小肠部分梗阻的小鼠模型

摘要

肠道阻塞是肠道的部分或全部堵塞, 可引起严重的腹痛、恶心、呕吐和防止大便的通过。该方法在小鼠肠道部分 obsructions 的建立是可靠的, 研究的机制, 病理细胞生长和死亡的肠道。

摘要

肠道阻塞, 阻碍或阻断蠕动运动, 可能是由腹部粘连和大多数胃肠道 (胃肠) 疾病, 包括肿瘤生长引起的。然而, 由于肠道障碍而引起的细胞重塑机制被理解得很差。一些动物模型的肠道障碍已经开发, 但鼠标模型是最成本/时间的有效。老鼠模型使用的外科植入肠道部分梗阻 (PO), 如果它没有正确的执行率高死亡率。此外, 如果不使用适当的封锁或不适当放置, 接受 PO 手术的小鼠就无法发育肥大。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 为 PO 手术, 产生可靠和可重复的肠道障碍, 死亡率非常低。该协议利用手术放置的硅胶环包围回肠, 部分阻断消化运动在小肠。部分堵塞使肠道因消化运动停止而扩张。肠道扩张会导致环的口腔侧平滑肌肥大, 逐渐发育超过2周, 直至死亡。手术 PO 鼠标模型提供了一个体内模型, 用于研究肠道细胞的病理变化, 包括平滑肌细胞 (SMC), Cajal (ICC), PDGFRα⁺和神经元细胞在肠道梗阻的发育过程中。

引言

肠道阻塞是小肠或大肠的部分或全部堵塞, 可防止消化的食物、液体和气体通过肠道移动¹。由于梗阻, 堵塞导致肠道壁变厚, 缩小流明²。由于腹部或盆腔手术导致腹部粘连组织形成或胃肠道疾病 (如克罗恩病)、憩、疝、扭转、狭窄、肠套叠, 便秘, 粪便嵌塞, 伪梗阻, 癌症和肿瘤^3,4,5。肠道阻塞在这些情况下经常导致肠道肌的肥大⁶。

PO 的流明诱发肠道扩张, 并增加平滑肌层厚度周围的梗阻, 以响应需要继续功能蠕动^{7,8,9,10, 11,12,13}。开发了肠道动物模型, 研究小鼠的平滑肌肥厚⁷, 大鼠¹⁰, 豚鼠¹¹, 狗¹², 猫¹³ , 持续发展类似的肥厚在肠道肌肉层。

小肠 PO 的老鼠模型是产生和研究肠道障碍的最经济有效的方法在体内。小鼠小肠梗阻是通过使用硅胶环手术放置在回肠周围。在 po 手术后, po 小鼠的细胞数量 (增生) 和肌肉层厚度 (肥厚) 的增加较早,^8,15。SMC 是主要的塑料细胞, 生长在平滑的肌肉层, 以响应肥厚条件¹⁴, 但其他细胞, 如 ICC 和 PDGFRα⁺细胞与 SMC 密切关联, 也填充。我们以前报告说, PO 小鼠在小肠发育肥大, 其中 SMC 被去分化肉瘤成^PDGFRα + 细胞, 高度增生^的7, 15, 16.相反, 在肠道 obsruction 的发育过程中, ICC 在肥厚平滑肌层中退化并丢失了⁷。PO 模型的另一个主要好处是它有能力诱发肠道神经系统的改变和传播神经源性运动模式。小鼠小肠的主要传播神经源性运动模式是迁移马达复合体 (MMC), 这是神经源性的, 不需要 ICC 或电慢波¹⁷。PO 模型可以清楚地了解复合材料和肠神经是如何通过局部梗阻重塑的。

在这里, 我们提出了一个小鼠的肠道 PO 手术的协议使用硅胶环。接受 PO 手术的小鼠在小肠肌中可靠地产生肥大。在肥厚的肌肉内, SMC, ICC, PDGFRα⁺, 神经元细胞被显著重塑。

