Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Özet

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Özet

Kan - beyin bariyerini (BBB) toksinler ve patojenler dolaşımda beyin microenvironment karşı korur ve beyin homeostazı tutar özel bir engeldir. Asıl bariyer sıkı hücreler arası kavşaklar ve plazma membran üzerinde ifade sızma taşıyıcılar bariyer fonksiyonu sonuçları beyin kapiller endotel hücreleri sitelerdir. Bu işlev perisitlerden ve birlikte nörovasküler birimi (NVU) formu astrocytes tarafından düzenlenmiştir. Felç, Alzheimer hastalığı (Ah), gibi çeşitli nörolojik hastalıklar Beyin Tümörleri bir Engelli BBB işlevi ile ilişkilidir. BBB geçirgenliği değerlendirilmesi bu nedenle nörolojik hastalığın şiddeti ve istihdam tedavi stratejileri başarı değerlendirilmesinde çok önemlidir.

Henüz birkaç fare başarıyla uygulanmış olan sağlam geçirgenliği tahlil hem genetik hem deneysel modeller Burada basit bir mevcut. Son derece nicel ve izleyici Floresans analiz tarafından yaygın olarak uygulanan mikroskobu ile karşılaştırıldığında objektif yöntemidir. Bu yöntemde, fareler intraperitoneally sulu etkisiz floresan izleyiciler fareler anesthetizing tarafından takip bir karışımı ile enjekte edilir. Kardiyak perfüzyon hayvanların beyin, böbrek veya diğer organlara hasat öncesinde gerçekleştirilir. Organları homojenize ve centrifuged floresan ölçüm tarafından süpernatant takip. Hemen önce perfüzyon kardiyak ponksiyon çizilmiş kan damar yuvası normalleştirme amaçla hizmet vermektedir. Doku floresan bir nicel elde etmek için ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş izleyici geçirgenliği dizin. Ek onay için kontralateral hemi-beyin immünhistokimya için korunmuş izleyici Floresans görselleştirme amaçlar için yararlı olabilir.

Giriş

Mikrovasküler endotel hücreleri (ECs) Bazal lamina ensheathed olan yakından ilişkili perisitlerden (PCs) ve sonunda ayakları^{1 ile membran örtmek astrocytes (ACs) tarafından desteklenen, kan - beyin bariyerini (BBB) oluşur ,2}. ECs destekleyen ve bariyer fonksiyonu, öncelikle ACs ve PC'ler, düzenleyen birkaç hücre tipleri ile etkileşim ve aynı zamanda sinir hücreleri ve microglia, Bütün bunlar birlikte form nörovasküler birimi (NVU). NVU kan yoluyla toksinlerin ve patojenler beyin girmesini sınırlayan BBB, işlev için önemlidir. Bu işlev mevcut ve taşıyıcılar gibi p-glikoprotein (P-gp) bu sızma endotel girin molekülleri içine geri eylem nedeniyle ECs arasında sıkı kavşak molekülleri claudin-5, occludin, zonula occludens-1, gibi bir sonucudur gemi Lümen^1,2,3. BBB ancak besin (glikoz, demir, amino asitler) gibi temel moleküllerin taşıması için özel taşıyıcılar üzerinde EC plazma membran^1,2,3ifade tarafından sağlar. EC katman son derece çeşitli taşıyıcılar luminal (kan bakan) ve özel ve vektörel taşıma fonksiyonu⁴için^{,5 izin vermek için abluminal (beyin bakan membranlar) arasındaki dağılımı açısından polarize} . BBB sıkıca CNS çevre düzenlenmesi ile ilgili koruyucu olmakla birlikte, CNS ilaç dağıtım fonksiyonel BBB ile Parkinson gibi hastalıklarda için büyük bir sorun olduğunu. BBB disfonksiyonu olan nörolojik hastalıklar bile, özellikle bariyer disfonksiyonu örneğin Alzheimer hastalığı (Ah) gibi belirli ışınlama hedefleri zarar dahil olabilir gibi beyin ilaç dağıtım arttığını kabul edemiyor. Yılında, birkaç amiloid beta taşıyıcılar LRP1, öfke, P-gp gibi dysregulated olduğu bilinmektedir ve bu nedenle bu taşıyıcılar hedefleme beyhude^6,7,8olabilir. BBB inme, reklam, menenjit, multipl skleroz ve Beyin Tümörleri^9,10,11' gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda bozulmuş. Bariyer fonksiyonu geri tedavi stratejisinin önemli bir parçasıdır ve böylece onun değerlendirmesi önemlidir.

