada-moléculas como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, que estão presentes entre o ECs e também devido à ação de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) o efluxo moléculas que entram o endotélio de volta para o navio lúmen1,2,3. O BBB entretanto permite o transporte de moléculas essenciais como nutrientes (glicose, ferro, aminoácidos) por transportadores específicos expressados no CE membranas de plasma1,2,3. A camada de CE é altamente polarizada em relação a distribuição de vários transportadores entre o luminal (sangue-face) e abluminal (membranas voltados para o cérebro) para permitir o transporte específico e vectorial função4,5 . Enquanto o BBB é protetor com relação a regulação firmemente no meio do CNS, é um grande desafio para a entrega de drogas CNS em doenças como a doença de Parkinson com um BBB funcional. Mesmo em doenças neurológicas com disfunção do BBB, ele não pode ser considerado que a entrega de drogas do cérebro é maior, particularmente como a disfunção da barreira poderia incluir danos para as metas de transporte específico por exemplo, como a doença de Alzheimer (AD). No anúncio, vários transportadores de amiloide beta, como o LRP1, raiva, P-gp são conhecidos por ser prejudicado e direcionamento, portanto, estes transportadores pode ser fútil6,7,8. O BBB é prejudicado em várias doenças neurológicas como meningite de acidente vascular cerebral, AD, esclerose múltipla e tumores de cérebro9,10,11. Restaurar a função de barreira é uma parte crucial da estratégia terapêutica e, portanto, sua avaliação é fundamental.

Neste trabalho, descrevemos um objectivo e quantitativo protocolo para ensaio de permeabilidade em roedores que nós aplicada com êxito a várias linhas de rato ambos doença transgénicos e experimental modelos10,12,13 ,14. O método é baseado em uma simples injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes seguido de perfusão dos ratos para remover os marcadores do compartimento vascular. Cérebro e outros órgãos são coletados post perfusão e avaliados por um objectivo de permeabilidade e índice de permeabilidade absoluta com base nas medidas de fluorescência do tecido homogenates em um leitor de placa. Todos os valores de fluorescência crus são corrigidos para o plano de fundo usando o soro de animais de Souza que não recebem qualquer marcador ou tecido homogenates. Amplas normalizações são incluídas para o volume de soro, fluorescência de soro e o peso dos tecidos, produzindo assim o índice de permeabilidade absoluta e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. Para facilitar a comparação entre os grupos, os valores de índice de permeabilidade absoluta podem ser prontamente transformados rácios como tinha anteriormente foram realizadas12. Simultaneamente, armazenado hemi-cérebro e rim poderiam ser utilizados para visualização de traçador por microscopia de fluorescência10. A microscopia de fluorescência clássico pode ser valiosa na obtenção diferença regional na permeabilidade, embora complicado devido à seleção subjetiva de imagens para uma análise semi-quantitativa e seções do tecido. As etapas detalhadas são apresentadas no protocolo e notas são adicionadas quando necessário. Isto fornece as informações necessárias para executar com êxito o ensaio de permeabilidade em vivo nos ratos que podem ser escalados para outros pequenos animais. O ensaio pode ser aplicado a vários tipos de marcadores permitindo a carga e o tamanho com base em avaliação de permeabilidade por uma combinação de marcadores com espectros de fluorescência distintas.

Protocolo

Todos os animais foram tratados com o máximo cuidado, minimizando a dor ou desconforto durante o procedimento. Este procedimento segue as orientações de cuidados com animais de nossa instituição e foi aprovado pelo comitê local (Regierungspraesidium Darmstadt, número de aprovação FK/1044).

Um esquema das etapas de trabalho na vivo o ensaio de permeabilidade em camundongos é mostrado na Figura 1. Os detalhes de cada etapa são descritos abaixo.