研究方案

以下议定书已获得内华达大学 (UNR) 动物资源机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 并符合有关使用研究动物的所有机构伦理准则。

1. 动物。

1. 获得成熟 (4-6 周大) 的 C57BL/6 小鼠体重介于20-30 克之间. 在 UNR 动物资源集中的动物设施中, 把实验室老鼠的菌落放在一个中心。

2. 部分梗阻性手术

注意: 手术是在一个专门用于外科手术的房间里进行的。手术前所有的手术器械都是蒸压的。手术室所有人员都应佩戴无菌的手术袍和手套。

1. 手术小鼠的制备
   1. 检查麻醉提供系统, 以确保氧气和异氟醚的供应是足够的程序。打开供应氧气。打开气体流量计, 并将其调整为500-1000 毫升/分钟. 将动物放在感应腔内并封上顶部。
   2. 打开异氟醚蒸发器到 5%, 并监测动物, 直到它成为卧。将麻醉传递系统切换到鼻锥。
   3. 将任何残余气体的感应腔冲洗成氧气, 然后关闭感应腔线, 同时保持鼻锥线打开。
   4. 把动物从房间里取出, 小心地将眼膏放在动物的眼睛上。
   5. 当气体继续流动时, 将鼻锥放在预热的暖垫上。
   6. 将氧气流量改为100-200 毫升/分, 2-3% 异氟醚。如果动物开始移动, gentlyrestrain 的动物与鼻子锥, 直到完全麻醉再次。
   7. 监测过程中的呼吸和反应, 并根据需要调整异氟醚 (2-5%) 的百分比。动物麻醉水平的监测是缺乏脚趾捏反射前手术进行。
   8. 注射止痛药 (丁丙诺啡, 体重1µg/克) 腹腔远离切口部位。
   9. 使用干净的棉签在腹部涂抹脱毛液。让乳液在鼠标上坐3-5 分钟, 然后用纱布和棉签去除头发。重复此步骤, 直到所有的头发已经从鼠标的腹部被删除。
   10. 用纱布和棉签清洁皮肤, 用70% 乙醇。应用 swabsticks 或聚维酮碘溶液清洗腹部。
2. 部分梗阻性手术
   1. 使用 25 x 50 厘米无菌纸, 在手术区中部为 2.5 x 2.5 厘米开口, 将手术部位悬垂。通过在开口和皮肤的边界放置无菌条来保护动物的悬垂性。
   2. 3.0 厘米腹部切口纵向使用15号刀片手术刀, 确保只有皮肤被切割和避免削减到 musculoperitoneal 层在这个时候。
   3. 使用镊子和手术剪刀, 小心地将皮肤从 musculoperitoneal 层分开, 而不会导致任何切口到 musculoperitoneal 层。在层数被充分地分离了 (大约 1 cm x 4 cm) 之后, 辨认 linea 在 musculoperitoneal 层数和切开 ~ 2 cm 沿 linea, 用微钳和剪刀暴露腹腔腔。
   4. 仔细定位并辨认盲肠。用微钳慢慢地从腹腔腔中取出盲肠, 将盲肠和回肠带到不育的褶皱上。立即用0.9% 条无菌盐水浸泡纱布将肠道组织湿润, 并在腹腔外的任何时候保持暴露的组织湿润。
   5. 定位和辨认回肠和近端结肠之间的肠系膜。使切口 (1 厘米) 平行, 并刚好低于回肠, 在肠系膜上, 避免切割任何血管。
   6. 采取蒸压硅胶环 (长度为6毫米, 4 毫米外径, 3.5 毫米内径)。纵向切开打开油管, 用微钳打开环。
   7. 在肠系膜组织的切口上插入开环的一端。将环带到一个完整的圆环形状上, 使一端与另一个接触, 而回肠被环包围。
   8. 确保硅胶环完全围绕回肠, 闭合环与缝合, 并小心地将肠道放回腹腔腔内。
3. 手术关闭
   1. 在 linea 的 musculoperitoneal 层上进行简单的连续缝合, 用可吸收缝线闭合 musculoperitoneal 伤口。缝合完成后, 用0.9% 无菌生理盐水浸泡纱布清洗任何出血。
   2. 要完全闭合伤口, 用单独的尼龙缝合, 对皮肤进行简单的连续缝合。
   3. 两针缝合完成后, 用新的 swabstick 或聚维酮碘清洗伤口。
   4. 腹腔注射抗生素 (庆大霉素, 每只老鼠 150 ul 基于20-30 克体重)。
   5. 完成程序后, 关闭异氟醚蒸发器, 让动物呼吸只有流动的氧气, 直到它开始获得意识。
   6. 一旦动物醒了, 把动物带到一个单独的恢复区, 热支持, 直到完全恢复。