Bu çalışmada, objektif ve biz başarılı bir şekilde her iki transgenik ve deneysel hastalık modelleri^{10,12,13 birkaç fare satırlarına uygulanır Rodents geçirgenliği tahlil için nicel protokolü bir tarif var ,14}. Yöntem izleyiciler damar yuvası kaldırmak için floresan izleyiciler tarafından farelerin perfüzyon takip basit bir mayi iğne temel alır. Beyin ve diğer organlara toplanan yazı perfüzyon ve nesne tarafından değerlendirildi geçirgenliği ve doku homogenates bir plaka okuyucu Floresans ölçümleri dayalı mutlak geçirgenliği dizin vardır. Tüm ham Floresans değerleri doku homogenates veya herhangi bir izleyici almazsınız sham hayvanlardan serum kullanarak arka plan için düzeltilir. Geniş normalizations serum cilt, serum Floresans ve böylece mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir geçirgenliği dizin oluşturan dokular, ağırlığı dahil edilir. Biz daha önce¹²gerçekleştirilen vardı gibi gruplar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için mutlak geçirgenliği dizin değerlerini kolayca oranları dönüştürülebilir. Aynı anda, saklı hemi-beyin ve böbrek Floresans mikroskobu¹⁰tarafından izleyici görselleştirme için yararlanılabilir. Klasik Floresans mikroskobu geçirgenliği bölgesel farklılığı hantal olsa doku bölümü ve yarı kantitatif analiz için görüntü öznel seçim nedeniyle elde etmek önemli olabilir. Ayrıntılı adımlar iletişim kuralında sunulmaktadır ve notlar uygun olan yerlerde eklenir. Bu başarıyla diğer küçük hayvanlar için ölçeklendirilebilir farelerde vivo içinde geçirgenliği tahlil gerçekleştirmek için gerekli bilgileri sağlar. Tahlil tarayıcıları birçok türde uygulanabilir şarj ve boyutu için izin alarak geçirgenliği değerlendirme tarayıcıları farklı floresan spectra ile kombinasyonu tarafından.

Protokol

Tüm hayvanların son derece dikkatli ağrı veya rahatsızlık işlem sırasında en aza indirerek ele. Bu yordam kuruluşumuzun hayvan bakımı kuralları izler ve yerel Komitesi (Regierungspraesidium Darmstadt, onay numarası FK/1044) tarafından onaylanmış.

Vivo geçirgenliği tahlil farelerde için iş adımları şematik Resim 1' de gösterilen. Her adımı ayrıntılarını aşağıda açıklanmıştır.

