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摘要

在这里, 我们提出了一个小鼠心脏特异基因操作的协议。在麻醉下, 小鼠心脏通过第四肋间空间被外部化。随后, 将特定基因的腺病毒注射进心肌, 然后通过体内成像和西方印迹分析对蛋白质表达进行测量。

摘要

特别是在心脏的基因操作明显事实心脏疾病 pathomechanisms 的调查和他们的治疗潜力。体内心脏特异基因的传递通常是通过系统性或局部分娩来实现的。应用重组腺相关病毒 9 (AAV9), 采用尾静脉全身注射治疗心脏基因表达简便、有效。然而, 这种方法需要较高的载体, 有效传导, 并可能导致 nontarget 器官基因转导。在这里, 我们描述了一个简单的, 有效的, 节省时间的方法, 心肌注射液的体内心脏特异基因操作的小鼠。在麻醉 (没有通气) 下, 胸部主要和次要肌肉被坦率地解剖, 并且小鼠心脏通过手工外在化快速地暴露通过小切口在第四肋间空间。随后, 腺病毒的编码荧光素酶 (卢克) 和维生素 D 受体 (vdr), 或短发夹 RNA (shRNA) 靶向 VDR, 注射了汉密尔顿注射器进入心肌。随后的体内成像表明, 荧光素酶成功地抗原心脏。此外, 西方印迹分析证实了成功的过度表达或沉默的 VDR 在小鼠心脏。一旦掌握, 这种技术可以用于基因操作, 以及注射细胞或其他材料, 如磁性在鼠标心脏。

引言

心脏病是全球发病率和死亡率的主要原因1,2。缺乏有效的治疗策略, 包括心肌梗死和心力衰竭等危及生命的心脏疾病, 吸引了对基础 pathomechanisms 的深入探索, 并确定了新的治疗方案3。对于这些科学探索, 心脏特异基因操作被广泛使用4,5。心脏基因操纵可以通过基因组编辑使用强大的转录激活器样效应核酸酶 (塔伦) 和聚集定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 工具, 或通过交付异位基因材料 (例如, 携带感兴趣的蛋白质编码基因的病毒载体)6。虽然基因组编辑允许精确和时空基因组修改的活鼠, 它仍然是一个耗时和劳动密集型的做法6。或者, 由病毒载体或小干扰 RNA (siRNA) 复杂传递的心脏特异基因操作通常执行6。

病毒载体传递到成年鼠心脏是通过大致两个策略: 系统性或局部注射。系统性注射 cardiotropic 血清自动增值服务如 AAV9 是无创性的心脏特异基因操作7。然而, 这种方法需要一个相对较高的载体, 以有效的传导和基因表达, 并可能导致显着转导的 nontarget 器官, 如肌肉和肝脏的7。局部病毒注射是通过心肌注射或冠状动脉内传递7实现的。与心肌注射液相比, 冠状动脉内分娩可导致心脏内更均匀的病毒分布。然而, 这一技术的缺点是快速洗出的病毒载体的系统循环和转导的 nontarget 器官8, 以及它的要求设备的压力测量在操作过程中。相比之下, 心肌注射液能使心肌中的病毒保留更好, 以及特定部位的分娩, 但它无法均匀分布病毒载体7。对小动物来说, 冠状动脉内分娩在技术上很难执行, 而系统性 AAV9 注射和心肌注射则更常用4,5,7。虽然全身注射是容易执行, 常规心肌注射需要机械通气和开胸, 造成广泛的组织损伤, 是费时。

在本报告中, 我们描述了一种简单、节省时间和高效的心肌注射方法。注射荧光素酶和 vdr 的腺病毒, 或 shRNA 靶向 vdr, 被注入以操纵心脏基因表达。一旦掌握, 这种方法可以用于基因操作, 以及注射细胞或其他材料的老鼠心脏。

研究方案

所有动物实验都是根据国家卫生研究院关于使用实验动物的指导方针进行的, 并得到了研究所动物伦理委员会的批准。所有的实验都使用雄性 C57BL/6J 小鼠 (8-10 周龄)。小鼠被安置了在无病原体条件下24°c 4 °c, 在 12 h 光/黑暗周期, 与自由获得水和食物。

1. 腺病毒溶液的制备

  1. 纯化腺病毒溶液到达后, 将溶液贮存在-80 摄氏度的冷冻机中。
    注: 腺病毒注射液是在存活的小鼠体内进行的。为确保腺病毒载体的不育, 制备并纯化了9、10的腺病毒 (荧光素酶、vdr 或 shRNA 靶向 vdr)。
  2. 在手术当天, 从-80 °c 冰箱取出纯化的腺病毒溶液 (3 x 1010斑块形成单元 [pfu]/毫升), 并在冰上解冻腺病毒载体溶液。
  3. 戴上面罩、消毒手套和无菌长袍。
  4. 准备一支50µL 的哈密尔顿注射器, 在手术前一天就被消毒了。
    注: 为杀菌, 哈密尔顿注射器包裹在纱布和放置在高温/高压灭菌器。选择 "固体灭菌" 模式, 按 "启动" 按钮开始灭菌。
  5. 纯化腺病毒溶液完全解冻后, 用75% 乙醇喷洒含有腺病毒溶液的管, 将腺病毒溶液移入层流无菌罩中。
  6. 在层流无菌罩, 吸入50µL 腺病毒溶液使用哈密尔顿注射器没有针, 其次是附着30克针的汉密尔顿注射器。
  7. 按住注射器与30克针向上, 并轻轻推注射器的柱塞, 直到针充满腺病毒溶液 (确认由第一溶液的外观下降从针尖)。
    注: 用大约45µL 溶液填充30克针, 所以现在几乎没有解决方案是可见的注射器。
  8. 使用上述准备好的注射器, 仔细吸入另30µL 腺病毒溶液, 并将松散的上限注射器放在冰上供以后使用。

2. 麻醉和手术准备

  1. 在异氟醚蒸发器中加入20毫升异氟醚, 并将异氟醚蒸发器与氧气罐连接。
  2. 打开阀门, 让氧气从氧气罐流向异氟醚蒸发器。通过在异氟醚蒸发器中的氧气流量监测器, 保持2升/分的氧气流量。
  3. 用4% 异氟醚在100% 氧 (2 升/分) 中诱导麻醉, 在与异氟醚蒸发器相连的塑料笼中2分钟。
  4. 从塑料笼中取出麻醉鼠标, 并将其固定在层流消毒罩中俯卧位置的塑料平台上, 并通过鼻锥在100% 氧 (2 升/分) 内保持麻醉, 2% 异氟醚。
  5. 确认足够的麻醉, 没有脚趾捏反应。
  6. 将无菌眼霜应用于每只眼睛, 以保护角膜不受干燥。
  7. 剃掉胸部和上腹部。将商业上可用的脱毛膏涂抹在剃须的地方1分钟. 去除脱毛霜和剩余的毛皮与湿纱布。
  8. 用3的碘洗必泰消毒 (如 entoiodine) 消毒手术部位 (左下半部分)。用不育的褶皱覆盖手术部位。

3. 心肌注射腺病毒在小鼠心脏中的研究

  1. 脱下手套, 戴上一双新的无菌手套。
  2. 消毒钳, 微型蚊子止血, 一对手术剪刀, 和一个针持有人在运行前的高温/高压灭菌器 (见步骤1.4 注意)。
  3. 沿着连接剑突和腋窝的线做一个0.5 厘米的皮肤切口。用镊子和微蚊止血直接解剖胸主和胸肌小肌肉。
  4. 通过缩回胸主和胸小肌肉来暴露肋间空间。刺穿并打开第四肋间空间 (或观察最宽的肋骨空间) 与微蚊子止血。
  5. 将心脏推向切口, 用非显性手的食指轻轻按压胸壁右侧, 将心脏外侧。
  6. 用非显性手的食指和拇指轻轻地保护外在的心脏。
  7. 通过用占主导地位的腺病毒 (图 1C) 填充的哈密尔顿注射器, 将30µL 腺病毒溶液注入三个部位 (腹侧、背部和左心室侧壁) 的左心室心肌。
  8. 注射完成后, 立即将心脏放回胸腔内。
  9. 通过轻轻按压胸壁向皮肤切口部位, 手动疏散胸腔内的空气。
    注: 成功的空气疏散可以通过拍打的胸部少校和胸小肌肉造成的驱逐空气证明。
  10. 用5-0 丝缝线缝合的水平床垫缝合皮肤。
    注: 胸部少校和胸小肌不应缝合, 因为他们只是坦率地解剖和他们的解剖结构是完整的整个手术。

4. 术后管理

  1. 每日两次通过皮下注射来管理丁丙诺啡 (3 毫克/千克), 以减少手术后48小时的术后疼痛11。
  2. 手术后, 立即将小鼠保持在热垫上 (37 摄氏度), 直到完全恢复。将鼠标放回笼子后, 它完全恢复。
  3. 在高温/高压灭菌器中杀菌使用的哈密尔顿注射器和30克注射器 (见步骤1.4 注)。在锋利的容器里收集消毒的30克注射器针。

5.体内成像测量心脏荧光素酶表达的方法

  1. 在5天的腺病毒注射后, 准备一个新的库存溶液的荧光素在15毫克/毫升在 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)。通过0.2 µm 过滤器筛选解决方案。
  2. peritoneally 内注射荧光素溶液150毫克/千克体重的醒鼠。
  3. 打开成像系统。
  4. 成像系统自动自检后, 选择成像模式为 "发光", 并进行以下设置: 曝光: 自动;Binning: 8;FStop: 1;励磁: 块;发射: 打开。
  5. 在荧光素注射液后10分钟, 用水合氯醛注射液麻醉小鼠 (300 毫克/千克体重)。确认足够的麻醉, 没有脚趾捏反应。
  6. 将麻醉小鼠固定在俯卧部位的热成像台上, 将胸部对准摄像机。
  7. 收集图像 (每只鼠标1图像), 并通过绘制相同的圆形测量区域 (ROI) 来量化信号的强度。
  8. 在采集图像后, 牺牲小鼠并收集以下部分所述的组织。

6. 收获组织

  1. 在病毒注射后的不同时间点 (图 1B), 麻醉小鼠与4% 异氟醚, 并通过鼻锥维持麻醉与2% 异氟醚, 并确保它在一个塑料平台上的俯卧位。
  2. 在前颈部进行中线腹侧切口。通过缩回肩胛舌骨和胸锁乳突肌来暴露右颈总动脉。
  3. 通过 transecting 正确的颈总动脉和排泄血液来牺牲老鼠。
  4. 在腹部做一个中线腹侧切口。沿锁骨中线线切开肋笼两侧的肋骨, 并横断面膜片。
  5. 举起剑突, 露出心脏。找到升主动脉, 轻轻地去除周围脂肪组织。
  6. Cannulate 主动脉和 retrogradely 灌注心脏与一个30克针连接到1毫升注射器填充0.5 毫升4°c 磷酸盐缓冲液 (PBS)。
  7. 灌注后, 将心脏切除, 并将其分为左、右心室。切除肝脏、肺和脾脏。
  8. 两次洗涤后, 冷 PBS (4 °c), 存储所有收集的组织分别在低温瓶中液氮。

7. 蛋白质表达的测定

  1. 将蛋白酶抑制剂鸡尾酒加入到商业上可用的裂解缓冲液中, 以1:100 的比例制备均匀化缓冲剂。根据要处理的样本数计算总体积。将准备好的均匀缓冲保持在4摄氏度, 以供后续使用。
  2. 从液氮罐中取出组织。在高精度鳞片上对组织进行称量 (每片组织大约60毫克)。
  3. 将组织转移到一个新的1.5 毫升离心管。立即加入200µL 均匀缓冲和预换热器1.5 毫米钢球 (4 °c) 到离心管。
  4. 将预换热器 (4 °c) 金属夹中的离心管固定在自动组织磨床上, 并以下列设置启动机器, 开始均匀化: 频率:70 赫兹;时间: 120s。
  5. 均匀化后, 离心匀浆 (1.6万 x 克, 4 °c), 并小心转移到上清到一个新的1.5 毫升管与100µL 吸管。
  6. 添加负载缓冲液 (5x) 到蛋白上清的比例为 1:4, 并变性蛋白质在100°c 5 分钟。
  7. 在心脏和其他器官组织的蛋白质表达水平进一步监测的西方污点分析 (代表性的结果显示在图 2C和图 3) 根据协议, 先前描述的12。

