Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Abstract

Manipolazione del gene specificamente nel cuore potenziare significativamente l'inchiesta di malattia cardiaca pathomechanisms e loro potenziale terapeutico. In vivo consegna specifico gene comunemente viene ottenuta tramite consegna o sistemica o locale. Iniezione sistemica tramite vena caudale è facile ed efficiente nel manipolare l'espressione genica cardiaca utilizzando virus adeno-associato ricombinante 9 (AAV9). Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente elevata di vettore per la trasduzione efficiente e può provocare la trasduzione del gene di organo del nontarget. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e risparmio di tempo di iniezione intramiocardica per in vivo manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia (senza ventilazione), senza mezzi termini sono stati sezionati i muscoli pettorali maggiori e minori, e il cuore del topo è stato rapidamente esposti dal manuale esternalizzazione attraverso una piccola incisione presso il quarto spazio intercostale. Successivamente, l'adenovirus codifica luciferasi (Luc) e del recettore della vitamina D (VDR) o short hairpin RNA (shRNA) VDR, il targeting è stato iniettato con una siringa Hamilton nel miocardio. Successivi in vivo imaging ha dimostrato che quel luciferase era correttamente overexpressed in particolare nel cuore. Inoltre, l'analisi Western blot ha confermato la sovraespressione di successo o silenziamento di VDR nel cuore del mouse. Una volta imparato, questa tecnica può essere utilizzata per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali quali nanogel nel cuore del mouse.

Introduzione

La malattia cardiaca è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo^1,2. La mancanza di strategie terapeutiche efficaci per circostanze life-threatening di cuore compreso l'infarto miocardico e insufficienza cardiaca attira intensa esplorazione di pathomechanisms sottostante e l'identificazione di nuove opzioni terapeutiche³. Per queste esplorazioni scientifiche, manipolazione del gene specifico è ampiamente usato^4,5. Manipolazione del gene cardiaco può essere ottenuta utilizzando la nucleasi di attivatore-come effettore potente trascrizione (TALEN) l'editing genomico e cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) strumenti, o di consegna del materiale genetico ectopici (ad es., vettori del virus portatori di geni che codificano per le proteine di interesse)⁶. Se l'editing genomico permette modifiche precise e spaziotemporali genoma in topi vivi, è ancora una pratica molto tempo e laborioso⁶. In alternativa, la manipolazione del gene specifico di vettore del virus o interferire piccolo consegna complesso RNA (siRNA) sono regolarmente eseguita⁶.

Consegna di vettore di virus nel cuore di topo adulto è raggiunto da circa due strategie: iniezione sistemica o locale. Iniezione sistemica di cardiotropi sierotipo di adenoassociati come AAV9 è non invadente per gene specifico cardiaco manipolazione⁷. Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente alta di vettore necessarie per trasduzione efficiente e l'espressione genica e può provocare significative trasduzione del nontarget organi quali il muscolo e fegato⁷. Iniezione di virus locale avviene mediante iniezione intramiocardica o intracoronary consegna⁷. Consegna intracoronary conduce ad una distribuzione più uniforme del virus all'interno del cuore rispetto all'iniezione intramiocardica. Tuttavia, gli svantaggi di questa tecnica sono il lavaggio rapido fuori di vettori virali per la circolazione sistemica e la trasduzione in organi del nontarget⁸e relativo requisito di dispositivi per la misurazione della pressione durante il funzionamento. Al contrario, consente di iniezione intramiocardica migliore ritenzione del virus nel miocardio nonché consegna sito specifico, ma non riesce a distribuire uniformemente virale vettore⁷. Piccoli animali, consegna intracoronary è tecnicamente difficile da eseguire, mentre sistemica AAV9 iniezione e iniezione intramiocardica sono più comunemente praticato^4,5,7. Anche se iniezione sistemica è facile da eseguire, iniezione intramiocardica convenzionali richiede la toracotomia e la ventilazione meccanica, provoca vasto danno di tessuto e richiede tempo.