1. animal manipulação

  1. Preparação e administração de traçadores e anestésicos
    1. Prepare tubos etiquetados e moldes para tecido incorporação, pelo menos, um dia antes do ensaio de permeabilidade. Manter condições estéreis em todo o protocolo, trabalhando sob a coifa limpa e usando ferramentas limpadas com 80% de etanol. Use o macho ou fêmea selvagem-tipo (WT) ou os ratos (GOF) CD1 de ganho-de-função angiopoietina-2 (Ang-2) na faixa etária adulta madura de 3-6 meses para o protocolo atual. Realize a genotipagem dos ratos conforme descrito anteriormente, 10.
      Nota: 80% de álcool não resultará em instrumentos estéreis, mas vai minimizar a contaminação das amostras preparadas.
    2. Diluir todos os marcadores em PBS estéril em ações de 2mm e armazenar as alíquotas protegidas da luz, a-20 ° C.
    3. Escolha dos marcadores tais como (tetrametil rodamina) TMR e (isotiocianato de fluoresceína) FITC com espectros de excitação/emissão distintos e que são lisina fixável resultando em interferência mínima entre as tinturas por microscopia de fluorescência (usando o TMR ou FITC filtrar respectivamente) e pelo fluorometry em um leitor de placa para o ensaio de permeabilidade.
      Nota: Dextran TMR 3 kD e dextrano FITC 3 kD utilizados no estudo são ambos lisina fixável e, portanto, pode também ser usado para fixação de pós análise imuno-histoquímica com aldeídos a fim de investigar as diferenças regionais.
    4. Lidar com todos os animais com maior cuidado, seguindo as orientações de cuidados institucionais. Injete intraperitonealmente cada rato com solução de rastreamento de 100 µ l que pode ser aumentada até 200 µ l quando um marcador adicional é combinada usando 100 µ l de cada marcador em uma mistura 1:110,13. Injete pelo menos um animal com PBS sozinho em vez dos marcadores para servir como controle de Souza para subtração de fundo de autofluorescência.
    5. 5 min após a injeção do traçador, anestesiar o animal com uma injeção de IP de ketamina e xilazina (100 mg e 5-10 mg em 0,9% soro fisiológico por corpo kg peso respectivamente, 150 µ l do coquetel por rato 25 g).
      Nota: Pomada Vet não foi aplicada sobre os olhos durante o procedimento como o período entre animal anestesia e perfusão/sacrifício foi breve (10 minutos) onde qualquer secagem dos olhos não foi observada.
  2. Perfusão sanguínea de coleção e cardíaca
    1. Prepare os animais para perfusão cardíaca 10 min após a administração anestésica. Verificar a ausência de resposta de contração de pata para garantir que o animal chegou a um plano cirúrgico da anestesia.
    2. Colocar os animais nas suas costas e aplicar 80% de etanol na pele da área abdominal. Usando tesouras pequenas, abra a parede abdominal com uma pequena incisão (2 cm), logo abaixo da caixa torácica. Separar o fígado do diafragma e então lentamente através do diafragma, expondo a cavidade pleural 15.
    3. Cortar a caixa torácica bilateralmente e fixar o esterno cortado para expor o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha de calibre 21 borboleta conectada a um sistema de perfusão peristáltica no posterior do ventrículo esquerdo.
    4. Perfure o átrio direito e rapidamente (dentro de 10 s) recolher 200-300 µ l de sangue lançado na cavidade do peito usando pontas de pipetas de 1 mL (com corte final) em tubos de colheita de soro e armazená-lo no gelo.
      Nota: Este procedimento de perfusão é não-sobrevivência.
    5. Assim que o sangue é colhido, ligue o sistema de perfusão (10-12 rpm, 5 mL/min) e perfundir o animal para 3 min com quente (RT) 1X PBS (livre de Ca2 + /íons de Mg2 + ).
      Nota: PBS contendo Ca2 +/ mg2 + íons podem ser utilizadas para melhor atividade do coração durante a perfusão. A quantidade total de PBS usado para perfusão é na faixa de 15 a 20 mL.
    6. Avaliar a qualidade da perfusão, observando a cor de fígado, rins, que aparecem branco/pálido Após a perfusão.
      Nota: Perfusão hepática ou renais não indicam necessariamente perfusão cerebral como as artérias (carótidas/vertebrais) atingindo o cérebro da aorta pode ser rompido durante a preparação, na etapa 3, particularmente durante a punção atrial.