结果

实验协议和报告方法的一些关键步骤显示在图 1中。5天后, 在心肌注射腺病毒荧光素酶 (), 在体内成像在对卢克注射小鼠表明, 显着的强力表达的荧光素酶特别在心脏 (图2A, B), 这是由西方印迹分析 (图 2C) 证实, 表明没有 nontarget 器官转导。相比之下, 在控制小鼠中没有发现荧光素酶表达。...

讨论

本报告展示了一种改进的方法, 心肌注射病毒载体的心脏基因操作, 这是修改了从心肌梗死的方法诱导的高等。13当前,在体内对特定基因功能的刻画最常涉及产生挖空或转基因小鼠3,14,15,16,17, 这是昂贵的、耗时的和劳力密集型的。或者, 通过系?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到国家杰出青年学者基金会 (81625002)、中国国家自然科学基金 (81470389、81270282、81601238) 的支持, 上海市学术研究领导 (18XD1402400) 项目教育统筹委员会高峰临床医学资助 (20152209), 上海中药肾康医院发展中心 (16CR3034A), 上海交通大学 (YG2013MS42), 上海交通大学医学院 (15ZH1003 和 14XJ10019),上海航海项目 (18YF1413000) 和蚌埠医学院研究生创新项目 (Byycx1722)。我们感谢乌尔博士以前在我们实验室的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipments
Laminar flow sterile hoodFengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)FS-CJ-2F
CentrifugeThermo Scientific (Waltham, USA)75005282
Tissue grinding machineScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizerHirayama (Saitama, Japan)HVE-50
Isoflurane vaporizer Matrix (Orchard Park, USA)VIP3000
IVIS  Lumina III imaging systemPerkinElmer (Waltham, USA)CLS136334
Precision balanceSartorius (Göttingen, Germany)28091873
Instruments 
Eppendorf pipette (100 µL)Eppendorf (Westbury, USA) 4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)Eppendorf (Westbury, USA) 4920000113
ForcepsShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. JD4020Curved tip
Hamilton syringeHamilton (Nevada, USA)80501Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostatF.S.T (Foster City, USA)13011-12Curved, tip width 1.3mm
Needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)J32110
Surgical scissorsF.S.T (Foster City, USA)14002-12
1-mL SyringeWeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibodyCST (Danvers,  USA)#2118
Anti-Luciferase antibodyAbcam (Cambridge, UK)ab187340
Anti-rabbit IgGCST (Danvers,  USA) #7074
Anti-VDR antibodyAbcam (Cambridge, UK) ab109234
BuprenorphineThermo Scientific (Waltham, USA)PA175056
Chloralic hydrasLingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic VialsThermo Scientific (Waltham, USA)3754181.8 mL 
Depilatory creamVeet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline Gibco (Grand Island,  USA)14040133
EntoiodineLiKang (Shanghai, China)310132
EP tubeSarstedt (Newton, USA)PCR001
FilterMillipore (Bedford, USA)Pore size 0.2 µm 
IsofluraneYipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
LuciferinPromega (Madison, USA)P1041
Lysis buffer for western  blotBeyotime (Shanghai, China)P0013JWithout inhibitors
Ophthalmic creamApex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBSGibco (Grand Island,  USA)10010023
Protease inhibitor cocktailThermo Scientific (Waltham, USA)78438
5-0 silk sutureShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ballScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Width 1.5 mm
Syringe needleKindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)30 gauge 
Warm matWarmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )NF-GNCW

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