1. hayvan taşıma

1. Hazırlık ve izleyiciler ve anestezi yönetimi
   1. En az bir gün önce geçirgenliği tahlil katıştırma doku etiketli tüpler ve kalıpları hazırlamak. Temiz duman başlık altında çalışan ve % 80 etanol ile temizlenmiş araçları kullanarak protokol steril koşullarını korumak. 3-6 ay için geçerli protokol Olgun Yetişkin yaş grubunda erkek veya kadın vahşi-türü (WT) veya angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) CD1 fare kullanın. ¹⁰daha önce açıklandığı gibi farelerin Genotipleme gerçekleştirin.
      Not: % 80 alkol steril aletlerin oluşturmayacaktır ancak kirlenme hazırlanan numunelerin en aza indirmek olacaktır.
   2. Steril PBS tüm izleyiciler 2 mM stokları sulandırmak ve ışık-20 ° C'de korunan aliquots depolayın
   3. Tarayıcıları (Tetramethyl rodamine) TMR gibi seçin ve (floresein isothiocyanate) FITC ayrı uyarma/emisyon spectra ve çoğu lizin her iki tarafından Floresans mikroskobu boyalar arasında en az girişime sonuçlanan tamir edilebilir (TMR kullanarak veya FITC sırasıyla filtre) ve fluorometry geçirgenliği tahlil için bir plaka okuyucu tarafından.
      Not: TMR dextran 3 kD ve FITC dextran 3 kD çalışmada kullanılan her iki lizin tamir edilebilir olduğunu ve dolayısıyla da immunohistokimyasal analiz sonrası fiksasyon ile aldehitler için bölgesel farklılıklar araştırmak amacıyla kullanılabilir.
   4. Tüm hayvanların son derece dikkatli Kurulusları yönergeleri izleyerek başa. İntraperitoneally her fare her izleyici 100 µL bir 1:1 karışımı^10,13' te kullanarak ek bir izleyici birleştirildiğinde bu kadar 200 µL artırılabilir 100 µL izleme çözümü ile enjekte et. PBS autofluorescence arka plan çıkarma için sahte denetimi olarak hizmet etmek için izleyiciler yerine tek başına en az bir hayvan enjekte.
   5. 5 dakika sonra izleyici enjeksiyon, ketamin ve Xylazine bir IP enjeksiyon hayvanla anestezi (5-10 mg ve 100 mg % 0,9 kg vücut başına Saline ağırlık sırasıyla, kokteyl 25 g fare başına 150 µL).
      Not: hayvan anestezi ve perfüzyon/kurban arasındaki dönemi kısa olduğu gibi veteriner merhem gözünü işlem sırasında uygulanmadı nerede herhangi bir gözünde kurutma değildi (10 dakika) görülmektedir.
2. Kan toplama ve kardiyak perfüzyon
   1. Hayvanlar kalp perfüzyon 10 dk sonra anestezik Yönetim için hazır olun. Pençe seğirme yanıt yokluğu hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı emin olmak için kontrol edin.
   2. Hayvanlar onların sırt üstü yatıyordu ve % 80 etanol karın bölgesinde cilt üzerinde uygulayın. Küçük makas kullanırken, karın duvarı göğüs kafesinin hemen altında küçük bir insizyon attım (2 cm) ile açın. Karaciğer diyaframdan ayırın ve sonra yavaş yavaş plevral boşluğu ¹⁵açığa diyafram ile kesti.
   3. Bilateral göğüs kafesi kesme ve kesme göğüs kemiğinin sol ventrikül göstermek düzeltmek. Peristaltik perfüzyon sistemi için sol ventrikül arka içinde bağlı 21'lik kelebek iğne yerleştirin.
   4. Sağ atrium ponksiyon ve hızlı bir şekilde (içinde 10 s) 1 mL pipet İpuçları (ile son kesme) kullanarak göğüs boşluğu içine serbest kan 200-300 µL serum koleksiyonu tüplerde toplamak ve buza saklayın.
      Not: Bu perfüzyon hayatta olmayan bir yöntemdir.
   5. En kısa zamanda kan toplanır, perfüzyon sistemi (10-12 d/d, 5 mL/dk) geçin ve hayvan 3 dk sıcak (RT) 1 x PBS ile sıvı (Ca'nın ücretsiz^{2 + /}Mg^{2 +} iyonları).
      Not: PBS içeren Ca^{2 +}/Mg^{2 +} iyonları perfüzyon sırasında daha iyi kalp etkinlik için yararlı olabilir. Toplam perfüzyon için kullanılan PBS 15-20 mL aralığında miktarıdır.
   6. Perfüzyon kalite karaciğer, rengini işaret ederek değerlendirmek böbreğin perfüzyon sonra beyaz/soluk görünür.
      Not: Böbrek veya karaciğer perfüzyon değil mutlaka bir belirtisi olarak arterler (karotis/vertebra) aort beyinden adım 3 hazırlık Atriyal ponksiyon sırasında özellikle sırasında yırtıldı ulaşan beyin perfüzyon.