2. processamento do tecido

  1. Armazenamento e coleta de órgãos
    1. Ao final da perfusão, confirme a morte do animal por deslocamento cervical e colheita cérebro e rins. Verificar perfusão cerebral pela cor dos cérebros (sem sangue visível nos vasos das meninges), a fim de excluir os animais da análise de permeabilidade quando perfusão qualidade não é boa. Separe o cérebro em 2 hemibrains usando um bisturi (Figura 1).
    2. Dissecar com um hemibrain de um bisturi livre de lóbulos olfativo e cerebelo e transferir o hemicerebrum para um tubo de 2 mL. Loja hemi-cerebelo em um tubo adicional, se necessário, para avaliação da permeabilidade cerebelar.
    3. Transferi um único rim para um outro tubo de 2 mL. Armazene as amostras imediatamente em gelo seco.
    4. Incorpore nativamente o restante do rim e hemi-cérebro (incluindo o cerebelo e os lobos olfativos) em tecido-tek ideal da temperatura de corte (O.C.T) composto em gelo seco.
    5. No final, Centrifugar as amostras de sangue armazenadas no gelo em tubos de colheita de soro no 10, 000 g, 10 min a 4 ° C. Sobrenadantes de soro de transferência para tubos de 1,5 mL e colocá-los no recipiente de gelo seco.
    6. Transferência de todas as amostras coletadas em gelo seco para freezer-80 ° C até posterior processamento.
      Nota: É importante congelar as amostras antes de prosseguir para as etapas de homogeneização como aumentos de eficiência de homogeneização depois como congelar descongelar.
  2. Homogeneização e centrifugação
    1. Descongelar no gelo os hemi-cérebro e rim amostras congeladas para baixo a-80 ° C e pesar os tubos que contêm os órgãos. Destes pesos, subtrai o valor médio de vários tubos vazios (cerca de 20) para obter o peso do tecido. Adicionar 300 µ l e 200 µ l de frio 1 X PBS para os tubos contendo o rim e hemi-cérebro, respectivamente.
      Nota: para a menor quantidade de tecido (como hemi-cerebelo, abaixo de 100 mg) pesar os tubos individuais é recomendado.
    2. Homogeneizar a amostra no tubo de eppendorf original com um pilão de politetrafluoretileno (PTFE) anexado a um agitador sobrecarga elétrica (1, 000 rpm), através da realização de cerca de 15 cursos (1 curso = 1 e 1 para baixo). Enxágue o pilão com PBS entre as amostras e seque antes de prosseguir para a próxima amostra.
      Nota: O uso de detergentes durante a homogeneização foi evitado devido a possíveis interferências com fluorometry. No entanto, palpador intracelular também é detectado no presente protocolo como o tecido é completamente homogeneizado, que é mais eficiente depois de uma rodada de congelar descongelar.
    3. Armazene as amostras homogeneizadas no gelo protegido da luz e centrifugar todos junto no final a 15.000 g, 20 min, 4 ° C em uma centrífuga do tabletop. Transferi sobrenadantes para um novos tubos de 1,5 mL no gelo para fluorometry imediata ou a-80 ° C para ser analisado mais tarde.
  3. Quantificação e medição de fluorescência
    1. Se congelado no final da etapa anterior, descongele no gelo, as amostras de tecido sobrenadante e soro armazenadas a-80 ˚ c protegendo-os de luz com a folha.
    2. Pipete 50 µ l de soro diluído (30 µ l 1X PBS + 20 µ l de soro) ou sobrenadantes de tecido (como é) para uma placa 384-bem preta. Incluem pelo menos uma amostra de animal de Souza para soro e tecido sobrenadantes garantir a subtração de fundo apropriada, como este pano de fundo de homogeneizado de tecido é normalmente maior que a de PBS, usado como o diluente.
      Nota: Uma média de 3 animais de Souza pode ser usada para autofluorescência embora observou-se uma variabilidade muito pequena em valores de autofluorescência de Souza (dados não mostrados). A quantidade de soro usada pode ser reduzida por diluir com PBS, que também pode aumentar a relação sinal-ruído para amostras com baixa fluorescência como as amostras de cérebro. Upto 10 µ l de soro foi testado diluir com 40 µ l PBS. Certifique-se de que não há bolhas estão presentes nos poços.
    3. Insira a placa preta 384-bem o leitor e abra um novo script selecionando medição de fluorescência.
    4. Definir o ganho para o ideal e usar valores de excitação/emissão (nm) de 550/580 ou 490/520 para TMR ou FITC dyee respectivamente e iniciar a medição para obter as unidades de fluorescência cru (RFUs).
    5. Use as unidades de fluorescência cru (RFUs) do leitor de placa para calcular o índice de permeabilidade (PI), depois de subtrair os valores correspondentes de Souza.
      1. * Índice de permeabilidade (mL/g) = (RFUs/g de tecido tecido peso) / (soro soro RFUs/mL)
    6. Exemplo cálculo para índice de permeabilidade do cérebro (PI) do animal GOF1 (tabela 1):
      1. GOF1 cérebro RFUs - SHAM cérebro RFUs = 154-22.5 = 131.5
      2. Soro GOF1 RFUs - soro de Souza RFUs = 38305 / 27 = 38278
      3. Peso (g) do cérebro = 0,195
      4. Volume de soro (ml) = 0,02
      5. Cérebro de índice de permeabilidade (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Nota: Os cálculos do índice de permeabilidade produzem valores que são absolutos e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. No entanto estes podem ser apresentados como rácios para facilitar a comparação entre os 2 grupos de 12. Isto pode ser conseguido dividindo o PI de cada animal em ambos os grupos, com o PI médio do grupo controle, dirigindo a média do grupo de controle através de 1 ainda mantendo a variação de animais inter no grupo controle. Essa transformação fornece valores para o grupo experimental (ou grupos) em relação ao grupo controle, definido como 1.
  4. Visualização de imunofluorescência do tracer
    1. Corte os blocos de rim/hemi-cérebro nativamente no composto de tecido-tek (O.C.T) (passo 2.1) incorporados 10 µm seções em um criostato definido como-20 ° C e transferir as seções de slides colocados à temperatura ambiente. Uma vez que as seções são secas (cerca de 30 min), transferência de slides para congelador-80 ° C até o uso.
    2. No dia da coloração, descongelar os slides a 37 ° C por 10 min e em seguida fixar as seções com 4% paraformaladehyde (PFA) durante 10 minutos à temperatura ambiente seguida de lavagem rápida em PBS.
    3. Incube as secções no buffer de permeabilização/bloqueio de PBS estéril contendo 1% de BSA e 0,5% Triton X-100 pH 7,5 por 1h à temperatura ambiente.
    4. Incubar por 1,5 h em temperatura ambiente com anticorpo primário CD31 (0,5 mg/ml, clonar o MEC 13.3), diluído em 1: 100 em tampão contendo PBS estéril, BSA de 0,5%, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) seguido de três lavagens de 5 min em PBS.
    5. Execute a incubação do anticorpo secundário no buffer acima por 1h à temperatura ambiente com espécie fluorescente etiquetado anticorpos diluído 1: 500 (2 mg/mL). Para CD31, anti-rato cabra Alexa 568 ou Alexa 488 pode ser usada em uma diluição de 1: 500. Incluir DAPI (300 µM) no anticorpo secundário mix (1:1, 000 diluição do estoque) para manchar-se para os núcleos.
    6. Montar as seções manchadas com o aqua polymount e deixá-lo durante a noite para polimerização à temperatura ambiente no escuro.
    7. Adquira imagens usando um laser confocal de imagem espectral microscópio sistema de digitalização. Analise imagens pelo software de elementos de NIS (versão 4.3). Software como o Photoshop pode ser usado para a geração de figuras de montagem.