In questo rapporto, abbiamo descritto un metodo facile, risparmio di tempo e altamente efficiente per iniezione intramiocardica. L'adenovirus codifica luciferasi e VDR o shRNA VDR, il targeting è stato iniettato per modificare l'espressione genica cardiaco. Una volta imparato, questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali nel cuore del mouse.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Istituto. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschii di C57BL/6J (8-10 settimane di età). Topi sono stati alloggiati in condizioni esenti da patogeni a 24 ° C ± 4 ° C, con un ciclo luce/buio di 12 h, con libero accesso all'acqua e cibo.

1. preparazione della soluzione di Adenovirus

1. All'arrivo della soluzione purificata dell'adenovirus, conservare la soluzione in un congelatore a-80 ° C.
   Nota: L'iniezione dell'adenovirus è stato effettuato in topi praticabili. Per garantire la sterilità del vettore dell'adenovirus, l'adenovirus (codifica luciferasi, VDR o shRNA targeting VDR) sono stati preparati e purificato commercialmente^9,10.
2. Il giorno di apertura, estrarre la soluzione purificata dell'adenovirus (3 x 10¹⁰ placca formando unità [pfu] /mL) dal congelatore-80 ° C e scongelare l'adenovirus vettore soluzione sul ghiaccio.
3. Mettere su una maschera facciale, guanti sterili e abito sterile.
4. Preparare un 50-µ l siringa Hamilton che è stato sterilizzato il giorno prima dell'operazione.
   Nota: Per la sterilizzazione, la siringa Hamilton era avvolto in una garza e disposto in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto. È stata selezionata la modalità di "Sterilizzazione per il solido" e sterilizzazione è stato avviato premendo il pulsante "start".
5. Dopo lo scongelamento completo della soluzione purificata dell'adenovirus, spruzzare nella provetta contenente la soluzione dell'adenovirus con 75% di etanolo e spostare la soluzione dell'adenovirus in cappa sterile a flusso laminare.
6. In una cappa a flusso laminare sterile, aspirare 50 µ l di soluzione dell'adenovirus utilizzando la siringa senza ago, seguita da pignoramento di un ago 30g alla siringa Hamilton Hamilton.
7. Tenere la siringa con l'ago 30g verso l'alto e spingere delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando l'ago è riempito con la soluzione dell'adenovirus (confermato dalla comparsa delle prime gocce di soluzione dalla punta dell'ago).
   Nota: Ci vogliono circa 45 µ l di soluzione per riempire l'ago 30g, così ora quasi nessuna soluzione è visibile nella siringa.
8. Utilizzare la siringa preparata sopra per aspirare accuratamente un altro 30 µ l di soluzione di adenovirus e mettere la siringa senza bloccare con un massimo di sul ghiaccio per un utilizzo successivo.

2. l'anestesia e la preparazione operativa

1. Aggiungere 20 mL isoflurano in un vaporizzatore di isoflurano e connettersi il vaporizzatore di isoflurane una bombola d'ossigeno.
2. Aprire il rubinetto e lasciare che l'ossigeno flusso dal serbatoio di ossigeno per il vaporizzatore di isoflurane. Mantenere il tasso di flusso di ossigeno a 2 L/min tramite un monitor di flusso di ossigeno nel vaporizzatore isoflurano.
3. Indurre l'anestesia del mouse con isoflurano 4% a 100% di ossigeno (2 L/min) per 2 min in una gabbia di plastica collegata al vaporizzatore di isoflurane.
4. Estrarre il mouse anestetizzato dalla gabbia in plastica e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona in cappa sterile a flusso laminare e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% a 100% di ossigeno (2 L/min) tramite un cono di naso.
5. Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.
6. Applicare la crema oftalmica sterile per ogni occhio per proteggere le cornee da essiccazione.
7. Radere il torace e l'addome superiore. Applicare la crema depilatoria commercialmente disponibile al sito rasato per 1 min, rimuovere la crema depilatoria e restanti pelliccia con garze bagnate.
8. Sterilizzare il sito chirurgico (parte inferiore sinistra del torace) con 3 scrub di iodio-clorexidina basata antisettico (ad es. entoiodine). Coprire il sito chirurgico con un telo sterile.