2. doku işleme

1. Organ toplama ve depolama
   1. Perfüzyon sonunda, servikal çıkması ve hasat beyin ve böbrekler hayvanın ölümü onaylayın. Beyin perfüzyon perfüzyon kalitesi iyi değil zaman hayvanlar geçirgenliği çözümleme dışı bırakmak böylece beyin (görünür kan damarlarının meninkslerde), renk tarafından doğrulayın. Beyin 2 hemibrains bir neşter (şekil 1) kullanarak ayırın.
   2. Bir neşter bir hemibrain ile olfaktör loblar ve beyincik ücretsiz teşrih ve hemicerebrum 2 mL tüp aktarın. Hemi-beyincik serebellar geçirgenliği değerlendirmesi için gerekli ek bir tüp içinde saklayabilirsiniz.
   3. Bir tek böbrek için başka bir 2-mL tüp aktarın. Örnekleri hemen kuru buza saklayın.
   4. Yerel olarak kalan böbrek ve hemi-beyin (beyincik ve olfaktör loblar oluşan) doku-tek en iyi kesim ısı (O.C.T) kuru buza bileşik katıştırın.
   5. Sonunda, 10, 000 g, 4 ° C'de 10 dakika buz serum koleksiyonu tüpler içinde depolanan kan örnekleri santrifüj kapasitesi Serum supernatants 1,5 mL tüpler için aktarmak ve onları kuru buz kapsayıcısına getirin.
   6. Kuru buzun-80 ° C dondurucu için daha fazla alay kadar toplanan tüm örneklerini aktarın.
      Not: Çözülme donma gibi örnekleri homojenizasyon verimliliği artar sonra olarak homojenizasyon adımlara geçmeden önce dondurmak önemlidir.
2. Homojenizasyon ve Santrifüjü
   1. Aşağı-80 ° C'de dondurulmuş hemi-cerebrum ve böbrek örnekleri buz çözme ve organları içeren tüpler tartın. Bu ağırlıklar doku kilo almak için birkaç boş tüpler (20) ortalama değerini çıkarın. 300 µL ve soğuk 1 200 µL eklemek X PBS böbrek ve hemi-cerebrum, sırasıyla içeren tüpler için.
      Not: doku (100 mg altında hemi-beyincik gibi) daha düşük miktarlarda için bireysel tüpler ağırlığında tavsiye edilir.
   2. Yaklaşık 15 vuruş gerçekleştirerek bir elektrik havai karıştırıcı (1, 000 rpm) için bağlı bir politetrafloroetilin (PTFE) havaneli ile orijinal eppendorf tüp her örnekte homojenize (1 vuruş = 1 ve 1 aşağı). PBS ile havaneli örnekleri arasında durulama ve sonraki örnek geçmeden önce kuru silin.
      Not: Deterjanlar homojenizasyon sırasında kullanımı ile fluorometry olası girişim nedeniyle kaçınılması. Ancak, doku iyice bir yuvarlak donma sonra çözdürme daha verimli olduğu homojenize gibi hücre içi izleyici de bu protokol için algılandı.
   3. Homojenize örnekleri ışık ve santrifüj 15.000 g, 20 dk, Masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de sonunda hep birlikte korunuyorsunuz buz mağaza. Supernatants yeni bir 1,5 mL tüpler için hemen fluorometry ya da daha sonra çözümlenecek-80 ° C'de buzda aktarın.
3. Floresans ölçüm ve miktar
   1. Önceki adım sonunda donmuş, buzda-80 ˚C ışık folyo ile onları korumak, saklanan doku süpernatant ve serum örnekleri çözülme.
   2. Seyreltik serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) ya da (as) doku supernatants 50 µL 384-şey siyah bir tabak pipet. Bu doku homogenate arka plan normalde PBS eritici kullanılan daha yüksek olduğu gibi sahte hayvan uygun arka plan çıkarma, emin olmak serum ve doku supernatants için en az bir örnek içerir.
      Not: sahte autofluorescence değerleri (veri gösterilmez) çok az bir değişkenlik gözlendi rağmen ortalama 3 sham hayvanların autofluorescence için kullanılabilir. PBS, ayrıca gürültü oranı sinyal örnekleri için beyin örnekleri gibi düşük floresan ile artırabilir ile sulandrarak kullanılan serum miktarı azaltılabilir. Upto 10 µL serum ile 40 µL PBS sulandrarak test edildi. Hava kabarcığı yok wells bulunduğundan emin olun.
   3. 384-şey siyah plaka plaka okuyucuya yerleştirin ve floresan ölçüm seçerek yeni bir komut dosyası açın.
   4. Kazanç için en iyi ayarlayın ve 550/580 veya 490/520 uyarma/emisyon (nm) değerleri sırasıyla TMR veya FITC dyee için kullanın ve ham Floresans birimleri (RFUs) elde etmek için ölçüm başlatın.
   5. Ham Floresans birimleri (RFUs) plaka okuyucu geçirgenliği dizin (PI) karşılık gelen sahte değerlerini çıkarılarak sonra hesaplamak için kullanın.
      1. * Geçirgenliği dizin (mL/g) = (Doku RFUs/g doku ağırlık) / (Serum RFUs/mL serum)
   6. Örnek hesaplama beyin geçirgenliği dizin (PI) için hayvan GOF1 (Tablo 1):
      1. GOF1 beyin RFUs - SHAM beyin RFUs 154-22,5 = 131.5 =
      2. GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs 38305-27 = 38278 =
      3. Beyin ağırlığı (g) 0.195 =
      4. Serum hacmi (ml) 0,02 =
      5. Beyin geçirgenliği dizin (10^-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) 0.352 =
         Not: Mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir değerler geçirgenliği dizin hesaplamalar verim. Bunlar ancak 2 grup ¹²arasında karşılaştırma kolaylığı için oranları olarak sunulabilir. Bu her iki grupta her hayvan PI 1 henüz kontrol grubunda Inter hayvan varyasyon tutmak ile kontrol grubu ortalama sürüş kontrol grubunun ortalama PI ile bölerek elde edilebilir. Bu dönüşüm kontrol grubu 1'e ayarlayın göre deney grubu (veya grup) için değerler sağlar.
4. Ayirt görsel izleyici olarak
   1. Yerli bir cryostat ilgili bölümlerde-20 ° C ayarla ve oda sıcaklığında yerleştirilen slaytlara bölümleri transfer 10 µm içine doku-tek bileşik (O.C.T) (Adım 2.1) gömülü böbrek/hemi-beyin blok kesme. Bir kez bölümleri (yaklaşık 30 dk) kurutulur, slaytlar kadar kullanmak-80 ° C buzluğa aktarın.
   2. Gününde, boyama slaytlar için 10 dk. 37 ° C'de erimek ve bölümleri için PBS hızlı yıkama ardından oda sıcaklığında 10 dk %4 paraformaladehyde (PFA) ile düzeltin.
   3. Permeabilization/engelleme arabellek % 1 BSA ve oda sıcaklığında 1 h için % 0,5 Triton X-100 pH 7.5 içeren steril PBS yapılmış bölümlerde kuluçkaya.
   4. Slaytlar, oda sıcaklığında CD31 birincil antikor ile 1,5 saat için kuluçkaya (0,5 mg/ml, MEC 13,3 klonu), 1: 100 steril PBS, % 0.5 BSA, %0.25 içeren arabellekte PBS üç 5 dk yıkar ardından Triton X-100 (pH 7.2) seyreltilmiş.
   5. İkincil antikor kuluçka species-specific ile oda sıcaklığında 1 h için yukarıdaki arabellek fluorescently antikorlar seyreltilmiş 1:500 (2 mg/mL) etiketli gerçekleştirin. CD31 için keçi Anti-sıçan Alexa 568 veya Alexa 488 1:500 bir seyreltme kullanılabilir. DAPI içerir (300 µM) ikincil antikor (1:1, 000 seyreltme stoktan) çekirdeği için leke karıştırın.
   6. Aqua polymount lekeli bölümlerle dağ ve gece karanlıkta oda sıcaklığında polimerizasyon için bırakın.
   7. Spektral görüntüleme confocal lazer mikroskop sistem tarama kullanarak görüntüleri elde etmek. Görüntüleri NIS elements yazılımı (version 4.3) tarafından analiz. Yazılım Photoshop gibi montaj şekiller oluşturmak için kullanılabilir.

Sonuçlar

Biz son zamanlarda angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) fareler daha yüksek beyin damar geçirgenliği kontrol fareler daha sağlıklı koşullar¹⁰' olduğunu ortaya koymuştur. Felç indüklenen farelerde Ayrıca GOF fareler daha büyük enfarktüsü boyutları ve daha büyük geçirgenliği kontrol littermates daha vardı gösterir oldu. Bu sonuçlar geçirgenliği BBB, Ang-2 kritik bir rol gösterir. Protokol bu nedenle GOF fareler kullanılmaktadır...

Tartışmalar

Kan - beyin bariyerini disfonksiyon birincil ve ikincil Beyin Tümörleri veya felç gibi nörolojik bozukluklar, bir dizi ile ilişkilidir. BBB arıza kez hayati CNS ödem ile ilişkilidir. Bu nedenle açılış tetik moleküler mekanizmaları aydınlatma veya BBB kapatılması tedavi önemini nörolojik bozukluklar ve yaygın araştırmacılar tarafından araştırıldı. Ancak, yöntemleri araştırmak için BBB geçirgenliği vivo literatürde bildirilen Floresans görüntüleri¹⁷

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R