3. 术后观察。

1. 手术完成后, 将动物移到恢复室的孵化器中, 温度和湿度是调节的。观察动物术后每15分钟的第一小时, 然后每30分钟的第二小时, 而动物在孵化器。
2. 一旦规定的观察完成, 移动动物到他们自己的笼子并且每日监视他们为临床征兆痛苦¹⁸, 并且确保手术伤口是正确愈合没有任何并发症的迹象 (开裂) 目前。

结果

部分梗阻 (PO) 手术诱导的一个月大鼠通过放置一个硅胶环周围的回肠附近的回盲括约肌。这枚戒指造成了回肠部分堵塞。假手术 (所以) 也没有一个环上的年龄/性别匹配的老鼠, 这些老鼠没有显示任何类似的症状, 在 PO 老鼠发现。几个小时后, 小鼠很快从 PO 手术中恢复过来。他们在第一个星期内没有表现出明显的行为变化或虚弱, 但在第一周之后, 他们逐渐开始显示出了 PO ?...

讨论

我们表明, 小鼠接受肠道 PO 手术的持续和重现性发展肠平滑肌肥大, 这是模仿人类肠梗阻。为不同的动物开发了肠梗阻手术, 包括老鼠⁷, 老鼠¹⁰, 豚鼠¹¹, 狗¹²和猫¹³。小鼠肠梗阻模型具有时间、成本、大小和表型优势, 优于其他大型动物模型。小鼠或大鼠肥大的发展只需要10-14 天¹⁰, 与豚鼠、狗...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical drape	Medical and veterinary supplies	SMS40	40”X100 yards
Underpad, econ, pro plus	Medical and veterinary supplies	MSC281224	17x24”
Iris scissors	Braintree scientific, Inc	SC-i-130
Iris scissors	Vantage	V95-304
Dumont electronic & jeweler tweezers	Dumont	98-180-3
Braided absorbable suture	Covidien polysorb	SL-5687G	5-0, polyglactin
Nylon non-absorbable mono filament	AD surgical	S-N618R13	6-0, nylon
Surgical blade	Dynarex		No.15
Needle holder	Jacobson microvascular	36-1342TC	8.5 inch
Scalpel handle	Flinn scientific	AB1049
Microsurgical scissor	WPI	503305
Petrolatum ophthalmic ointment	Puralube VET		3.5 g
Fluriso (isoflurane)	Vetone	V1 502017	250 ml
Steri-strip reinforced skin closure	3M	R1547
Surgical gloves	Medline	MSG2270
Ear loop face mask	The safety zone	RS700
Avant gauze non-woven sponges	Caring	PRM25444
Surgical cup	Admiral  craft OYC-2	725-A42	2.5 oz
Swabstick	ChloraPrep	260103	2% w/v Chlorhexidine  Gluconate (CHG) and 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA)
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WC
Buprenorphine	Zoo pharm	BZ8069317	1 mg/ml
Gentamycin sulfate	Vetone	G-6336-04	100 mg/ml
Fast acting gel cream remover	Veet	8111002
Syringe	AHS	AH01T2516	1 ml with needle
Silicon ring	VWR	60985-720	6 mm in length, 4 mm exterior diameter, 3.5 mm interior diameter
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		4-6 weeks old