3. intramiocardico iniezione dell'Adenovirus nel cuore del topo

1. Togliere i guanti e mettere su un nuovo paio di guanti sterili.
2. Sterilizzare il forcipe, un emostato micro-zanzara, un paio di forbici chirurgiche, e un porta-aghi il giorno prima dell'operazione in un'alta temperatura/alta pressione Sterilizzatore (vedi passo 1.4 Nota).
3. Fare un'incisione della pelle 0,5 centimetri lungo la linea che collega il xifoideo e del axilla. Senza mezzi termini di sezionare le pettorali grandi e minori pettorali con pinze e una pinza emostatica micro-zanzara.
4. Esporre gli spazi intercostali ritraendo le pettorali grandi e minori pettorali. Perforare e aprire il quarto spazio intercostale (o il più ampio spazio intercostale di osservazione) con una pinza emostatica micro-zanzara.
5. Spingere il cuore verso l'incisione di esternare il cuore con il dito indice della mano non dominante premendo delicatamente contro il lato destro della parete di cassa.
6. Dolcemente fissare il cuore esternalizzato con il dito indice e il pollice della mano non dominante.
7. Iniettare un totale di 30 µ l di soluzione di adenovirus nel miocardio del ventricolo sinistro in tre siti (parete ventrale, dorsale e laterale del ventricolo sinistro) tramite la siringa Hamilton riempita con adenovirus (Figura 1) con la mano dominante.
8. Dopo il completamento dell'iniezione, posizionare immediatamente il cuore nuovamente dentro lo spazio intratoracico.
9. Manualmente è possibile evacuare l'aria nello spazio intratoracico premendo delicatamente la parete toracica verso il sito di incisione della pelle.
   Nota: Evacuazione di aria riuscita può essere evidenziato da sbattimento dei pettorali grandi e minori pettorali causate da aria espulsa.
10. Chiudere la pelle da sutura orizzontale materasso con una sutura in seta 5-0.
    Nota: Le pettorali grandi e minori pettorali devono non essere suturati, perché essi sono solo senza mezzi termini dissecati e loro strutture anatomiche sono intatte nel corso dell'operazione.

4. postoperatorio Management

1. Amministrare buprenorfina (3 mg/kg) due volte al giorno tramite iniezione sottocutanea per ridurre il dolore post-operatorio per le prime 48 h dopo l'operazione¹¹.
2. Dopo l'operazione, immediatamente mantenere i topi su una piastra di calore (37 ° C) fino a che completamente ha recuperato. Posizionare il mouse indietro alla gabbia dopo recupera completamente.
3. Sterilizzare l'usate Hamilton siringa e l'ago della siringa 30 G in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto (vedere la nota di passaggio 1.4). Raccogliere l'ago della siringa sterile 30 G in un contenitore di sharps.

5. in Vivo Imaging per la misurazione cardiaca Luciferase espressione

1. Il giorno 5 dopo l'iniezione dell'adenovirus, preparare una soluzione stock fresca di luciferina a 15 mg/mL in soluzione salina tamponato fosfato di Dulbecco (DPBS). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 µm.
2. Intra-peritoneally iniettare i topi svegli con la soluzione di luciferina a 150 mg/kg di peso corporeo.
3. Accendere il sistema di imaging.
4. Dopo automatico auto-test del sistema di imaging, selezionare la modalità di imaging come "Luminescente" e definire le seguenti impostazioni: esposizione: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Eccitazione: Blocco; Emissione: aperta.
5. A 10 min dopo l'iniezione di luciferina, anestetizzare i topi iniettando cloralio idrato (300 mg/kg di peso corporeo). Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.
6. Fissare i topi anestetizzati su un piatto riscaldato imaging in posizione prona, con il petto diretto verso la macchina fotografica.
7. Raccogliere immagini (1 immagine per ogni mouse) e quantificare l'intensità dei segnali dal disegno di regioni di identica misura circolare di interesse (ROI) intorno al petto.
8. Dopo la raccolta di immagini, sacrificare i topi e raccogliere i tessuti come accennato nella sezione seguente.

