Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

Zusammenfassung

Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung des Darms, die starke Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, und verhindert den Durchgang von Stuhl verursachen können. Dieses Verfahren zum Erstellen von Darm teilweise Obsructions bei Mäusen ist zuverlässig bei der Untersuchung der Mechanismen, die krankhaften Zellwachstum und Tod im Darm.

Zusammenfassung

Darm Hindernisse, die behindern oder blockieren peristaltische Bewegung, können durch abdominale Adhäsionen und meist gastrointestinale (GI) Krankheiten einschließlich tumoröse Wucherungen entstehen. Jedoch verursacht durch Darm Hindernisse sind kaum erforscht und die zelluläre Mechanismen Umgestaltung beteiligt. Verschiedenen Tiermodellen der Darm Hindernisse wurden entwickelt, aber die Maus-Modell ist das beste Kosten/Zeit wirksam. Die Maus-Modell nutzt die chirurgische Implantation einer teilweisen Darmverschluss (PO), die eine hohe Sterblichkeitsrate hat, wenn es nicht korrekt durchgeführt wird. Darüber hinaus nicht Mäuse erhalten PO Chirurgie Hypertrophie zu entwickeln, wenn eine entsprechende Blockade ist nicht oder nicht richtig platziert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll auf PO-Operation, die zuverlässige und reproduzierbare Darm Hindernisse mit einer sehr niedrigen Sterblichkeit produziert. Dieses Protokoll nutzt einen chirurgisch platzierte Silikon-Ring, der Ileum umgibt die Verdauungs-Bewegung in den Dünndarm teilweise blockiert. Die teilweise Blockade macht den Darm aufgrund der Halt des Verdauungssystems Bewegung erweitert werden. Die Ausdehnung des Darms induziert Hypertrophie der glatten Muskulatur auf der oralen Seite des Ringes, die nach und nach über 2 Wochen bis es Todesursachen entwickelt. Die chirurgische PO-Maus-Modell bietet eine in Vivo Modell der hypertrophen Darmgewebe nützlich für die Untersuchung von krankhafter Veränderungen der Darmzellen einschließlich der glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), PDGFRα⁺, und neuronale Zellen während der Entwicklung von Darmverschluss.

Einleitung

Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung im kleinen oder großen Darm, der verdaute Nahrung, Flüssigkeit und Gas bewegt durch den Darm-¹verhindert. Aufgrund der Obstruktion induziert die Blockade die Darmwände, verdickt werden, Verengung der Lumen-². Darmverschluss kann auftreten durch Abdominal- oder Becken-Operationen, die Abdominal-Adhäsion Gewebeanordnung verursachen oder von GI Störungen wie entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn), Divertikulitis, Hernien, Volvulus, Striktur, Invagination, Verstopfung, fäkale Impaktion, Pseudoobstruktion, Krebs und Tumore^3,4,5. Intestinale Blockaden in diesen Fällen führen oft zu der Hypertrophie der Tunica Muscularis des Darms⁶.

PO des lumens induziert Darm Ausdehnung und glatten Muskulatur Schichtdicke um das Hindernis als Reaktion auf die Notwendigkeit, funktionellen Peristaltik^{7,8,9,10weiter erhöht, 11,12,13}. Tiermodelle der Darm PO wurden entwickelt, um studieren glatten Muskel-Hypertrophie in Mäusen⁷Ratten¹⁰, Meerschweinchen¹¹, Hunde¹²und Katzen¹³ , die konsequent entwickeln ähnliche Hypertrophie innerhalb der intestinale Muskelschichten.

Ein Maus-Modell der Darm PO ist der kostengünstigste Weg zu generieren und Darm Hindernisse in Vivozu untersuchen. Mithilfe von einen Silikonring chirurgisch gelegt Umgebung Ileum sind Dünndarm Hindernisse bei Mäusen durchgeführt. Die PO-Mäuse zeigten frühe Zunahme der Anzahl der Zellen (Hyperplasie) und eine Erhöhung im Muskel Schichtdicke (Hypertrophie) nach PO Chirurgie^8,15. SMC sind die primären Kunststoff Zellen, die innerhalb der glatten Muskulatur Schichten als Reaktion auf die hypertrophe Bedingungen¹⁴wachsen, aber andere Zellen wie ICC und PDGFRα⁺ -Zellen, die mit SMC eng verbunden sind, sind auch neu besiedelt. Wir haben bereits berichtet, dass die PO-Mäuse Hypertrophie im Dünndarm entwickeln, in denen SMC sind entdifferenzierten in PDGFRα⁺ Zellen, die höchst proliferative^7,15,16. Umgekehrt sind ICC verkommen und verloren in den hypertrophierten Glattmuskel-Schichten bei der Entwicklung der intestinalen Obsruction⁷. Ein weiterer großer Vorteil des PO-Modells ist seine Fähigkeit, Veränderungen im enterischen Nervensystem und Vermehrung von neurogenen motorischen Muster zu bewirken. Die große Verbreitung neurogenen motorischen Muster im Dünndarm Maus der migrierenden Motor Komplex (MMC), ist die neurogene und erfordert keine ICC oder elektrische langsame Wellen¹⁷. Das PO-Modell kann klare Einblicke in wie MMCs und enterischen Nerven durch partielle Obstruktion umgebaut werden.

Hier schlagen wir eine murinen Protokoll für Darm PO-Operation mit einem Silikonring. PO-Operation zuverlässig empfangen Mäuse produzieren Hypertrophie in der Tunica Muscularis des Dünndarms. Innerhalb hypertrophe Muskeln sind SMC, ICC, PDGFRα⁺und neuronalen Zellen drastisch umgebaut.

Protokoll

Das folgende Protokoll genehmigt wurde durch die institutionelle Animal Care und verwenden Committee (IACUC) an der Universität von Nevada-Reno (UNR) Tier Ressourcen und erfüllt alle institutionellen ethischen Richtlinien bezüglich der Verwendung von Versuchstieren.

(1) Tiere.

1. Erhalten Sie Reifen (4-6 Wochen alt) C57BL/6 Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20-30 g. Haus der Kolonie von Labormäusen in eine zentralisierte Tierstation am UNR Tier Ressourcen.

(2) partielle Obstruktion Chirurgie

Hinweis: In einem Raum gewidmet chirurgische Eingriffe sind Operationen durchgeführt. Alle chirurgischen Instrumente sind vor der Operation autoklaviert. Sterile OP Kittel und Handschuhe sollten von allen Personal im OP jederzeit getragen werden.

1. Vorbereitung für die OP Maus
   1. Überprüfen Sie die Narkose Delivery-System um die Versorgung mit Sauerstoff zu gewährleisten und Isofluran ist ausreichend für Verfahren. Schalten Sie die Stromversorgung Sauerstoff. Schalten Sie den Gas-Durchflussmesser und passen Sie an, um 500-1000 mL/min Platz das Tier in der Induktion Kammer und verschließen Sie oben.
   2. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane auf 5 %, und überwachen Sie das Tier zu, bis es Liegerad wird. Wechseln Sie die Narkose Liefersystem zu die Bugnase
   3. Spülen der Induktion Handelskammer Restgas mit Sauerstoff, dann schalten Sie die Induktion Kammer Linie unter Beibehaltung der Bugnase Zeile öffnen.
   4. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer zu und legen Sie vorsichtig ophthalmologischen Salbe auf die Augen des Tieres.
   5. Legen Sie die Bugnase auf einen vorgeheizten warm, wenn Gas fließt weiterhin.
   6. Ändern Sie die Sauerstoffzufuhr in 100-200 mL/min, mit 2-3 % Isofluran. Wenn das Tier beginnt zu bewegen, betäubt, Gentlyrestrain das Tier mit der Nase Kegel auf bis zu vollständig wieder.
   7. Überwachung der Atmung und Reaktion auf die Stimulation während des Verfahrens und den Prozentsatz der Isofluran (2-5 %) nach Bedarf anpassen. Tierische Anesthetization Ebene wird durch den Mangel an Zehe Prise Reflex überwacht, bevor Chirurgie durchgeführt wird.
   8. Injizieren Sie Schmerzmittel (Buprenorphin, 1 µg/g Körpergewicht) intraperitoneal Weg von der Einschnitt-Website.
   9. Wenden Sie Haar Entfernung Lotion auf dem Bauch mit einem sauberen Wattestäbchen an. Lassen Sie die Lotion sitzen für 3-5 min auf Maus, dann das Haar mit Gaze und Baumwolle Tupfer entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Haare aus dem Bauch der Maus entfernt wurde.
   10. Reinigen Sie die Haut mit 70 % Ethanol mit Gaze und Baumwolle Tupfer. Gelten Sie Swabsticks oder Povidon-Jod-Lösung um den Bauch zu reinigen.
2. Partielle Obstruktion Chirurgie
   1. Drapieren Sie die Operationsstelle mit sterilen Papier 25 x 50 cm mit einer 2,5 x 2,5 cm Öffnung in der Mitte für den OP-Bereich. Sichern Sie den Faltenwurf des Tieres indem man sterile Streifen an den Rändern der Öffnung und die Haut.
   2. Machen Sie einem ~3.0 cm Bauchschnitt längs mit Nr. 15 Klinge Skalpell, um sicherzustellen, dass nur die Haut eingeschnitten ist und schneiden in der Musculoperitoneal Schicht zu diesem Zeitpunkt zu vermeiden.
   3. Mit Zange und chirurgische Scheren, trennen Sie vorsichtig die Haut von der Musculoperitoneal-Schicht ohne jeden Schnitt, die Musculoperitoneal Schicht. Nachdem die Schichten ausreichend (ca. 1 cm x 4 cm) getrennt wurden, identifizieren die Linea Alba auf der Musculoperitoneal Ebene und Schnitt ~ 2 cm entlang der Linea Alba, die intraperitonealen Hohlraum mit Mikro-Pinzetten und Scheren verfügbar zu machen.
   4. Genau lokalisieren Sie und identifizieren Sie der Blinddarm. Langsam und sanft entfernen der Blinddarm aus dem intraperitoneale Hohlraum mit Mikro-Pinzetten, bringen die proximalen Colon und Ileum mit der Blinddarm außerhalb auf der sterilen Tuch. Sofort befeuchten Sie das Darmgewebe mit 0,9 % sterile Kochsalzlösung getränkten Gaze und halten Sie exponierte Gewebe ständig befeuchtet, während sie sich außerhalb der Bauchhöhle.
   5. Lokalisieren Sie und identifizieren Sie das Mesenterium zwischen Ileum und proximalen Colon. Machen Sie einen Einschnitt (~ 1 cm) in dem Mesenterium parallel, und knapp unterhalb der Krummdarm und vermeiden Sie, schneiden alle Gefäßsystem.
   6. Nehmen Sie einen autoklaviert Silikonring (6 mm in der Länge, 4 mm Außendurchmesser, 3,5 mm Innendurchmesser). Längsrichtung geschnitten Sie, um den Schlauch öffnen und öffnen Sie den Ring mit Mikro-Pinzetten.
   7. Stecken Sie ein Ende des geöffneten Rings durch die Inzision im Mesenterium Gewebe. Eine ausgefüllte Ringform zurückzukehren Sie den Ring bringen ein Ende in Kontakt mit anderen, mit der Krummdarm, umgeben von den Ring.
   8. Sicherzustellen Sie, dass der Silikonring vollständig Ileum umgibt, schließen Sie den Ring mit Naht und legen Sie den Darm vorsichtig zurück in die intraperitoneale Hohlraum.
3. Chirurgie-Schließung
   1. Führen Sie eine einfache kontinuierliche Naht auf der Musculoperitoneal Ebene entlang der Linea Alba, schließen die Musculoperitoneal Wunde mit einer resorbierbaren Naht. Nachdem die Naht abgeschlossen ist, reinigen Sie eine Blutung mit 0,9 % sterile Kochsalzlösung getränkten Gaze.
   2. Um die Wunde mit einer separaten Nylon-Naht vollständig zu schließen führen Sie eine einfache kontinuierliche Naht auf der Haut.
   3. Nachdem beide Fäden abgeschlossen haben, reinigen Sie die Wunde mit neuen Swabstick oder Povidon-Jod.
   4. Intraperitoneale Injektion Antibiotika (Gentamicin, 150 μL pro Maus basierend auf 20-30 g Körpergewicht).
   5. Nach Abschluss des Verfahrens, schalten Sie Verdampfer Isoflurane und lassen das Tier nur fließende atmen Sauerstoff bis es beginnen Bewusstsein zu gewinnen.
   6. Sobald das Tier erwacht ist, legen Sie das Tier in einem separaten Recovery-Bereich mit thermischen Unterstützung bis vollständig erholt.

3. postoperative Beobachtung.

1. Bewegen Sie nach Abschluss der Operation die Tiere in einem Inkubator in einen Aufwachraum wo Temperatur und Feuchtigkeit reguliert. Überwachen Sie die Tiere nach der Operation alle 15 min für die erste Stunde dann alle 30 Minuten für die zweite Stunde, während die Tiere in den Inkubator.
2. Sobald die vorgeschriebene Beobachtung abgeschlossen ist, bewegen Sie die Tiere an ihre eigenen individuellen Käfig und überwachen sie täglich für klinische Indikationen Schmerzen¹⁸, und um sicherzustellen, dass die Operationswunde richtig ohne irgendwelche Anzeichen von Komplikationen (Heilung ist Dehiszenz) vorhanden.

Ergebnisse

Partielle Obstruktion (PO) wurde operativ in einen Monat alt Mäuse induziert, indem man einen Silikonring um Ileum in der Nähe der Ileocecal Schließmuskel. Dieser Ring erstellt eine teilweise Blockade im Ileum. Schein-Operationen (SO) auch ohne Ring auf Alter/Geschlecht durchgeführt wurden abgestimmt Mäuse und diese Mäuse nicht zeigen keine Symptome ähnlich denen in PO Mäuse gefunden. Mäuse erholten sich schnell von der PO-Operation innerhalb weniger Stunden. Sie zeigte keine off...

Diskussion

Wir zeigten, dass Mäuse erhält der Darm PO-Operation konsequent und reproduzierbar intestinalen glatten Muskel-Hypertrophie, entwickeln die menschliche Darmverschluss imitiert. Intestinale Obstruktion Operationen wurden für verschiedene Tiere wie Mäuse⁷, Ratten¹⁰, Meerschweinchen¹¹, Hund¹² und Katzen¹³entwickelt. Die Maus-Modell der Darmverschluss hat Zeit, Kosten, Größe und phänotypischen Vortei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical drape	Medical and veterinary supplies	SMS40	40”X100 yards
Underpad, econ, pro plus	Medical and veterinary supplies	MSC281224	17x24”
Iris scissors	Braintree scientific, Inc	SC-i-130
Iris scissors	Vantage	V95-304
Dumont electronic & jeweler tweezers	Dumont	98-180-3
Braided absorbable suture	Covidien polysorb	SL-5687G	5-0, polyglactin
Nylon non-absorbable mono filament	AD surgical	S-N618R13	6-0, nylon
Surgical blade	Dynarex		No.15
Needle holder	Jacobson microvascular	36-1342TC	8.5 inch
Scalpel handle	Flinn scientific	AB1049
Microsurgical scissor	WPI	503305
Petrolatum ophthalmic ointment	Puralube VET		3.5 g
Fluriso (isoflurane)	Vetone	V1 502017	250 ml
Steri-strip reinforced skin closure	3M	R1547
Surgical gloves	Medline	MSG2270
Ear loop face mask	The safety zone	RS700
Avant gauze non-woven sponges	Caring	PRM25444
Surgical cup	Admiral  craft OYC-2	725-A42	2.5 oz
Swabstick	ChloraPrep	260103	2% w/v Chlorhexidine  Gluconate (CHG) and 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA)
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WC
Buprenorphine	Zoo pharm	BZ8069317	1 mg/ml
Gentamycin sulfate	Vetone	G-6336-04	100 mg/ml
Fast acting gel cream remover	Veet	8111002
Syringe	AHS	AH01T2516	1 ml with needle
Silicon ring	VWR	60985-720	6 mm in length, 4 mm exterior diameter, 3.5 mm interior diameter
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		4-6 weeks old