Resultados

Nós recentemente demonstraram que camundongos de (GOF) angiopoietina-2 (Ang-2) ganho-de-função maior permeabilidade vascular do cérebro do que os ratos controle em condições saudáveis10. Em camundongos induzida por acidente vascular cerebral, foi também mostra que os ratos GOF tinham maiores tamanhos de infarto e permeabilidade maior do que o littermates de controle. Esses resultados mostram um papel crítico de Ang-2 na permeabilidade no BBB. O protocolo, ...

Discussão

Disfunção da barreira hemato - encefálica está associada com um número de doenças neurológicas, incluindo tumores cerebrais primários e secundários ou derrame. Repartição BBB é frequentemente associada com edema de CNS fatais. A elucidação dos mecanismos moleculares que acionam a abertura ou encerramento do BBB é, portanto, de importância terapêutica em doenças neurológicas e comumente investigado pelos pesquisadores. No entanto, métodos para investigar BBB permeabilidade na vivo relatados na...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer o consórcio Sphingonet, financiado pela Fundação para apoiar este trabalho de Leduq. Este trabalho também foi apoiado pelo centro de pesquisa colaborativa "diferenciação Vascular e remodelação" (CRC / Transregio23, projeto C1) e pela 7. FP, MULTIANUAIS, Goethe internacional Postdoc programa GO-IN, n. º 291776 financiamento. Reconhecemos mais Kathleen Sommer pela sua assistência técnica com ratos, manipulação e genotipagem.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kDThermosfisherD3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kDThermosfisherD3306
Ketamine (Ketavet)Zoetis
Xylazine (Rompun)Bayer
0.9% SalineFresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBSGibco10010-015
Tissue-tek O.C.T compoundSakura Finetek4583
37% Formaldhehyde solutionSigma252549-1Lprepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction VRoth8076.3
Triton X-100SigmaT8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3BD Pharmingen553370
goat anti rat alexa 568Molecular ProbesA-11077
goat anti rat alexa 488Molecular ProbesA-11006
DAPIMolecular ProbesD1306
Aqua polymountPolyscience Inc18606
21-gauge butterfly needleBD387455
serum collection tubeSarstedt41.1500.005
2mL eppendorf tubesSarstedt72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipersKimberley-Clark Professional05511
384-well black plateGreiner781086
slides superfrost plusThermoscientificJ1800AMNZ
PTFE pestleWheaton358029
electric overhead stirrerVWRVWR VOS 14
plate readerTecanInfinite M200
CryostatMicrom GmbHHM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope SystemNikon
peristaltic perfusion systemBVK Ismatec
microcentrifugeeppendorf5415R

Referências

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