6. raccolta di tessuti

1. In diversi momenti dopo l'iniezione di virus (Figura 1B), anestetizzare i topi con 4% isoflurane e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% tramite un cono di naso e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona.
2. Fare un'incisione ventrale del midline nel collo anteriore. Esporre l'arteria carotica comune di destra ritraendo i muscoli omohyoid e sternocleidomastoideo.
3. Sacrificare i topi da sezionare l'arteria carotica comune di destra e drenare il sangue.
4. Fare un'incisione ventrale del midline nell'addome. Tagliare le costole da entrambi i lati della gabbia toracica lungo la linea emiclaveare e transetto il diaframma.
5. Esporre il cuore sollevando il xifoideo. Trovare l'aorta ascendente e rimuovere delicatamente il tessuto adiposo perivascolare.
6. Incannulare l'aorta e retrogradely irrorare il cuore con un ago 30g attaccato ad una siringa da 1 mL riempita con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 ° C.
7. Dopo aspersione, asportare il cuore e dividerlo nei ventricoli destro e sinistro. Asportare il fegato, il polmone e la milza.
8. Dopo due lavaggi in PBS freddo (4 ° C), memorizzare tutti i tessuti raccolti separatamente in flaconcini criogenici in azoto liquido.

7. determinazione dell'espressione della proteina

1. Preparare il tampone di omogeneizzazione aggiungendo cocktail inibitore della proteasi nel tampone di lisi commercialmente disponibili ad un rapporto di 1: 100. Calcola il volume totale in base al numero di campioni da elaborare. Mantenere il buffer di omogeneizzazione preparati a 4 ° C per un uso successivo.
2. Estrarre i tessuti dal serbatoio di azoto liquido. Pesare il tessuto sulle scale di alta precisione (circa 60 mg per ogni pezzo di tessuto).
3. Trasferire il tessuto ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Immediatamente aggiungere 200 µ l di tampone di omogeneizzazione e preraffreddate sfere d'acciaio di 1,5 mm (4 ° C) nel tubo del microcentrifuge.
4. Fissare i tubi del microcentrifuge preraffreddato (4 ° c) portalampade in metallo in un tessuto automatico macchina per la frantumazione e iniziare omogeneizzazione avviando la macchina con le seguenti impostazioni: frequenza: 70 Hz; tempo: 120 s.
5. Dopo omogeneizzazione, centrifugare l'omogeneizzato (16.000 × g, 4 ° C) e attentamente trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 mL nuova con una pipetta 100 µ l.
6. Aggiungere carico buffer soluzione (5x) alla proteina del surnatante in un rapporto di 1:4 e denaturare la proteina a 100 ° C per 5 min.
7. I livelli di espressione della proteina nel cuore ed altri tessuti dell'organo sono ulteriormente monitorati mediante Western blot (rappresentante risultati sono mostrati in Figura 2 e Figura 3) secondo il protocollo descritto in precedenza¹².

Risultati

Il protocollo di esperimento e alcuni dei passaggi chiavi per il metodo segnalato sono mostrati nella Figura 1. 5 giorni dopo l'iniezione intramiocardica di luciferasi codifica dell'adenovirus (Adv-luc), in vivo imaging in adv-luc iniettato topi indicato robusta sovraespressione di luciferasi specificamente nel cuore (Figura 2A, B), che era confermato da analisi Western blot (Figura ...

Discussione

Il rapporto attuale dimostra una tecnica modificata per iniezione intramiocardica di vettori virali per la manipolazione del gene cardiaco, che è stato modificato da un metodo per l'induzione di infarto miocardico da Gao et al. ¹³ attualmente, in vivo caratterizzazione delle funzioni dei geni specifici più spesso coinvolgono la generazione di Ko o topi transgenici^3,14,15,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Laminar flow sterile hood	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Tissue grinding machine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizer	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane vaporizer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III imaging system	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision balance	Sartorius (Göttingen, Germany)	28091873
Instruments
Eppendorf pipette (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Curved tip
Hamilton syringe	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curved, tip width 1.3mm
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Surgical scissors	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibody	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-rabbit IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralic hydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1.8 mL
Depilatory cream	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP tube	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Pore size 0.2 µm
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysis buffer for western  blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Without inhibitors
Ophthalmic cream	Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 silk suture	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ball	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Width 1.5 mm
Syringe needle	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warm mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW